DE60008368T2

DE60008368T2 - Aus ganzen zellen bestehender krebs-impfstoff, enthaltend ko-kultivierte maligne und nicht-maligne zellen

Info

Publication number: DE60008368T2
Application number: DE60008368T
Authority: DE
Inventors: Peter Smith; Darren Stevenson; Haj Chana; Peter Thraves; Andrew Sutton
Original assignee: Onyvax Ltd
Current assignee: Onyvax Ltd
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2020-05-20
Also published as: JP2003500366A; DE60008368D1; CA2374294A1; KR20020027318A; ES2215662T3; WO2000071155A3; ATE259655T1; EP1178822A2; WO2000071155A2; AU4935600A; EP1178822B1

Description

Zusammenfassung
Es werden neue Impfstoffe zur Verwendung als immunotherapeutische Mittel bei der Behandlung von Krebs beschrieben. Whole-Cell-Impfstoffe der ersten Generation waren auf traditionelle Methodiken in der Kultur und Produktion der autologen oder allogenen Impfstoffe auf Zellbasis angewiesen, wobei autologe Tumorzellen oder immortalisierte allogene Tumorzelllinien unter statischen zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen kultiviert wurden. Die vorliegende Erfindung betrifft eine Co-Kulturtechnik, die zu wesentlichen Verbesserungen des Phänotyps von Zelllinien hin zu einem in-vivo-artigerem Phänotyp führt, was in einem Impfstoff resultiert, der eine realistischere phänotypische Repräsentation eines In-vivo-Tumors reflektiert. Wir beschreiben alternative Kulturtechniken, die ein wesentliches Scale-up sowie Verarbeitungsvorteile bieten und darüber hinaus die Aktivität des Whole-Cell-Impfstoffs erheblich verbessern. Ferner haben die mit den verschiedenen Co-Kulturtechniken hergestellten Impfstoffe gegenüber Einzelzell-Suspensionsimpfstoffen weitere Vorteile in Bezug darauf, wie sie dem Immunsystem präsentiert werden, was zu einer besseren Leistung bei der Behandlung der Krankheit führt.
Hintergrund der Erfindung
In der Technik ist es bekannt, dass kanzeröse Zellen zahlreiche Mutationen, qualitative und quantitative, räumliche und zeitliche, im Vergleich zu ihren nichtmalignen, nichtkanzerösen Gegenstücken enthalten und dass in bestimmten Abschnitten im Laufe des Tumorwachstums und der Ausbreitung ein Teil der kanzerösen Zellen vom Immunsystem des Wirts als anomal erkannt werden kann. Krebszellen exprimieren bestimmte tumorspezifische Antigene (TSA) und tumorassoziierte Antigene (TAA), die als Marker oder Targets für das Immunsystem dienen können. Dies hatte weltweit zahlreiche Forschungsbemühungen hinsichtlich der Entwicklung von Immunotherapien zur Folge, die die Kraft des Immunsystems nutzen und sie auf die Bekämpfung der Krebszellen richten, mit dem Ziel, diese aberranten Zellen wenigstens bis zu einem Grad zu beseitigen, der nicht lebensbedrohend ist (Review in Maraveyas, A. & Dalgleish, A. G. 1977 Active immunotherapy for solid tumours in vaccine design in The Role of Cytokine Networks, Hrsg. Gregoriadis et al., Plenum Press, New York, Seiten 129–145; Morton, D. L. und Ravindranath, M. H. 1996 Current concepts concerning melanoma vaccines in Tumor Immunology – Immunotherapy and Cancer Vaccines, Hrsg. Dalgleish, A. G. and Browning, M., Cambridge University Press, Seiten 241–268. Weitere Einzelheiten sind auch in anderen Dokumenten dieser Publikationen enthalten).
Tumore haben die bemerkenswerte Fähigkeit, dem Immunsystem in vielfältiger Weise entgegenzuwirken, wie zum Beispiel durch: Hinabregulation der Expression potenzieller Targetproteine; Mutation potenzieller Targetproteine; Hinabregulation der Oberflächenexpression von Rezeptoren und anderen Proteinen; Hinabregulation der MHC Klasse I und II Expression, wodurch eine direkte Präsentation von TAA- oder TSA-Peptiden nicht zugelassen wird; Hinabregulation von Costimulationsmolekülen, die zu einer unvollständigen Stimulation von T-Zellen führt, die in Anergie resultiert; Abstoßen von selektiven, nicht repräsentativen Membranteilen, die als Lockmittel für das Immunsystem wirken; Abstoßen selektiver Membranteile, um das Immunsystem zu anergisieren; Sekretion von Inhibitionsmolekülen; Induktion von T-Zelltod; und viele andere. Es ist klar, dass die phänotypische und genetische Heterogenität und Plastizität von Tumoren im Körper in gewissem Maße mit immunotherapeutischen Strategien abgestimmt werden muss, die in ähnlicher Weise Heterogenität oder Mehrwertigkeit beinhalten. Die Verwendung von ganzen Krebszellen oder Rohderivaten davon als Krebsimmunotherapien kann als analog zur Verwendung von ganzen inaktivierten oder abgeschwächten Viren als Impfstoffe gegen Viruserkrankungen angesehen werden. Die potenziellen Vorzüge sind:

(a) ganze Zellen enthalten eine große Auswahl von Antigenen und bieten ein antigenes Profil von ausreichender Heterogenität, um dem der Läsionen wie oben beschrieben zu entsprechen;
(b) durch die Mehrwertigkeit (d. h. multiple Antigene enthaltend) wird das Risiko einer immunologischen Flucht verringert (die Wahrscheinlichkeit, dass Krebszellen durch Mutation alle diese Antigene „verlieren", ist gering); und
(c) Impfstoffe auf Zellbasis beinhalten TSA und TAA, die als solche noch identifiziert werden müssen; es ist möglich, wenn nicht sogar wahrscheinlich, dass derzeit nicht identifizierte Antigene klinisch relevanter sein können als die relativ geringe Zahl von bekannten TSA/TAA.

Impfstoffe auf Zellbasis fallen in zwei Kategorien. Die erste, auf der Basis autologer Zellen, beinhaltet das Entnehmen einer Biopsie von einem Patienten, In-vitro-Kultivieren von Tumorzellen, Modifizieren der Zellen durch Transfektion und/oder andere Mittel, Bestrahlen der Zellen, um sie replikationsunfähig zu machen, und dann das Injizieren der Zellen zurück in denselben Patienten als Impfstoff. Diesem Ansatz wurde zwar im Laufe des vergangenen Jahrzehnts viel Beachtung geschenkt, doch ist es immer offensichtlicher geworden, dass diese individuell zugeschnittene Therapie aus verschiedenen Gründen naturgemäß unpraktisch ist. Der Ansatz ist zeitaufwendig (oft übertrifft die Entwicklungszeit für die Herstellung klinischer Impfstoffdosen die Lebenserwartungen des Patienten), teuer, und anhand des „maßgeschneiderten" Produkts kann kein standardisiertes Produkt spezifiziert werden (nur das Verfahren, nicht das Produkt, kann standardisiert und somit optimiert und qualitätskontrolliert werden). Ferner weist die zur Herstellung des autologen Impfstoffs verwendete Tumorbiopsie bestimmte Wachstumseigenschaften, Interaktionen und Kommunikationen mit umliegendem Gewebe auf, die sie in gewissem Maße einzigartig machen. Dies spielt auf einen potenziell signifikanten Nachteil der Verwendung autologer Zellen für die Immunotherapie an: eine Biopsie, die die Initialzellen liefert, repräsentiert einen immunologischen Schnappschuss des Tumors in der jeweiligen Umgebung, zu dem jeweiligen Zeitpunkt, was als langfristige phänotypische Repräsentation für einen Impfstoff mit anhaltender Aktivität, der während des gesamten Verlaufs der Krankheit verabreicht werden kann, ungeeignet ist.
Der zweite Impfstofftyp auf Zellbasis beinhaltet die Verwendung allogener Zellen, die genetisch (und somit immunologisch) auf die Patienten fehlabgestimmt sind. Allogene Zellen profitieren von den gleichen Vorzügen der Mehrwertigkeit wie autologe Zellen. Darüber hinaus hat dieser Ansatz nicht die Nachteile in Verbindung mit der Entwicklungszeit und den Kosten autologer Ansätze, da allogene Zellimpfstoffe auf immortalisierte Zelllinien gestützt werden können, die unbegrenzt in vitro [sic] kultivierbar sind. Ebenso bietet der allogene Ansatz die Möglichkeit, Kombinationen von Zelltypen zu verwenden, die dem Erkrankungsprofil eines Individuums möglicherweise hinsichtlich Stadium der Krankheit, Ort der Läsion und potenzieller Resistenz gegen andere Therapien entsprechen oder es vorhersehen können.
Bisherige humane klinische Studien unter Anwendung von Whole-Cell-Ansätzen stützten sich auf das Wachstum und die Produktion von Zellen in traditionellen 2D-Kultursystemen – Zellen, die in statischen Kunststoffflaschen in Inkubatoren, mit oder ohne atmosphärische CO₂-Anreicherung, wuchsen (hierin als „2D"-Kultur bezeichnet). Die Zellen wachsen nur in zwei Dimensionen als flache Monolayer oder als Schicht von Zellen, die an dem Kunststoff- oder Glasgefäß anhaften. Das Zellwachstum wird gewöhnlich bei Konfluenz kontaktgehemmt und Versuche, die Zellen über diesen Punkt hinaus wachsen zu lassen, führen gewöhnlich zum Verlust der Kultur. Das Wachstum von Zellen in 2D-Kultur ist auf die serielle Passage von Zellen angewiesen, bei der die Zellen wiederholt vom Nährsubstrat entfernt und einem strengen Zyklus aus Zentrifugation, Wäsche und Manipulation in Suspension ausgesetzt werden. Die Zellen werden wachsen gelassen und dann mit mechanische Mitteln oder eine Behandlung mit Trypsin geerntet, um die Zellen aus dem Nährsubstrat zu entfernen. Die Wirkung von Trypsin, anderen proteolytischen Enzymen oder anderen Agenzien, die für den Zweck verwendet werden, besteht darin, dass die Bindung der Zellen am Flaschensubstrat aufgebrochen wird. Durch eine proteolytische Behandlung werden zwangsläufig einige Proteinmoleküle von der Oberfläche der Zellen entfernt, was in einem Verlust potenzieller Epitope resultieren kann, die den Empfänger dazu befähigen, eine humorale oder zellgestützte Immunantwort auf den Tumor zu erzeugen. Durch die Proteolyse können zum Beispiel MHC-I Moleküle entfernt werden, die Peptide in direkter Weise T-Zellen von Patienten präsentieren könnten, oder Adhäsionsmoleküle, die Costimulationsaktivität zur direkten Präsentation bieten. Alternativ können durch die Proteolyse aberrant exprimierte TAA oder TSA einfach entfernt werden, die, wenn sie über ein Cross-Priming oder einen anderen Weg verarbeitet werden, ebenfalls zu einer Anti-Tumor-Antwort beitragen könnten. Ferner gibt es relativ wenig Gelegenheiten zur Manipulation des Zellphänotyps, da zum Erzielen der notwendigen Zellquantität eine Reihe von Passagen unter standardmäßigen Wachstumsbedingungen erforderlich sind und Versuche, die Zellen in einen gestressten oder apoptotischen oder nekrotischen oder anderweitig geänderten Phänotyp vor der Ernte zu lenken, in erheblichen Verlusten fragiler Zellen bei der Ernte resultieren, wodurch die Möglichkeit der Herstellung eines Impfstoffs in einem praktischen Umfang unterminiert wird.
Die bisher beschriebenen Krebsimpfstoffe auf Zellbasis basieren auf Folgendem: i) Populationen von Primärkulturen autologer Tumorzellen; ii) einzelne Populationen allogener immortalisierter Tumorzelllinien; iii) Kombinationen von drei oder vier allogenen immortalisierten Zelllinien und iv) genetisch modifizierte Fibroblasten in Kombination mit Tumorzellen.
Ein Beispiel für frühere Ansätze wird in der WO/99 19462 beschrieben. Diese Anmeldung offenbart einen Whole-Cell-Krebsimpfstoff, bei dem die malignen Zellen mit anderen nichtmalignen Zellen kultiviert werden. Dies führt zu einem Impfstoff, in dem die nichtmalignen Zellen eine verstärkte Cytokinsekretion und Expression von Costimulationsmolekülen aufweisen, wodurch der Whole-Cell-Impfstoff wirksamer wird.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Kulturverfahren für die Großproduktion von Impfstoffen; die Phänotypeinstellung etablierter Zelllinien; Co-Kulturtechniken; spezifische Zusammensetzungen immortalisierter Tumorzelllinien und immortalisierter nichtmaligner Zellen; Zusammensetzungen, die immortalisierte Tumorzellen und autologe nichtmaligne Zellen umfassen; Verarbeitungsverfahren zur Herstellung der Impfstoffe; analytische Techniken zur Beurteilung der Phänotypeinstellung und neuer Zusammensetzungen, die in Standardmodellen der Tumorprävention und Therapie eine erhöhte Immunogenität aufweisen. Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Erfindung eine neue Strategie, die die Immunantwort nicht nur auf den Tumor selbst, sondern auch auf die lokale Tumorumgebung und die nichtmalignen Zellen, die diese Umgebung darstellen, abzielt.
Beschreibung der Erfindung
Es ist allgemein bekannt, dass die unmittelbare lokale Tumorumgebung äußerst immunsuppressiv ist, wo alle Aspekte der Immunkontrolle gehemmt werden, von der Hemmung der T-Zell- und antigen-präsentierenden Zell-(APC)-Migration bis zur Hemmung der APC-Maturation und Induktion von T-Zell-Anergie. Viele der immunsuppressiven Aktivitäten, die in der unmittelbaren lokalen Tumorumgebung zu finden sind, werden durch lösliche Faktoren vermittelt, die von den Tumorzellen freigesetzt werden, wie IL-10 und TGFβ. In der Literatur gibt es zahlreiche Berichte über die Wirkungen von Tumorzellen auf angrenzende nichtmaligne Zellen, ob es sich dabei nun um Epithelzellen, Stromafibroblasten, Endothelzellen oder irgendeinen anderen relevanten Zelltyp handelt. An einen Tumor angrenzende Zellen werden dazu gebracht, erhöhte Konzentrationen von Rezeptoren oder anderen Proteinen zu sekretieren oder zu exprimieren (z. B. Tumour and stromal expression of matrix metalloproteinases and their role in tumour progression, Review von H. C. Crawford in Invasion Metastasis, (1994), 14, S. 234–245; Expression of uPA and its receptor by both neoplastic and stromal cells during xenograft invasion, Int. J. Cancer, (1994), 57, S. 553–560; Vitronectin in colorectal adenocarcinoma, synthesis by stromal cells in culture, Experimental Cell Research (1994), 214, S. 303–312; Invasive tumours induce c-ets1 transcription factor expression in adjacent stroma, Biol. Cell. (1995), 84, S. 53–61; Tumour cell and connective tissue cell interactions in human colorectal adenocarcinoma, Am. J. Pathology (1997), 151, S. 479–493; CD40 antigen is expressed in endothelial cells and tumour cells in Kaposi's sarcoma, Am. J. Pathology (1996), 148, S. 1387–1397; Strometysin is overexpressed by stromal elements in primary non-small cell lung cancers and is regulated by retinoic acid in pulmonary fibroblasts, Cancer Research, (1995), 55, S. 4120–4126; Increased expression of epidermal growth factor receptor in non-malignant epithelium adjacent to head and neck carcinomas, Oral Diseases, (1998), 4, S. 4–8). Die an einen Tumor angrenzenden nichtmalignen Zellen sind gegenüber entfernt gelegenen nichtmalignen Zellen aberrant, da sie dazu gebracht werden, Proteine zu exprimieren, die von entfernt gelegenen Gegenstücken nicht exprimiert werden; dies wird in einem qualitativ und/oder quantitativ modifizierten Spektrum von Peptiden reflektiert, die auf den MHC-I Molekülen der neben dem Tumor liegenden Zellen dargestellt werden, die von dem Immunsystem als aberrant erkannt werden können. Folglich zielt diese Ausgestaltung in ähnlicher Weise wie Strategien auf der Basis von Anti-Angiogenese neben dem Tumor selbst auf die lokale Tumormikroumgebung ab.
Diese Ausgestaltung beschreibt die Herstellung eines Mischzellimpfstoffs, wobei Tumorzelllinien in engem Kontakt zu einer nichtmalignen Komponente wachsen gelassen werden. Das Wachstum dieses Mischzellimpfstoffs kann durch eine Reihe von Mitteln erreicht werden, wie zum Beispiel durch Co-Kultur in 2D-Flaschen, Wachstum in Transwell-Inserts, wobei sich konditioniertes Medium auf die Tumorlinie auswirkt, oder Wachstum in einem 3D-Mischkultursystem. Wesentliche Vorteile eines Mischkulturansatzes bestehen gemäß der Literatur darin, dass in vielen Fällen ein Zell-Zell-Kontakt erforderlich ist, um reziproke phänotypische Änderungen sowohl in Tumor- als auch Nichttumorkomponenten hervorzurufen (z. B. Fibroblast mediated differentiation in human breast carcinoma cells (MCF-7) grown as nodules in vitro, Int. J. Cancer., (1994), 56, S. 731–735; Regulation of collagenase-3 expression in human breast carcinoma is mediated by stromal-epithelial cell interactions, Cancer Research (1997), 57, S. 4882–4888; Co-culture of human breast adenocarcinoma MCF-7 cells and human dermal fibroblasts enhances the production of matrix metalloproteinases 1,2 and 3 in fibroblasts, Brit. J. Cancer, (1995), 71, S. 1039–1045).
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Verwendung einer 3D-Mikroschwerkraftkultur für das Wachstum signifikanter Mengen von Tumorzellen und co-kultivierten Zellen zur Verwendung als Impfstoff. Wir haben gefunden, dass in einem 3D-Mikroschwerkraftgefäß mit einem Fassungsvermögen von 50 ml die gleiche Biomassenproduktion wie in 30 T175 Flaschen erreicht werden kann. Durch die Verwendung eines 500 ml 3D-Mikroschwerkraftgefäß können wir die gleiche Impfstoffproduktion von Säugetiertumorzelllinien erreichen wie bei der Kultivierung von 300 T175 Flaschen oder dreißig 1700 cm² Rollerflaschen.
Eine weitere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung einer 3D-Co-Kultur zum Erreichen eines Mischzellimpfstoffs vor, der eine immortalisierte Tumorzelllinie in Kombination mit einer immortalisierten oder nichtimmortalisierten, nichtmalignen Zelllinie wie Epithelzellen, Stromafibroblasten, Knochenstromazellen, Endothelzellen, Palisadenzellen oder irgendeinem anderen immortalisierten oder nichtimmortalisierten, nichtmalignen Zelltyp umfasst. Von besonderem Interesse sind Zellen der neuroendokrinen Linie, von denen angenommen wird, dass sie eine parakrine Funktion haben, die möglicherweise den Fortschritt der Tumorentwicklung von der Hyperplasie zu neoplastischen zu metastatischen Phänotypen lenkt. In der Literatur sind zwei immortalisierte neuroendokrine Tumorlinien bekannt, die prostatisch abgeleitete lungenmetastatische neuroendokrine Linie CRL5813 (NCI-H660) und die kolorektale neuroendokrine Linie COLO320DMF, die beide neuroendokrine Faktoren wie Nebenschilddrüsenhormon, Bombesin usw. sekretieren. Die Kulturen können mit zwei oder mehr Zelltypen, die von unabhängigen 2D-Kulturflaschen entnommen werden, co-geimpft werden, oder die Kultur kann sequentiell geimpft werden, zum Beispiel zuerst mit einem Stromafibroblasten und dann etwa ein oder zwei Tage später mit einer Tumorzelllinie.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein direktes Verfahren zur Formulierung von Zellen, die von 3D-Mikroschwerkraftkultur geerntet werden, ohne dass eine Behandlung der Zellen mit Trypsin erforderlich wäre. Dieses Verfahren hat daher den Vorteil, dass der Zellertrag nach der Ernte wesentlich erhöht ist, wohingegen es bei traditionell gewachsenen 2D-Kulturen zu erheblichen Verlusten im Laufe der Trypsinisierung, Neutralisierung, Wäsche und Formulierung kommt. Als Sphäroide geerntete Zellen sind gewöhnlich wesentlich robuster bei der Handhabung und Wäsche und führen folglich zu erhöhten Ausbeuten.
Wir offenbaren außerdem einen verbesserten Phänotyp eines Krebsimpfstoffs infolge des Wachstums als Sphäroide in 3D-Mikroschwerkraftkultur und insbesondere co-kultivierter Zellen, die in 3D-Mikroschwerkraftkultur wachsen. Zellen, die in 2D-Kultur wachsen, haben wenig Ähnlichkeit mit In-vivo-Tumorzellen. Die Monolayers von 2D gewachsenen Zellen haben ein einheitliches Pflastersteinaussehen, werden kontaktgehemmt, wachsen unter Bedingungen mit optimaler Gas- und Nährstoffzufuhr und haften direkt am Kunststoff- oder Glasgefäß an, in dem sie wachsen. Wir haben gefunden, dass Zellen und insbesondere Co-Kulturen von zwei oder mehr verschiedenen Zelltypen, die unter 3D-Mikroschwerkraftbedingungen wachsen gelassen werden, in einer Weise wachsen, die dem In-vivo-Wachstum von Tumorzellen weit ähnlicher ist, Einzelzelltypen und Mischzelltypen, die direkt in die Mikroschwerkraftkammer geimpft werden, Sphäroide bilden, die eine Außenlage haben, die optimal mit Gas und Nährstoffen versorgt wird; eine Innenlage aufweisen, die in gewissem Maße gas- und nährstoffverarmt und geringfügig apoptotisch ist; nicht an Kunststoff oder Glas, sondern an anderen Zellen und irgendeiner von solchen Zellen sekretierten extrazellulären Matrix anhaften; und die eine Mikroumgebung innerhalb des Sphäroids aufrechterhalten, die Wachstumsfaktoren und andere para- und autokrine Sekretionen festhalten kann, die ansonsten von dem Medium ausgewaschen würden. Diese Art von Phänotyp ist für eine Zelllinie von Vorteil, die zur Verwendung als Tumorimpfstoff wachsen gelassen wird, um eine Reaktion auf einen vorhandenen Tumor hervorzurufen.
Analytische Techniken wie Immunhistochemie, Durchflusszytometrie, zweidimensionale Elektrophorese, Kreuzimmunoelektrophorese, Western-Blotting, DNA-Hybridisierung, fluoreszierende In-situ-Hybridisierung und andere Techniken haben wesentliche Verlagerungen beim Phänotyp etablierter Zelllinien aufgedeckt, die in einer wesentlich verstärkten Immunogenität resultieren. Eine weitere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer gemischten 3D-Mikroschwerkraftkultur, die nichtmaligne Zelllinien einschließt, um den Phänotyp von Zelllinien zu verbessern, die bisher nicht in gemischter 3D-Kultur wachsen gelassen wurden.
Eine weitere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung betrifft eine verstärkte Immunogenität, die sich aus der Verwendung nichtmaligner Zellen in Kombination mit Tumorzelllinien ergibt, die sich aus einer direkten Präsentation von Peptiden auf den MHC-I Molekülen der nichtmalignen Zelllinie ergeben, insbesondere dann, wenn die nichtmaligne Zelllinie auf den Empfänger abgestimmt oder teilweise abgestimmt ist. Die Peptide können von den Tumorzelllinien während des Wachstums, der Verarbeitung und Bestrahlung der 3D-Zellmasse freigesetzt werden, oder sie können während der anfänglichen Interaktion von Makrophagen und dendritischen Zellen zum Zeitpunkt der Injektion freigesetzt werden.
Eine separate Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Peptidextrakten und anderen subzellulären Fraktionen, die von Zellen und Co-Kulturen von Zellen stammen, die unter nicht standardgemäßen Bedingungen wachsen. Dazu gehören Zellen, die auf Rollerflaschen, Mikroträgern, Polyesterfaserscheiben wachsen, 3D-Kultur auf nichtadhärenten Flaschen und 3D-Kultur unter Mikroschwerkraftbedingungen. Die von den Zellen abgeleiteten subzellulären Fraktionen oder Peptidfraktionen bieten die Möglichkeit, die aktive Komponente eines bestimmten Impfstoffs wesentlich zu erhöhen. Dieser Aspekt der Erfindung ermöglicht außerdem eine weitere Fraktionierung der subzellulären Fraktionen oder Peptide, um die Wirksubstanzen auszuwählen und die Impfstoffzusammensetzung bei Bedarf zu vereinfachen.
Eine weitere Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung betrifft die Produktion, Zusammensetzung und Verwendung eines gemischten autologen/allogenen Zellimpfstoffs, umfassend autologe nichtmaligne Zellen, die einem geplanten Empfänger des in Kultur mit einer allogenen immortalisierten Tumorzelllinie gewachsenen Impfstoffs entnommen wurden. Die autologen nichtmalignen Zellen haben nichtmaligne Konzentrationen von MHC-I und somit die Fähigkeit, in Zusammenhang mit autologen MHC-I Peptide zu präsentieren, die von lysierten, zerstörten oder apoptotischen Tumorzellen freigesetzt werden, mit denen sie wachsen gelassen wurden.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine PSA-Expressionsanalyse (PCR) von Prostatazelllinien, die in Co-Kultur mit Knochenmarkstromazellen wachsen gelassen wurden.
2 zeigt einen Vergleich der Impfstoffwirksamkeit von in vitro gewachsenen K1735 Zellen und in vivo gewachsenen K1735 Zellen in einem Modell eines B16.F10 Mausmelanoms.
3 zeigt eine humane CD4 T-Zell-Proliferationsreaktion auf Lysate einer Co-Kultur von DU-145 und NHBSF.
4 zeigt eine humane CD8 T-Zell-Proliferationsreaktion auf Lysate einer Co-Kultur von DU-145 und NHBSF.
5 zeigt Überlebenskurven einer Therapiestudie mit Ratten unter Verwendung von PA3 und PA3/YPEN/BMS Co-Kulturen, die in 2D-Kultur wachsen gelassen wurden.
6 zeigt die Vergleichswirksamkeit von 2D gewachsenen PA3 und PA3/YPEN/BMS Co-Kulturen in Schutzstudien mit Ratten.
7 zeigt die Vergleichswirksamkeit von 3D gewachsenen PA3 und PA3/YPEN/BMS Co-Kulturen in Schutzstudien mit Ratten.
Beispiele
Wachstum einer Mausmelanomzelllinie mit einer immortalisierten Fibroblastenlinie in 3D-Kultur
Die Mausmelanomzelllinie K1735 wurde mit der Mausfibroblastenzelllinie 3T3 in einem Verhältnis von 1 : 1 wachsen gelassen. Die 3T3 Zellen wurden zu 5 × 10⁶ Zellen in eine 50-ml-Kassette für ein Mikroschwerkraftinstrument (Synthecon) geimpft und 2 Tage lang in DMEM 2% fötalem Kälberserum, 10 mM Glutamin wachsen gelassen. Es erfolgte eine weitere Einsaat von 5 × 10⁶ Zellen von jeder K1735 in die 50-ml-Drehkassette (Synthecon), und die Kultur wurde weitere 6–9 Tage lang inokuliert. Die resultierenden Sphäroiden wurden geerntet und durch leichtes Zentrifugieren in DMEM am Tag 8–11 gewaschen und für weitere Analysen genommen.
Ein Vergleich wurde zwischen den 3D co-kultivierten 3T3/K1735 und einem Gemisch aus 3T3 und K1735 Zellen angestellt, die in separaten 2D-Kulturen wuchsen und nach der Ernte vermischt wurden. Die Zellen wurden trypsinisiert und das Gemisch aus Zellen von 2D- und 3D-Kulturen wurde hinsichtlich des Apoptosegrads durch Annexin- und Propidiumiodidfärbung und außerdem hinsichtlich der phänotypischen Expression verschiedener Marker analysiert. Eine weitere Analyse kleiner immunogener Peptide, die durch das Verfahren von Nair et al (1997 Eur. J. Immunol. 27, S. 589–597) extrahiert wurden, fand unter Anwendung von Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation (SELDI) Massenspektrometrie statt. Die 3D co-kultivierten Fibroblasten und Melanomzellen erzeugten ein wesentlich komplexeres Muster von Peptiden, von denen einige für das Co-Kultursystem einzigartig sind.
Wachstum einer humanen Prostatatumorzelllinie mit einer humanen nichtmalignen Prostataepithelzelllinie
Die humane Prostataepitheltumorzelllinie NIH1542 wurde mit der nichtmalignen humanen Prostataepithellinie PNT2-C2 in einem Verhältnis von 1 : 1 in einem 3D-Mikroschwerkraftkulturgefäß (Synthecon) wachsen gelassen. Die Zelllinien wurden jeweils zu 5 × 10⁶ Zellen co-inokuliert und in KSFM 6–11 Tage lang kultiviert, bis sich eine wesentliche Biomasse von Sphäroiden angesammelt hatte. Die Zellmasse wurde geerntet und in serumfreiem Medium gewaschen und dann trypsinisiert, um die Probe für die Analyse zu präparieren.
Ein Vergleich wurde zwischen den 3D co-kultivierten NIH-1542/PNT2-C2 und einem Gemisch aus NIH-1542 und PNT2-C2 Zellen angestellt, die in separaten 2D-Kulturen wachsen gelassen und nach der Ernte vermischt wurden. Die Zellen wurden trypsinisiert und das Gemisch aus Zellen von 2D- und 3D-Kulturen wurde auf Apoptosegrad durch Annexin- und Propidiumiodidfärbung und außerdem auf phänotypische Expression verschiedener Marker analysiert. Eine weitere Analyse kleiner immunogener Peptide, die durch das Verfahren von Nair et al (1997 Eur. J. Immunol. 27, S. 589–597) extrahiert wurden, fand unter Anwendung von Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation (SELDI) Massenspektrometrie statt. Die 3D co-kultivierten Fibroblasten und Melanomzellen erzeugten ein wesentlich komplexeres Muster von Peptiden, von denen einige für das Co-Kultursystem einzigartig sind.
Wachstum einer humanen Prostatatumorzelllinie mit einer humanen prostatisch abgeleiteten neuroendokrinen Lungenmetastasezelllinie
Die humane Prostata-Epitheltumorlinie NIH1542 wurde mit der humanen neuroendokrinen Prostata-Epithellinie CRL-5813 in einem Verhältnis von 1 : 1 in einem 3D-Mikroschwerkraftkulturgefäß (Synthecon) wachsen gelassen. Die Zelllinien wurden jeweils zu 5 × 10⁶ Zellen co-inokuliert und in KSFM 6–11 Tage lang wachsen gelassen, bis sich eine wesentliche Biomasse von Sphäroiden angesammelt hatte. Parallel wurden zwei separate 2D-Kulturen eingesät und auf nahezu Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden trypsinisiert und das Gemisch aus Zellen von 2D und 3D Co-Kultur wurde auf Apoptosegrad durch Annexin- und Propidiumiodidfärbung und außerdem auf phänotypische Expression verschiedener Marker analysiert. Eine weitere Analyse kleiner immunogener Peptide, die durch das Verfahren von Nair et al (1997 Eur. J. Immunol. 27, S. 589–597) extrahiert wurden, fand unter Anwendung von Surface Enhanced Laser Desorption Ionisation (SELDI) Massenspektrometrie statt. Die 3D co-kultivierten Epithel- und neuroendokrinen Zellen erzeugten ein wesentlich komplexeres Muster von Peptiden als die gemischten 2D gewachsenen Zellen, von denen einige für das Co-Kultursystem einzigartig sind.
Herstellung eines Impfstoffs, umfassend eine Mausmelanomzelllinie mit einer immortalisierten Fibroblastenlinie in 3D-Kultur
Die Mausmelanomzelllinie K1735 wurde mit der Mausfibroblastenzelllinie 3T3 in einem Verhältnis von 1 : 1 wachsen gelassen. Die 3T3 Zellen wurden zu 5 × 10⁶ Zellen in eine 50-ml-Kassette für ein Mikroschwerkraftinstrument (Synthecon) geimpft und 2 Tage lang in DMEM 2% fötalem Kälberserum, 10 mM Glutamin wachsen gelassen. Es erfolgte eine weitere Einsaat von 5 × 10⁶ Zellen von jeder K1735 in die 50-ml-Drehkassette (Synthecon), und die Kultur wurde weitere 6–9 Tage inokuliert.
Die Zellen wurden 7–14 Tage lang wachsen gelassen, wobei Zwischenmedium und Wachstumsfaktor nachgefüllt wurden. Bei der Ernte wurde die Kassette in ein Zentrifugengefäß entleert und leicht zentrifugiert, um die Biomasse zu pelletieren. Die sichtbaren und nicht sichtbaren Sphäroide wurden dreimal in PBS oder anderem inertem Medium gewaschen, bei 50–300 Gy bestrahlt und dann entweder direkt im Schutzexperiment verwendet oder in einem angemessenen Gefriergemisch (10% DMSO in Hanks) formuliert und auf der Basis der Zellzahl, bestimmt durch Trypsinisierung und Zählen, oder auf einer Protein- oder Nucleinsäurebasis aliquotiert. Es war keine Trypsinisierung erforderlich, um die Impfstoffzellen aus dem Kulturgefäß zu entfernen, so dass wertvolle TAA und TSA zurückgehalten wurden, die eine Anti-Tumor-Reaktion im Empfängersäugetier hervorrufen. Ferner können die Sphäroide infolge ihrer Größe wesentlich leichter geerntet werden, so dass eine weniger aggressive Zentrifugation, wie sie normalerweise für individuelle Zellen erforderlich ist, notwendig ist, was zu einer wesentlichen Steigerung der gewonnenen Zellmasse führt.
Eine Aliquote von co-kultivierten Sphäroiden (1–10 × 10⁶ Zellen) wurde in einem Standardmodell des allogenen Tumorschutzes im B16F10 Tumormodell verwendet.
Gruppen von 8 C57/B6 Mäusen wurden mit 1–10 × 10⁶ K1735/3T3 Sphäroiden immunisiert und mit in 2D-Flaschen wachsen gelassenen K1735 Zellen verglichen, bestrahlt bei 150 Gy, an T-10 Tagen. Die Mäuse wurden dann am Tag 0 mit 5 × 10⁵ lebenden B16F10 Zellen in Kontakt gebracht und auf Tumorwachstum überwacht.
PSA-Expression in Prostatazelllinien, die alleine und in Co-Kultur mit normalen Knochenmarkstromazellen wachsen gelassen wurden
Methodik
Zellkultur
Die Zelllinien ONYCAP-1, ONYCAP-23, P4E6 und SHMAC-4 wurden zu 1 × 10⁶ Zellen auf konfluente Monolayers von NHBMSC Zellen in T175 Kulturflaschen geimpft. Co-Kulturen wurden 2 Tage lang mit Keratinozytenwachstumsmedium gehalten, das mit 5% fötalem Kälberserum angereichert war. Zellen wurden durch Abschaben von der Oberfläche des Kunststoffs geerntet und vor der RNA-Extraktion in Hank's balanzierter Salzlösung gewaschen.
Zelllinien mit der Bezeichnung Onycap 1 und Onycap 23 wurden am 28. März 2000 im Rahmen des Budapester Vertrags mit den jeweiligen Beitrittsnummern 00032802 und 00032801 bei der ECACC hinterlegt.
RNA-Extraktion
Eine doppelte Extraktion wurde unter Verwendung von TRI REAGENT (Sigma Nr. T9424) durchgeführt. Das Reagens wurde direkt zu den gewaschenen Zellpellets gegeben; man ließ die Proben 5 Minuten lang stehen, bevor Chloroform zugegeben wurde. Die Proben wurden verwirbelt und weitere 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann bei 12.000 g 15 Minuten lang zentrifugiert.
Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen übertragen, eine weitere Aliquote TRI REAGENT wurde zugegeben und die obigen Schritte wurden für die Zweitstufenextraktion wiederholt. Die wässrige Phase wurde wieder in ein frisches Röhrchen übertragen und die RNA mit Isopropanol präzipitiert. RNA-Pellets wurden mit 75% Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.
DNase-Behandlung
Eine Aliquote von jeder RNA-Probe wurde mit Desoxyribonuclease I (Life Technologies Nr. 18068-015) behandelt, um zu gewährleisten, dass keine Verunreinigung mit genomischer DNA vorlag. Die Reaktionen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend wurde die DNase durch die Zugabe von 25 mM EDTA inaktiviert und 10 Minuten lang auf 65°C erwärmt.
Umkehrtranskription
Eine Umkehrtranskription wurde mit dem First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-PCR (AMV) von Boehringer Mannheim (Nr. 1 483 188) durchgeführt. Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 25°C und dann 1 Stunde lang bei 42°C inkubiert. Das AMV-Enzym wurde durch 5-minütiges Erhitzen auf 99°C denaturiert und anschließend wurde die Reaktion auf 4°C abgekühlt.
PCR
PCR-Primer wurden von veröffentlichten Sequenzen entworfen. Eine Verifizierung der cDNA-Integrität wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von GapdH Haushalts-Primern erreicht. Amplifikationsreaktionen mit dem externen Primersatz fanden unter Anwendung des Thermocycler-Programms (1) statt. Der intern verschachtelte PCR-Satz wurde gemäß dem nachfolgenden Programm (2) laufen gelassen.

(1) 95°C 3 min (2) 95°C 3 min

95°C 45 sec κ 95°C 45 sec κ

57°C 45 sec } 30 Zyklen 60°C 45 sec } 30 Zyklen

72°C 45 sec μ 72°C 45 sec μ

72°C 5 min 72°C 5 min
Positive Kontrollen beinhalteten cDNA von LnCAP. Negative Kontrollen beinhalteten kein cDNA-Template.
Tabelle der Tumorantigen-PCR-Primersätze
Ergebnisse
Die PCR-Proben wurden paarweise laufen gelassen. Die Prostatazellen alleine, dann die gleichen Zellen in Co-Kultur mit NHBMSC, gefolgt von NHBMSC alleine, anschließend eine positive und negative Kontrolle, 1.
In 3 von 4 Prostatazellen, die alleine wachsen gelassen wurden, wurde keine PSA-Expression nachgewiesen, allerdings brachte von allen Zelllinien, die in Co-Kultur mit NHBMSC wuchsen, isolierte cDNA eine Bande bei 200 bp nach 2 PCR-Amplifikationsrunden hervor, was auf eine Hinaufregulation von PSA infolge der Co-Kultur mit Knochenmarkstromazellen schließen lässt.
Antigenexpression in Prostatazelllinien, die alleine und in Co-Kultur mit normalen Knochenmarkstromazellen wachsen gelassen wurden
Methodik
Zellkultur
Die Zelllinie ONYCAP-23 wurde zu 1 × 10⁶ Zellen auf konfluente Monolayers von NHBMSC Zellen in T175 Kulturflaschen geimpft. Co-Kulturen wurden 2 Tage lang mit Keratinozytenwachstumsmedium gehalten, das mit 5% fötalem Kälberserum angereichert war. Zellen wurden durch Abschaben von der Oberfläche des Kunststoffs geerntet und vor der RNA-Extraktion in Hank's balanzierter Salzlösung gewaschen.
RNA-Extraktion
Eine doppelte Extraktion wurde mit TRI REAGENT (Sigma Nr. T9424) durchgeführt. Das Reagens wurde direkt zu den gewaschenen Zellpellets gegeben und man ließ die Proben 5 Minuten lang stehen, bevor Chloroform zugegeben wurde. Die Proben wurden verwirbelt und weitere 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann bei 12.000 g 15 Minuten lang zentrifugiert.
Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen übertragen, eine weitere Aliquote TRI REAGENT wurde zugegeben und die obigen Schritte wurden für die Zweitstufenextraktion wiederholt. Die wässrige Phase wurde wieder in ein frisches Röhrchen übertragen und die RNA mit Isopropanol präzipitiert. RNA-Pellets wurden mit 75% Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.
DNase-Behandlung
Eine Aliquote von jeder RNA-Probe wurde mit Desoxyribonuclease I (Life Technologies Nr. 18068-015) behandelt, um zu gewährleisten, dass keine Verunreinigung mit genomischer DNA vorlag. Die Reaktionen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend wurde die DNase durch die Zugabe von 25 mM EDTA inaktiviert und 10 Minuten lang auf 65°C erwärmt.
Umkehrtranskription
Eine Umkehrtranskription wurde mit dem First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-PCR (AMV) von Boehringer Mannheim (Nr. 1 483 188) durchgeführt. Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 25°C und dann 1 Stunde lang bei 42°C inkubiert. Das AMV-Enzym wurde durch 5-minütiges Erhitzen auf 99°C denaturiert und anschließend wurde die Reaktion auf 4°C abgekühlt.
PCR
PSA PCR-Primer wurden von den nachfolgend tabellarisch aufgeführten veröffentlichten Sequenzen entworfen. Eine Verifizierung der cDNA-Integrität wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von GapdH Haushalts-Primern erreicht. Amplifikationsreaktionen mit dem externen Primersatz fanden unter Anwendung des Thermocycler- Programms (1) statt. Der intern verschachtelte PCR-Satz wurde gemäß dem nachfolgenden Programm (2) laufen gelassen.

(1) 95°C 3 min (2) 95°C 3 min

95°C 45 sec κ 95°C 45 sec κ

57°C 45 sec } 30 Zyklen 60°C 45 sec } 30 Zyklen

72°C 45 sec μ 72°C 45 sec μ

72°C 5 min 72°C 5 min
Androgenrezeptor, Hyaluronsäurerezeptor und MMP-9 PCR-Primer wurden von den nachfolgend tabellarisch dargestellten veröffentlichten Sequenzen entworfen. Eine Verifizierung der cDNA-Integrität wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von GapdH Haushalts-Primern erreicht. Amplifikationsreaktionen mit dem externen Primersatz fanden unter Anwendung des nachfolgenden Thermocycler-Programms (1) statt und wurden auf dem Thermocycler laufen gelassen. Antigen-Primersätze Androgenrezeptor

Vorwärtsprimer GTC CAA GAC CTA CCG AGG AG

Rückwärtsprimer CTG CTG TTG CTG AAG GAG TT

MMP-9

Vorwärtsprimer AGA ACC AAT CTC ACC GAC A

Rückwärtsprimer AGG GAC CAC AAC TCG TCA T

Hyaluronsäurerezeptor

Vorwärtsprimer CTG GGT TGG AGA TGG ATT C

Rückwärtsprimer CAA AGA AGA GGA GAG CAA GC
Amplifikationsbedingungen
Ergebnisse
Die PCR-Proben wurden paarweise auf Agarosegelen laufen gelassen. Die Prostatazellen wurden alleine und dann in Co-Kultur mit NHBMSC wachsen gelassen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 enthalten, in der + auf die Anwesenheit eines relevanten PCR-Produkts bei der erwarteten relativen Molekülmasse und – auf die Abwesenheit eines relevanten PCR-Produkts hindeutet. Die Co-Kultur von Onycap-23 mit NHBSC führte eindeutig zur Expression von mRNA für signifikante Prostata- und Metastasenantigene, wohingegen basale NHBSC und Onycap23 keines dieser signifikanten Antigene hervorbrachten.
In-vivo-Tumorwachstum ergibt einen wirksameren Impfstoff
Das In-vivo-Wachstum eines Tumors ruft eine massive Stromareaktion hervor, wodurch angrenzendes Gewebe, einschließlich Epithelzellen, Stromafibroblasten, Blutgefäßendothelzellen, in die Tumormasse wächst. In der Literatur gibt es reichlich Beweise dafür, dass von einem Tumor hervorgerufenes Stroma eine aberrante Expression von Proteinen als Reaktion auf die Tumorzellen aufweist.
In diesem Beispiel untersuchen wir die Möglichkeit der Verwendung eines in situ gewachsenen Tumors mit zugehörigem Stroma, um zu bestimmen, ob der Einschluss von Stromazellen in einen Impfstoff, ob Epithel, Fibroblast oder Endothel, einen Vorteil gegenüber Tumorzellen alleine bietet.
Wir verglichen in vitro gewachsene K1735 Mausmelanomzellen mit K1735, die in der syngenen C3H-Wirtsmaus wuchsen, in einem Modell einer Impftherapie gegen einen B16.F10 Melanomtumor.
K1735 (P25) Zellen wurden in RPMI 1640 Medium wachsen gelassen, das mit 10% FCS und 2 mM L-Glutamin angereichert war, trypsinisiert, bei 100 Gy bestrahlt und in 10% DMSO in RPMI bei einer Zelldichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml vor der Tieftemperaturkonservierung bei –180°C formuliert.
Ein in einer C3H Maus gewachsener K1735 Tumor wurde exzidiert und in kleine Stücke geschnitten und anschließend durch ein 70-μm-Netz gedrückt, bei 100 Gy bestrahlt und in 10% DMSO in RPMI bei einer Zelldichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml formuliert und dann bei –180°C tieftemperaturkonserviert.
B16.F10 Mausmelanomklon G10 wurde in RPMI 1640 Medium wachsen gelassen, das mit 10% FCS und 2 mM L-Glutamin angereichert war, trypsinisiert und zum Inokulieren von Gruppen von 5 C57BL6 Mäusen in einer lebensfähigen Dosis von 1 × 10⁴ Zellen in 200 μl Medium verwendet. Drei Tage nach dem Kontakt mit lebensfähigem Tumor wurde den Mäusen 1 × 10⁶ von in vitro gewachsenen K1735 oder in vivo gewachsenem Tumor verabreicht oder PBS-injizierte Mäuse und anschließend bei drei weiteren Gelegenheiten am Tag 6, 10 und 13 nach dem Tumorkontakt [sic]. Tumorvolumen und Überleben wurden in einem Abstand von drei Tagen beurteilt (eine Tötung erfolgte, wenn der Tumor 15 × 15 mm erreichte), beginnend bei Tag 11 nach dem Tumorkontakt.
Ergebnisse
Es wurde eine bedeutende Überlebenszunahme mit geringerer Tumorwachstumsgeschwindigkeit in der Gruppe, die eine Impfung mit in vivo gewachsenen K1735 erhalten hatte, im Vergleich zu in vitro gewachsenen K1735 beobachtet (2). Die Anzahl der zum Impfen verwendeten in vivo gewachsenen K1735 Zellen war auch wesentlich geringer, da der Impfstoff auf der Basis der Gesamtzahl und nicht spezifisch auf der Basis der K1735-Zahl formuliert wurde. Da wir eine massive Stromabeteitigung in in vitro gewachsenen Zellen beobachten, wird die tatsächliche Zahl von K1735 Zellen in der für den Impfstoff hergestellten Tumorzellsuspension folglich relativ gering sein, so dass die signifikante Erhöhung der Impfstoffwirksamkeit den Nichttumor-Stromazellen zuzuschreiben ist, die die K1735 Melanomzellen begleiten.
Humane Prostatazellen, die auf Prostatastromafibroblasten wachsen, weisen eine veränderte Genexpression auf
Methodik
Zellkultur
Die Zelllinie DU145 wurde zu 1 × 10⁶ Zellen auf konfluente Monolayers von normalen humanen Prostatastromafibroblasten (NHPSF) in T175 Kulturflaschen geimpft. Co-Kulturen wurden 2 Tage lang mit MEM-Medium aufrechterhalten, das mit 10% FCS und 2 mM L-Glutamin angereichert war. Zellen wurden durch Abschaben von der Oberfläche des Kunststoffs geerntet und vor der RNA-Extraktion in Hank's balanzierter Salzlösung gewaschen.
Normale humane Prostatastromafibroblasten (NHPSF) wurden auf Konfluenz in einer T175 Flasche in MEM-Medium wachsen gelassen, das mit 10% FCS und 2 mM L-Glutamin angereichert war. Zellen wurden durch Abschaben von der Oberfläche des Kunststoffs geerntet und vor der RNA-Extraktion in Hank's balanzierter Salzlösung gewaschen.
Die Zelllinie DU145 wurde zu 1 × 10⁶ Zellen in T175 Flaschen geimpft und in MEM-Medium wachsen gelassen, das mit 10% FCS und 2 mM L-Glutamin angereichert war, und auf Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Abschaben von der Oberfläche des Kunststoffs geerntet und vor der RNA-Extraktion in Hank's balanzierter Salzlösung gewaschen.
RNA-Extraktion
Eine doppelte Extraktion wurde mit TRI REAGENT (Sigma Nr. T9424) durchgeführt. Das Reagens wurde direkt zu den gewaschenen Zellpellets gegeben und man ließ die Proben 5 Minuten lang stehen, bevor Chloroform zugegeben wurde. Proben wurden verwirbelt und weitere 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann bei 12.000 g 15 Minuten lang zentrifugiert.
Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen übertragen, eine weitere Aliquote TRI REAGENT wurde zugegeben und die obigen Schritte wurden für die Zweitstufenextraktion wiederholt. Die wässrige Phase wurde wieder in ein frisches Röhrchen übertragen und die RNA mit Isopropanol präzipitiert. RNA-Pellets wurden mit 75% Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.
DNase-Behandlung
Eine Aliquote von jeder RNA-Probe wurde mit Desoxyribonuclease I (Life Technologies Nr. 18068-015) behandelt, um zu gewährleisten, dass keine Verunreinigung mit genomischer DNA vorlag. Die Reaktionen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend wurde die DNase durch die Zugabe von 25 mM EDTA inaktiviert und 10 Minuten lang auf 65°C erwärmt.
DNA-Array-Sondierung
Markierte cDNA wurde zum Sondieren einer Clontech Atlas^TM Array (Human Cancer Array II) gemäß dem Herstellerprotokoll für Hybridisierung und Wäsche verwendet. Bilder wurden mit einem Phosphor Imager aufgezeichnet, und aufgezeichnete Dateien wurden mit der Clontech Atlas Image^TM Software analysiert.
Ergebnisse
Durch Ausgleichen der zum Sondieren der DNA-Arrays verwendeten cDNA-Mengen konnten wir die Genexpression in der Co-Kultur beurteilen und sie mit der entsprechenden Genexpression in den individuellen Zelllinien vergleichen. Chung et al stellten im Rahmen von Beobachtungen von Morphologie und Wachstumsrate fest, dass mit Prostatafibroblasten co-kultivierte Prostatatumorzelllinien tatsächlich inhibiert und unter Kontrolle gehalten wurden. In Tabelle 2 ist erkennbar, dass viele Gene infolge eines Wachstums auf prostatastämmigen Stromafibroblasten hinabreguliert werden, dass aber zusätzlich eine geringe Zahl hinauf reguliert wird (Tabelle 3).
Diese Methodik lässt die Identifizierung von Genen zu, die durch das Wachstum von Tumorzelllinien auf Stromazellen von verschiedenen Organkompartimenten hinauf- oder hinabreguliert werden. Durch Wählen von Tumorzelllinien mit unterschiedlichem Invasivitätsgrad oder metastatischem Potenzial in Kombination mit Stromazellen wie Prostatafibroblasten, Knochenstromafibroblasten oder Endothelzellen können signifikante Gene identifiziert werden, die infolge des engen Kontakts zwischen Tumor und Stromazelle temporär und räumlich exprimiert werden, und somit Antigene identifiziert werden, die folglich bedeutsame und lebensfähige potenzielle Ziele für die Immuntherapie oder andere therapeutische Strategien sind.
Humane Prostatazellen, die auf Knochenstromafibroblasten wachsen, weisen eine veränderte Genexpression auf
Methodik
Zellkultur
Die Zelllinie DU145 wurde zu 1 × 10⁶ Zellen auf konfluente Monolayers von normalen humanen Knochenstromafibroblasten (NHBSF) in T175 Kulturflaschen geimpft. Co-Kulturen wurden 2 Tage lang mit MEM-Medium gehalten, das mit 10% FCS und 2 mM L-Glutamin angereichert war. Zellen wurden durch Abschaben von der Oberfläche des Kunststoffs geerntet und vor der RNA-Extraktion in Hank's balanzierter Salzlösung gewaschen.
Normale humane Knochenstromafibroblasten (NHBSF) wurden auf Konfluenz in einer T175 Flasche in MEM-Medium wachsen gelassen, das mit 10% FCS und 2 mM L-Glutamin angereichert war. Zellen wurden durch Abschaben von der Oberfläche des Kunststoffs geerntet und vor der RNA-Extraktion in Hank's balanzierter Salzlösung gewaschen.
Die Zelllinie DU145 wurde zu 1 × 10⁶ Zellen in T175 Flaschen geimpft und in MEM-Medium wachsen gelassen, das mit 10% FCS und 2 mM L-Glutamin angereichert war, und auf Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden durch Abschaben von der Oberfläche des Kunststoffs geerntet und vor der RNA-Extraktion in Hank's balanzierter Salzlösung gewaschen.
RNA-Extraktion
Eine doppelte Extraktion wurde mit TRI REAGENT (Sigma Nr. T9424) durchgeführt. Das Reagens wurde direkt zu den gewaschenen Zellpellets gegeben und man ließ die Proben 5 Minuten lang stehen, bevor Chloroform zugegeben wurde. Die Proben wurden verwirbelt und weitere 10 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann bei 12.000 g 15 Minuten lang zentrifugiert.
Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen übertragen, eine weitere Aliquote TRI REAGENT wurde zugegeben und die obigen Schritte wurden für die Zweitstufenextraktion wiederholt. Die wässrige Phase wurde wieder in ein frisches Röhrchen übertragen und die RNA mit Isopropanol präzipitiert. RNA-Pellets wurden mit 75% Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.
DNase-Behandlung
Eine Aliquote von jeder RNA-Probe wurde mit Desoxyribonuclease I (Life Technologies Nr. 18068-015) behandelt, um zu gewährleisten, dass keine Verunreinigung mit genomischer DNA vorlag. Die Reaktionen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend wurde die DNase durch die Zugabe von 25 mM EDTA inaktiviert und 10 Minuten lang auf 65°C erwärmt.
Umkehrtranskription
Eine Umkehrtranskription wurde mit dem First Strand cDNA Synthesis Kit für RT-PCR (AMV) von Boehringer Mannheim (Nr. 1 483 188) durchgeführt. Die Reaktionen wurden 10 Minuten lang bei 25°C und dann 1 Stunde lang bei 42°C inkubiert. Das AMV-Enzym wurde durch 5-minütiges Erhitzen auf 99°C denaturiert und anschließend wurde die Reaktion auf 4°C abgekühlt. 32P oder 33P Desoxynucleotide wurden zum Markieren der cDNA für eine anschließende Sondierung der Arrays verwendet. RNA von DU145 und NHBSF Kulturen wurden zu gleichen Anteilen vermischt, und es wurde die gleiche RNA-Menge in der Umkehrtranskription wie für die Co-Kultur-RNA verwendet.
DNA-Array-Sondierung
Markierte cDNA wurde zum Sondieren einer Clontech Atlas^TM Array (Human Cancer Array II) gemäß dem Herstellerprotokoll für Hybridisierung und Wäsche verwendet. Bilder wurden mit einem Phosphor Imager aufgezeichnet, und aufgezeichnete Dateien wurden mit der Clontech Atlas Image^TM Software analysiert.
Ergebnisse
Durch Ausgleichen der zum Sondieren der DNA-Arrays verwendeten cDNA-Mengen konnten wir die Genexpression in der Co-Kultur beurteilen und sie mit der entsprechenden Genexpression in den individuellen Zelllinien vergleichen, indem cDNA-Proben von den individuellen Prostatatumorzellen und NHBSF vermischt wurden. Chung et al stellten im Rahmen von Beobeachtungen von Morphologie und Wachstumsrate fest, dass Prostatatumorzelllinien, die mit Prostatafibroblasten co-kultiviert waren, tatsächlich inhibiert und unter Kontrolle gehalten wurden. Tabelle 4 zeigt, dass viele Gene infolge eines Wachstums auf prostatastämmigen Stromafibroblasten hinabreguliert werden, dass aber zusätzlich eine geringe Zahl hinaufreguliert wird (Tab. 5).
Diese Methodik lässt die Identifizierung von Genen zu, die durch das Wachstum von Tumorzelllinien auf Stromazellen von verschiedenen Organkompartimenten hinauf- oder hinabreguliert werden. Durch Wählen von Tumorzelllinien mit unterschiedlichem Invasivitätsgrad oder metastatischem Potenzial in Kombination mit Stromazellen wie Prostatafibroblasten, Knochenstromafibroblasten oder Endothelzellen können signifikante Gene identifiziert werden, die infolge des engen Kontakts zwischen Tumor und Stromazelle temporär und räumlich exprimiert werden, und somit Antigene identifiziert werden, die folglich bedeutsame und lebensfähige potenzielle Ziele für die Immuntherapie oder andere therapeutische Strategien sind.
Humane T-Zell-Proliferationsreaktion auf Lysate von Co-Kulturen von DU-145 und NHBSF
Methodik
Wir führten einen Proliferationstest an T-Zellen im Anschluss an eine Stimulation mit Lysaten der Prostatazelllinien durch, um zu ermitteln, ob es bei Patienten, die mit Prostatazelllinien geimpft wurden, zu einer spezifischen Expansion von T-Zell-Populationen kommt, die Antigene erkennen, die von den impfenden Zelllinien und außerdem einer Co-Kultur von DU-145 und NHBSF stammen. Vollblut wurde bei jeder Konsultation der Klinik extrahiert und in dem nachfolgend beschriebenen Proliferationstest auf der Basis von BrdU (Bromdesoxyuridin) verwendet:
BrdU-Proliferationsverfahren bei Patienten Reagenzien
Verfahren

1) 1 ml Blut mit 9 ml RPMI + 2 mM L-gln + PS + 50 μM 2-Me verdünnen. Kein Serum zugeben. Über Nacht bei 37°C stehen lassen.
2) Am nächsten Morgen 450 μl verdünntes Blut in die Wells einer 48-Well-Platte aliquotieren und 50 μl Stimulatorlysat zugeben. Das Lysat wird durch Gefrieren-Auftauen von Tumorzellen (2 × 10⁶ Zelläquivalente/ml) × 3 in Flüssigstickstoff gewonnen, wobei anschließend gefrorene Aliquoten bis zu ihrem Gebrauch gelagert werden.
3) Zellen 5 Tage lang bei 37°C kultivieren.
4) Am Abend des 5. Tages 50 μl BrdU zu 30 μg/ml geben.
5) 100 μl jeder Probe in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden aliquotieren.
6) Platte schleudern und Überstand verwerfen.
7) Rote Blutzellen mit 100 μl Pharmlyse 5 Minuten lang bei Raumtemperatur lysieren.
8) Zweimal mit 50 μl Cytofix waschen.
9) Schleudern und Überstand durch Wegschnippen entfernen.
10) Mit 100 μl Perm Wash 10 Minuten lang bei Raumtemperatur permeabilisieren.
11) 30 μl Antikörpergemisch zugeben, das Antikörper in der korrekten Verdünnung beinhaltet und mit Perm-wash aufgefüllt wurde.
12) 30 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
13) Einmal waschen und in 100 μl 2% Paraformaldehyd resuspendieren.
14) Dies zu 400 μl FACSFlow in zur Analyse bereiten Cluster-Röhrchen geben.
15) Analyse auf FACScan mit 3000 gespeicherten torgesteuerten CD3 Ereignissen.

6-Well-Platte zur Stimulation
96-Well-Platte für Antikörperfärbung
Legende

A: IgG1-FITC (5 μl) IgG1-PE (5 μl) IgG1-PerCP (5 μl) 15 μl MoAb + 15 μl
D: BrdU-FITC (5 μl) CD4-PE (5 μl) CD3-PerCP (5 μl) 15 μl MoAB + 15 μl
E: BrdU-FITC (5 μl) CD8-PE (5 μl) CD3-PerCP (5 μl) 15 μl MoAb + 15 μl
15: NIH1542-CP3TX
Ln: LnCap
D: Du145
Pn: PNT2
Con: ConA Lektin (positive Kontrolle)
Null: Keine Stimulation

Ergebnisse
Die Ergebnisse der Proliferationstests sind in [sic] dargestellt, wo ein Proliferationsindex für CD4 (3) oder CD8 (4) positive T-Zellen gegenüber den verschiedenen Zelllysaten graphisch dargestellt ist, wobei der Proliferationsindex durch Dividieren durch den prozentualen Anteil von T-Zellen abgeleitet wird, die durch die Nichtlysatkontrolle proliferieren.
Die Ergebnisse sind für die Patienten mit der Nummer 1, 2, 3 und 4 dargestellt, die eine Reihe von Impfungen mit humanen Prostatazelllinien, PNT-2, NIH1542, DU145 und LnCap in einem klinischen Versuch zur Beurteilung der Sicherheit und Immunogenität dieser Zelllinien erhalten haben. Die Ergebnisse werden so für die Zelllysate NIH1542, LnCap, DU145, PNT-2 und außerdem für eine Co-Kultur von DU145 und NHBSF Zellen gegeben, dass in jedem Proliferationstest das gleiche Zellzahläquivalent verwendet wird. In dieser heterogenen Population von Patienten, die mit einer Vielfalt von Zelllinien geimpft wurden, ist die Feststellung interessant, dass das co-kultivierte Lysat bei 3 von 4 Patienten zu einer wesentlichen Verbesserung der CD4 und CD8 Proliferationsreaktion geführt hat. Dies ist ein Hinweis darauf, dass in Co-Kultur ein repräsentativeres Spektrum von Antigenen produziert wird als in der Monokultur von DU-145 alleine.
2D-Co-Kultur der Prostatatumorlinie mit Knochenstromazellen und Endothelzellen erhöht die Impfstoffwirksamkeit
Die Ratten-PA3-Prostatatumorlinie ist ein relativ schwaches allogenes Immungen in der mit autologen MatLyLu-Prostatazellen in Kontakt gebrachten Kopenhagen-Ratte. Wir haben PA3-Ratten-Prostatatumorzellen, die in T185 Flaschen wuchsen, mit PA3-Zellen, co-kultiviert mit Knochenstromafibroblasten und YPEN Endothelzellen in T185 Flaschen, als Impfstoff in einem Schutzmodell verglichen.
PA3 Klon 1 2D
PA3 Klon 1 Zellen (1 × 10⁶) wurden in eine T175 Gewebekulturflasche in 35 ml RPMI 1640 Kulturmedium geimpft, das mit 10% FCS/2 mM Glutamin angereichert war. Man ließ die Zellen unter Bedingungen mit 37°C/5% CO₂ bis zur Konfluenz wachsen. Konfluente Zellen wurden geerntet durch Waschen der Monolayer mit 10 ml Hank's Puffersalzlösung und anschließend mit 5 ml Trypsin/EDTA-Lösung, um die Zellen aus der Flasche zu entfernen. Nachdem alle Zellen von der Flaschenoberfläche abgehoben waren, wurde die Trypsinreaktion durch die Zugabe von 5 ml FCS unterbrochen. 10 ml der Zellsuspension wurden in einem 50-ml-Röhrchen aufgefangen und bei 18.000 UPM 3 Minuten lang zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 10 ml PBS resuspendiert und auf Eis gelagert, bevor es bestrahlt wurde.
PA3/YPEN 2D Co-Kultur
PA3 Klon 1 Zellen (1 × 10⁵) und YPEN Zellen (1 × 10⁵) wurden gleichzeitig in eine T75 Gewebekulturflasche geimpft, die 15 ml RPMI 1640 Kulturmedium enthielt, das mit 10% FCS/2 mM Glutamin angereichert war. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen, durch Zellabschabung geerntet, durch 3-minütige Zentrifugation bei 18.000 UPM pelletiert und in 10 ml PBS resuspendiert. Die Zellen wurden vor der Bestrahlung auf Eis gelagert.
PA3/YPEN/RBMS 2D Co-Kultur
PA3 Klon 1 Zellen (1 × 10⁵), YPEN Zellen (1 × 10⁵) und RBMS (1 × 10⁵) wurden gleichzeitig in eine T75 Gewebekulturflasche geimpft, die 15 ml RPMI 1640 Kulturmedium enthielt, das mit 10% FCS/2 mM Glutamin angereichert war. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen, durch Zellabschabung geerntet, durch 3-minütige Zentrifugation bei 18.000 UPM pelletiert und in 10 ml PBS resuspendiert. Die Zellen wurden vor der Bestrahlung auf Eis gelagert.
PA3/RBMS 2D Co-Kultur
PA3 Klon 1 Zellen (1 × 10⁵) und (1 × 10⁵) RBMS wurden gleichzeitig in eine T75 Gewebekulturflasche geimpft, die 15 ml RPMI 1640 Kulturmedium enthielt, das mit 10% FCS/2 mM Glutamin angereichert war. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen, durch Zellabschabung geerntet, durch 3-minütige Zentrifugation bei 18.000 UPM pelletiert und in 10 ml PBS resuspendiert. Die Zellen wurden vor der Bestrahlung einmal gelagert.
Bestrahlung und Zellzählung
Röhrchen, die Zellsuspensionen enthielten, wurden mit 6 × 25 Gy (insgesamt 150 Gy) bestrahlt. Anschließend fand an jeder Probe eine Zellzählung mit einem Hämozytometer statt. Kurz, 10 μl von jeder Zellsuspension wurden mit 90 μl Trypanblau vermischt und etwa 10 μl wurden unter das Deckglas des Hämozytometers gegeben. Eine Zellzählung fand mit einer Objektivlinse (20 ×) statt. Jede Zellsuspension wurde dann 3 Minuten lang bei 18.000 UPM zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in Impfstoff-Gefriermedium (RPMI 1640/8% FCS/8% DMSO) zu 5 × 10⁶ Zellen je ml Gefriermedium resuspendiert. Suspensionen wurden dann in Gefrierphiolen zu 1,2 ml pro Phiole aliquotiert; die Phiolen wurden dann über Nacht in einen Gefrierapparat (–80°C) gegeben, bevor sie in Flüssigstickstoff gelagert wurden.
Injektionsprotokoll (Impfstoff)
Die entsprechenden Phiolen wurden aus der Flüssigstickstofflagerung genommen und aufgetaut; 0,2 ml der Phiole wurden in die rasierte rechte, hintere Flanke einer Kopenhagen-Ratte injiziert. 1 Phiole reicht für die Injektion bei 5 Tieren aus (1 Versuchsgruppe). Das Injektionssystem für Schutz und Therapie ist unten aufgeführt.
Kultur der „Kontakt"-Tumorzelllinie
Das für diese Experimente verwendete Kontaktmaterial ist die Zelllinie Mat-Ly-Lu (Wildtyp)
Mat-Ly-Lu-Zellen (1 × 10⁶) wurden in eine T175 Gewebekulturflasche in 35 ml RPMI 1640 Kulturmedium geimpft, das mit 10% FCS/2 mM Glutamin angereichert war. Man ließ die Zellen unter Bedingungen mit 37°C/5% CO₂ bis zur Konfluenz wachsen. Konfluente Zellen wurden geerntet durch Waschen der Monolayer mit 10 ml Hank's Puffersalzlösung und anschließend mit 5 ml Trypsin/EDTA-Lösung, um die Zellen aus der Flasche zu entfernen. Nachdem alle Zellen von der Flaschenoberfläche abgehoben waren, wurde die Trypsinreaktion durch die Zugabe von 5 ml FCS unterbrochen. 10 ml der Zellsuspension wurden in einem 50-ml-Röhrchen aufgefangen und bei 18.000 UPM 3 Minuten lang zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 10 ml PBS resuspendiert und auf Eis gelagert. Eine Zellzählung fand wie oben beschrieben statt, die Zellsuspension wurde auf 5 × 10⁵ je ml eingestellt und in Kryophiolen zu 1,2 ml je Phiole atiquotiert. Die Phiolen wurden dann vor der Injektion auf Eis aufbewahrt.
Injektionsprotokoll (Kontakt)
Bestrahlte Mat-Ly-Lu-Zellen (0,2 ml) wurden in die rasierte linke Hinterflanke einer Kopenhagen-Ratte injiziert. 1 Phiole reicht für die Injektion bei 5 Tieren aus (1 Versuchsgruppe). Nachfolgend ist das Injektionssystem für Schutz und Therapie aufgeführt.
Therapiemodell
Schutzmodell
Messkriterien beim Tier
Die Tumordimensionen wurden mit Greifzirkeln gemessen, wobei für jeden Tumor zwei Messungen – in Längs- und Querrichtung – vorgenommen wurden. Diese Werte wurden miteinander multipliziert, um einen Hinweis auf die Tumorgröße zu erhalten. 25 mm wurden als Tötungsgröße festgelegt, so dass jeder Tumor, der die Größe bei einer der beiden messbaren Dimensionen erreichte, durch die Einwirkung einer zunehmenden CO₂-Konzentration und zervikale Dislokation getötet wurde [sic]. Anschließend wurden Tötungskurven generiert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse des Vergleichs von 2D gewachsenen Co-Kulturen im Ratten-Therapiemodell, das ein äußerst aggressives Arbeitsmodell ist, sind in 5 dargestellt. Die Co-Kultur von PA3-Zellen mit YPEN und RBMS Zellen resultierte in einem wirksameren Impfstoff als PA3 Zellen alleine. Es ist wichtig zu verstehen, dass der Impfstoff in diesem Experiment auf der Basis der gesamten Zellzahl verabreicht wurde, was bedeutet, dass die tatsächliche Menge von PA3-Zellen in der Co-Kultur wesentlich geringer war als bei den PA3-Zellen alleine, so dass die Hypothese belegt wird, dass die Co-Kultur in einem relevanteren Antigenrepertoire als PA3-Zellen alleine resultiert.
Im Ratten-Schutzmodell sind die Ergebnisse gleichermaßen beeindruckend (6). Zunächst bieten die 2D gewachsenen PA3-Zellen ein geringes Maß an Schutz. Die Co-Kulturen von PA3 mit YPEN und PA3 mit RBMS bieten ebenfalls ein geringes Maß an Schutz, allerdings wird die Zahl der PA3-Zellen in den Co-Kulturen reduziert, da der Impfstoff auf der Basis der gesamten Zellzahl verabreicht wird. Dies trifft vor allem für die PA3/YPEN-Co-Kultur zu; die PA3-Komponente wird stark reduziert, da die YPEN noch aggressiver wachsen als die PA3-Zellen alleine. Die Co-Kultur aus PA3, YPEN und RBMS weist eine wesentliche Verbesserung der Impfstoffwirksamkeit auf, die anhand einer deutlichen Zunahme des Überlebensvorteils bei Ratten erkennbar ist, die mit diesem co-kultivierten Impfstoff geimpft wurden.
3D Co-Kultur der Prostatatumorlinie mit Knochenstromazellen und Endothelzellen erhöht die Impfstoffwirksamkeit
Die Ratten-PA3-Prostatatumorlinie ist ein relativ schwaches allogenes Immungen in der mit autologen MatLyLu-Prostatazellen in Kontakt gebrachten Kopenhagen-Ratte. Wir haben PA3-Ratten-Prostatatumorzellen, die in 3D-Mikroschwerkraftkultur wuchsen und PA3-Zellen, co-kultiviert mit Knochenstromafibroblasten und YPEN Endothelzellen in 3D-Mikroschwerkraftkultur, als Impfstoff in einem Ratten-Therapie- und Schutzmodell verglichen.
Wachstum von PA3-Zellen in 3D-Kultur
Die Rollerkassette wurde über den Schraubdeckel mit 35 ml Kulturmedium (RPMI 1640 10% FCS/2 mM Glutamin) gefüllt; dazu wurden 6 × 10⁶ Zellen suspendiert 6 ml Kulturmedium gegeben [sic]. Die Rollerkassette wurde dann mit ~10 ml Kulturmedium vollständig (etwa 50 ml) aufgefüllt und der Schraubdeckel wurde wieder aufgesetzt. Eine 20-ml-Spritze, die mit einem 20-μm-Filter ausgestattet war, wurde auf das Auslassventil der Rollerkassette aufgeschraubt. Eine zweite 20-ml-Spritze, die mit einem 20 μm ausgestattet war, wurde mit Kulturmedium gefüllt und auf das Einlassventil der Rollerkassette geschraubt. Beide Ventile an der Kassette wurden geöffnet und Druck wurde auf die Einlassspritze aufgebracht, um restliche Luftbläschen aus dem Inneren der Kassette zu drängen. Nachdem alle Luftbläschen entfernt waren, wurden beide Ventile geschlossen, restliches Kulturmedium wurde abgesaugt und die Ventile wurden mit Stopfen verschlossen. Die Rollerkassetten wurden an der Rollervorrichtung befestigt und bei 37°C/5% CO₂ und 16 UPM gedreht. Man ließ die Kulturen 3–4 Tage lang weiter bestehen; anschließend wurden sie geerntet, indem der Deckel auf der Rollerkassette abgeschraubt und der Inhalt in ein 50-ml-Röhrchen gegossen wurde. Die Zellen wurden dreimal durch Zentrifugation und Resuspension gewaschen und vor der Bestrahlung auf Eis gelagert.
Wachstum von 3D Co-Kulturen
Die gleiche Wachstumsmethodik wurde angewendet, um Co-Kulturen von PA3/YPEN, PA3/RBMS und PA3/YPEN/RBMS in 3D-Mikroschwerkraft zu erzeugen. Die gesamte Einsaat in die 3D-Kassette wurde bei 6 × 10⁶ Zellen gehalten (3 × 10⁶ Zellen/Zelltyp für zwei Zelltypen oder 2 × 10⁶ Zellen/Zelltyp für drei Zelltypen). Wachstum und Ernte der Co-Kulturen entsprechen der Beschreibung im vorherigen Abschnitt.
Bestrahlung/Zellzählung
Röhrchen, die Zellsuspensionen enthielten, wurden mit 6 × 25 Gy (insgesamt 150 Gy) bestrahlt. Anschließend fand an jeder Probe eine Zellzählung mit einem Hämozytometer statt. Kurz, 10 μl von jeder Zellsuspension wurden mit 90 μl Trypanblau vermischt und etwa 10 μl wurden unter das Deckglas des Hämozytometers gegeben. Eine Zellzählung fand mit einer Objektivlinse (20 ×) statt. Jede Zellsuspension wurde dann 3 Minuten lang bei 18.000 UPM zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in Impfstoff-Gefriermedium (RPMI 1640/8% FCS/8% DMSO) zu 5 × 10⁶ Zellen je ml Gefriermedium resuspendiert. Suspensionen wurden dann in Gefrierphiolen zu 1,2 ml pro Phiole aliquotiert; die Phiolen wurden dann über Nacht in einen Gefrierapparat (–80°C) gegeben, bevor sie in Flüssigstickstoff gelagert wurden.
Injektionsprotokoll (Impfstoff)
Die entsprechenden Ampullen wurden aus der Flüssigstickstofflagerung genommen und aufgetaut, und 0,2 ml der Phiole wurden in die rasierte rechte Hinterflanke einer Kopenhagen-Ratte injiziert. 1 Phiole reicht für die Injektion bei 5 Tieren aus (1 Versuchsgruppe). Nachfolgend ist das Injektionssystem für Schutz und Therapie aufgeführt.
Kultur von „Kontakt"-Tumorzelllinie
Das für diese Experimente verwendete Kontaktmaterial ist die Zelllinie Mat-Ly-Lu (Wildtyp). Mat-Ly-Lu-Zellen (1 × 10⁶) wurden in eine T175 Gewebekulturflasche in 35 ml RPMI 1640 Kulturmedium geimpft, das mit 10% FCS/2 mM Glutamin angereichert war. Man ließ die Zellen unter Bedingungen mit 37°C/5% CO₂ bis zur Konfluenz wachsen. Konfluente Zellen wurden geerntet durch Waschen der Monolayer mit 10 ml Hank's Puffersalzlösung und anschließend mit 5 ml Trypsin/EDTA-Lösung, um die Zellen aus der Flasche zu entfernen. Nachdem alle Zellen von der Flaschenoberfläche abgehoben waren, wurde die Trypsinreaktion durch die Zugabe von 5 ml FCS unterbrochen. 10 ml der Zellsuspension wurden in einem 50-ml-Röhrchen aufgefangen und bei 18.000 UPM 3 Minuten lang zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 10 ml PBS resuspendiert und auf Eis gelagert. Eine Zellzählung fand wie oben beschrieben statt, die Zellsuspension wurde auf 5 × 10⁵ je ml eingestellt und in Kryophiolen zu 1,2 ml je Phiole aliquotiert. Die Phiolen wurden dann vor der Injektion auf Eis aufbewahrt.
Injektionsprotokoll (Kontakt)
Mat-Ly-Lu-Zellen, die wie im vorherigen Abschnitt hergestellt wurden (0,2 ml), wurden in die rasierte linke Hinterflanke einer Kopenhagen-Ratte injiziert. 1 Phiole reicht für die Injektion bei 5 Tieren aus (1 Versuchsgruppe). Nachfolgend ist das Injektionssystem für Schutz und Therapie aufgeführt.
Therapiemodell
Schutzmodell
Messkriterien beim Tier
Die Tumordimensionen wurden mit Greifzirkeln gemessen, wobei für jeden Tumor zwei Messungen – in Längs- und Querrichtung – vorgenommen wurden. Diese Werte wurden miteinander multipliziert, um einen Hinweis auf die Tumorgröße zu erhalten. 25 mm wurden als Tötungsgröße festgelegt, so dass jeder Tumor, der die Größe bei einer der beiden messbaren Dimensionen erreichte, durch die Einwirkung einer zunehmenden CO₂-Konzentration und zervikal Dislokation getötet wurde. Anschließend wurden Tötungskurven generiert.
Ergebnisse
Die Ergebnisse des Vergleichs von 3D gewachsenen Impfstoffen sind in 7 dargestellt. Die 3D gewachsenen PA3-Zellen bieten ein gutes Maß an Schutz gegenüber der Vehikelkontrolle. Die 3D-Co-Kultur von PA3 mit YPEN bietet überhaupt keinen Schutz und reflektiert möglicherweise die Reduzierung von PA3-Zellen, wie zuvor erwähnt. PA3-Zellen mit RBMS bieten ebenfalls ein gutes Maß an Schutz, obwohl der Anteil von PA3 im Vergleich zum Impfstoff mit PA3 alleine reduziert wird. Die Co-Kultur von PA3/YPEN und RBMS bietet einen etwas besseren Schutz als der PA3-Impfstoff, obwohl der PA3-Beitrag aufgrund der Einsaatkonzentration in der 3D-Kultur wahrscheinlich dreimal geringer ist. Dies lässt darauf schließen, dass die Zell-Co-Kultur in einem verbesserten Repertoire von Antigenen resultiert, die den Tumor in situ eher reflektieren, obwohl der Impfstoff allogen ist.
Tabelle 1 PCR-Analyse von Prostatazellen, die mit Knochenmarkstromazellen co-kultiviert wurden
Tabelle 2 Hinabregulierte Gene in DU-145/NHPSF Co-Kultur
Tabelle 3 Hinaufregulierte Gene in DU-145/NHPSF Co-Kultur
Tabelle 4 Hinabregulierte Gene in DU-145/NHBSF Co-Kultur Spot-Intensität und Verhältnis
Tabelle 5 Hinaufregulierte Gene in DU-145/NHBSF Co-Kultur Spot-Intensität und Verhältnis

Claims

Whole-Cell-Krebsimpfstoff, umfassend: eine immunogene Komponente, die co-kultivierte maligne und nichtmaligne Zellen umfasst; und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein solches Bindemittel oder Verdünnungsmittel.
Whole-Cell-Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die co-kultivierten Zellen eine veränderte Immunogenität haben.
Whole-Cell-Impfstoff nach Anspruch 2, wobei die co-kultivierten Zellen unter Bedingungen kultiviert wurden, die keine konventionellen statischen 2D-Kulturbedingungen waren, und wobei die Immunogenität der co-kultivierten Zellen im Vergleich zur Immunogenität äquivalenter Zellen, die unter konventionellen statischen 2D-Kulturbedingungen co-kultiviert wurden, verändert wurde.
Whole-Cell-Krebsimpfstoff nach Anspruch 2 oder 3, wobei die veränderte Immunogenität durch eine Präsentation von Peptiden auf MHC-1 Molekülen der nichtmalignen Zellen verursacht wird.
Whole-Cell-Krebsimpfstoff nach Anspruch 1, wobei die co-kultivierten Zellen die Form eines Sphäroids haben.
Whole-Cell-Impfstoff nach Anspruch 5, wobei eine oder mehrere der co-kultivierten Zellen des Sphäroids eine veränderte Immunogenität hat/haben.
Whole-Cell-Impfstoff nach Anspruch 6, wobei die co-kultivierten Zellen unter Mikroschwerkraft co-kultiviert wurden und die oder jede co-kultivierte Zelle eine veränderte Immunogenität im Vergleich zu äquivalenten Zellen hat, die unter konventionellen statischen 2D-Kulturbedingungen co-kultiviert wurden.
Whole-Cell-Krebsimpfstoff nach Anspruch 6 oder 7, wobei die veränderte Immunogenität durch die Präsentation von Peptiden auf MHC-1 Molekülen der nichtmalignen Zellen verursacht wird.
Whole-Cell-Krebsimpfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die immunogene Komponente ferner ein Adjuvans umfasst.
Whole-Cell-Impfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die nichtmalignen Zellen autolog und die malignen Zellen allogen sind.
Whole-Cell-Krebsimpfstoff nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die malignen und/oder nichtmalignen Zellen von einer Zelllinie stammen.
Verfahren zur Herstellung eines Whole-Cell-Krebsimpfstoffs, umfassend: das Co-Kultivieren maligner und nichtmaligner Zellen; Ernten der co-kultivierten Zellen; Zugeben der geernteten co-kultivierten Zellen zu einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Bindemittel oder Verdünnungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Zellen unter Bedingungen co-kultiviert werden, die keine konventionellen statischen 2D-Kulturbedingungen sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen unter nichtadhärenten Kulturbedingungen co-kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zellen in nichtadhärenten Kulturgefäßen co-kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen unter adhärenten nichtstatischen Kulturbedingungen co-kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Zellen in Rollerflaschen co-kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen unter Mikroschwerkraft co-kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Zellen Sphäroide unter Mikroschwerkraft bilden und die Sphäroide geerntet und zu dem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Bindemittel oder Verdünnungsmittel gegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen auf in Kulturmedium suspendierten Mikroträgern co-kultiviert werden.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Mikroträger Kügelchen oder Faservliesscheiben sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 21, wobei durch das Co-Kultivieren der Zellen ihre Immunogenität verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Immunogenität der Zellen im Vergleich zu äquivalenten Zellen, die unter konventionellen statischen 2D-Bedingungen co-kultiviert werden, verändert wird.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei die veränderte Immunogenität durch eine Präsentation von Peptiden auf MHC-1 Molekülen der nichtmalignen Zellen verursacht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 24, wobei die nichtmalignen Zellen autolog und die malignen Zellen allogen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 25, wobei die malignen und/oder nichtmalignen Zellen von einer Zelllinie stammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 26, ferner umfassend das Gammabestrahlen der co-kultivierten Zellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 27, wobei die Zellen ECACC 00032802 und/oder ECACC 00032801 umfassen.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Zellen ECACC 00032802 und/oder ECACC 00032801 umfassen.
Impfstoff nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und 29, wobei der zu behandelnde Krebs Prostatakrebs ist.