DE60005154T2

DE60005154T2 - S-nitrosothiole als agentien zur behandlung von fehlfunktionen des kreislaufs

Info

Publication number: DE60005154T2
Application number: DE60005154T
Authority: DE
Inventors: Jose Repolles Moliner; Eduardo Salas Perez-Rasilla; Francisco Pubill Coy; Juan Antonio Cerda Riudavets; Cristina Negrie Rofes; Lydia Cabeza Llorente; Alicia Ferrer Siso; Nuria Trias Adroher; Marcel.Li Carbo Banus; Jes s MURAT MORENO; Pedro Michelena Llaguno
Original assignee: Lacer SA
Current assignee: Lacer SA
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2020-01-20
Also published as: EP1157987B1; IL144381A0; BG105824A; GB0120581D0; DE60005154D1; CA2359027C; ATE249428T1; OA11823A; YU53601A; AU764725B2; ZA200106182B; CZ20012678A3; GEP20043220B; ES2147162A1; RS50072B; BR0007395A; EA200100823A1; IS2153B; HRP20010562B1; KR20010101767A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft neue S-Nitrosothiolderivate von Penicillamin oder Glutathion mit gefässerweiternden Wirkungen, die die Aggregation von Plättchen inhibieren und die daher zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Fehlfunktionen des Kreislaufsystems, insbesondere auf kardiovaskulärer Ebene, nützlich sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist bekannt, dass Verbindungen, die Stickstoffoxid (NO) in den Organismus freisetzen können, in vielen Fällen eine gewisse Aktivität auf das Gefässsystem zeigen, z.B. eine gefässerweiternde Wirkung oder die Inhibierung der Aggregation der Plättchen, was sie potentiell nützlich macht für die Behandlung von verschiedenen Störungen, die mit Fehlfunktionen im Kreislaufsystem in Verbindung stehen.
Weiterhin wurde auch beschrieben, dass bestimmte Derivate, die eine S-Nitrosothiolgruppe enthalten, aufgrund ihrer Fähigkeit, NO in den Organismus freizusetzen, in medizinischer Hinsicht vorteilhafte Eigenschaften aufweisen.
Radomski et al., Br. J. Pharmacol. (1992) 107, 745–749, beschreiben, dass die 5-Nitrosoglutathion (GSNO)-Verbindung die Aktivität von Plättchen inhibieren kann.
Golino et al., Circulation Research, 71, Nr. 6 (1992), beschreiben, dass S-Nitrosocystein aufgrund einer antithrombotischen Wirkung die Aktivität von Plättchen inhibieren kann.
Smith et al., Met. Find. Exp. Cline. Pharmacy. (1994), 16, 5, beschreiben, dass das GSNO eine stark relaxierende Wirkung von Arteriolen herbeiführt.
WO95/12394 beschreibt die Verwendung von S-Nitroso-Addukten von Peptiden, unter anderem dem S-Nitroso-N-acetylpenicillamin (SNAP) als Schutzmittel gegen Gefässentzündungen traumatischen Ursprungs.
WO95/07691 beschreibt die Verwendung von verschiedenen S-Nitrosothiolen, insbesondere dem GNSO, in der Behandlung und Prävention der Wirkung von Plättchen und der Thrombosebildung an der beschädigten Gefässoberfläche.
WO93/08906 beschreibt S-nitrosierte Proteine oder Aminosäurereste, die NO freisetzen können, die eine relaxierende Wirkung auf die Muskulatur und eine inhibitorische Wirkung auf die Plättchenaggregation aufweisen.
EP-B1-412 699 beschreibt S-Nitrosothiole, die der folgenden allgemeinen Formel entsprechen:
und ihre Verwendung als Therapeutika gegen kardiovaskuläre Krankheiten, insbesondere gegen Hochdruck (Bluthochdruck) und als Mittel für die Behandlung von Angina Pectoris. Die Anzahl von möglichen Verbindungen innerhalb dieser Formel ist enorm und die Beschreibung beschreibt explizit nur einige Dutzend solcher Produkte. Weiterhin werden nur Daten entsprechend ihrer allgemeinen gefässerweiternden Wirkung offenbart, und nichts wird erwähnt in bezug auf die Aktivität auf die Plättchen.
Die S-Nitrosothiole, die durch die oben erwähnten Dokumente beschrieben werden, lösen nicht all die komplizierten Probleme bei der Behandlung von vaskulären Störungen, insbesondere auf kardiovaskulärer Ebene. Es ist daher notwendig, neue Verbindungen zu entwickeln, die potenter und wirksamer sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft neue S-Nitrosothiolderivate von Penicillamin und Glutathion, die sowohl eine potente gefässerweiternde Wirkung und eine stark inhibitorische Wirkung auf die Plättchenaggregation aufweisen.
Weiterhin betrifft eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Verwendung der neuen Verbindungen für die Herstellung von neuen Medikamenten für die Behandlung von Störungen, die mit Fehlfunktionen des Kreislaufsystems in Verbindung stehen, insbesondere auf kardiovaskulärer Ebene.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemässen Verbindungen sind S-Nitrosothiolderivate von Penicillamin oder Glutathion und ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze, die der folgenden allgemeinen Formel (I) entsprechen:
worin:
A und B Phenylgruppen sind oder zusammen den Rest -CH₂-Q-CH₂- zur Bildung eines Rings aus sechs Einheiten bilden, wobei Q ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder eine Gruppe N-R³ darstellt, worin R³ Wasserstoff oder eine C_1–4-Alkylgruppe ist;
R¹ ein Acylrest ist, der eine aliphatische C_1–5-Acylgruppe oder der Rest von Glutaminsäure, gebunden über ihr Nicht-Aminosäurecarboxyl, sein kann;
R² eine Hydroxygruppe oder ein Glycinrest ist, gebunden über eine Peptidbindung, ist;
unter dem Vorbehalt, dass, wenn R¹ ein aliphatischer Acylrest ist, R² eine Hydroxygruppe ist, und wenn R¹ ein Glutaminsäurerest ist, R² ein Glycinrest ist.
Folglich entsprechen die erfindungsgemässen Verbindungen den folgenden allgemeinen Formeln (II) oder (III):
wobei A und B die oben erwähnten Bedeutungen haben und R⁴ eine C_1–4-Alkylgruppe ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Bevorzugte Beispiele der Verbindungen innerhalb der erfindungsgemässen Aufgabe sind die folgenden:
N-Acetyl-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomercaptotetrahydropyran)]essigsäure (1):

N-Acetyl-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomercapto-1-methylpiperidin)]essigsäure (2):
N-Acetyl-2-amino-3-benzyl-3-S-nitrosomercapto-4-phenylbutansäure (3):
N-[N-γ-L-Glutamyl-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomercapto)tetrahydropyran)) acetyl]-glycin (4):
N-[N-γ-L-Glutamyl-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomercapto-1-methylpiperidin))acetyl]-glycin (5):
N-[N-γ-L-Glutamyl-2-amin-3-benzyl-3-(S-nitrosomercapto)-4-phenylbutanoyl)-glycin (6):
Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die erfindungsgemässen Verbindungen Chiralitätszentren aufweisen, und dass dies erlaubt, zwischen möglichen Isomeren und/oder Mischungen hiervon zu unterscheiden. Es sollte beachtet werden, dass sowohl Mischungen von Isomeren wie auch reine Isomere innerhalb der erfindungsgemässen Aufgabe liegen. Die letzteren können aus Mischungen von Isomeren durch herkömmliche Techniken, die dem Experten bekannt sind, oder durch asymmetrische Synthese, die diesem auch bekannt ist, erhalten werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können auf verschiedene Weise erhalten werden, und die spezielle Weise wird im allgemeinen von ihrer Grundstruktur abhängen.
Zum Beispiel können die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) gemäss der Reihenfolge der im folgenden Schema veranschaulichten Schritte erhalten werden:
Das heisst, ausgehend von den Hydrochloriden der Aminosäuren, die gemäss bekannten Verfahren erhalten werden (siehe z.B. DE-A-3 023 830 und DE-A-2 801 849), gefolgt von Acylierung der Aminosäurestickstoffgruppe durch herkömmliche Techniken, z.B. durch ein Säurechlorid, wird in einem letzten Schritt dann eine Nitrosogruppe an dem Mercaptanschwefel eingeführt, wiederum durch Verwendung herkömmlicher Techniken.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (III) können gemäss der im folgenden Schema veranschaulichten Reihenfolge von Schritten erhalten werden:
Das heisst, ausgehend von den gleichen Hydrochloriden der Aminosäuren wie oben, gefolgt von Einführen einer Schutzgruppe der Mercaptogruppe durch Bildung eines Thioethers von p-Methylbenzyl. Anschliessend wird eine Schutzgruppe des Aminosäurestickstoffs eingeführt, und hiernach wird das Tripeptid mit den Resten Glutaminsäure und Glycin (Aminosäure C-Endgruppe) in fester Phase durch bekannte Techniken gebildet (siehe z.B. G. Barany et al., The Peptides, 2,1, Gross, E. Meienhofer, Herausgeber: Academic Press, N.Y. (1980); J.M. Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, CA (1969); M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, 2. Aufl., Wiley, N.Y. (1976)).
Die Bildung des Tripeptids umfasst die folgenden Schritte:

(a) verankern der Aminosäure C-Endgruppe Glycin (Gly) in Form eines tert-Butoxycarbonyl (Boc)-Derivats an einem Harz von p-Methylbenzylhydrylamin/Polystyrol.
(b) Entfernen der Boc-Gruppe mit Trifluoressigsäure und Neutralisierung.
(c) Einführen der als Zwischenstufe erhaltenen geschützten, modifizierten Aminosäure.
(d) Bestimmen der Kupplungsreaktion mit Ninhydrin (E. Kaiser et al., Anal. Biochem., 34, 595 (1970)).
(e) Wiederholen der obigen Schritte für den Rest γ-Glutaminsäure (γ-Glu), der als ein Boc-Derivat oder Benzyl-geschützt eingeführt wird (Boc-Glu-OBzl).
(f) Acidolyse mit wasserfreiem HF, um die Schutzgruppen des Tripeptids zu entfernen und es von dem Harz freizusetzen.
(g) Reinigung und Charakterisierung der Endprodukte.

Wenn das Tripeptid gebildet ist, wird als Endstufe mit der Nitrosierung der Mercaptogruppe, von der die Schutzgruppe abgespalten wurde, fortgefahren.
Die durchgeführten Tests zeigen, dass die neuen erfindungsgemässen S-nitrosierten Verbindungen eine gefässerweiternde Wirkung aufweisen, die zumindest vergleichbar mit der des GSNO und in einigen Fällen stark überlegen ist. Weiterhin weisen sie eine inhibitorische Wirkung auf die Aggregation von Plättchen auf, die auch ähnlich oder besser als die von GSNO, in einigen Fällen beträchtlich verbessert ist.
Dies führt dazu, das die erfindungsgemässen Verbindungen in einer sehr wirksamen Weise für die Herstellung eines Medikaments mit gefässerweiternder und antithrombotischer Wirkung für die Behandlung von Fehl funktionen des Kreislaufsystems, insbesondere auf kardiovaskulärer und Herzebene, verwendet werden können.
Folglich können die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und auch ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze, über die Verwendung herkömmlicher pharmazeutischer Techniken für die Herstellung von Medikamenten verwendet werden, die auf verschiedene Weisen verabreicht werden können.
Als ein Beispiel können sie oral in Form von pharmazeutischen Präparaten, wie Tabletten, Kapseln, Sirupen und Suspensionen, verabreicht werden. Parenteral können sie in Form von Lösungen oder Emulsionen usw., verabreicht werden. Sie können auch topisch in Form von Cremes, Pomaden, Balsamen usw. und transdermal z.B. durch Verwendung von Pflastern und Bandagen verabreicht werden. Sie können auch direkt rektal als Zäpfchen angewendet werden. Die Präparate können physiologisch annehmbare Trägermaterialien, Arzneimittelträger, Aktivatoren, Chelatbildner, Stabilisatoren usw. umfassen. Im Fall von Injektionen können physiologisch annehmbare Puffer, Solubilisierungsmittel und isotonische Mittel eingearbeitet werden. Die tägliche Dosis kann in Abhängigkeit von den spezifischen Symptomen, dem Alter, dem Körpergewicht des Patienten, der spezifischen Art der Verabreichung usw. variieren, und eine tägliche Normaldosis für eine erwachsene Person könnte zwischen 0,1 und 500 mg liegen und sie könnte als Einfachdosis oder aufgeteilt auf verschiedene Dosen während des Tages verabreicht werden.
In den Arbeitsbeispielen (vide infra) werden im Detail geeignete Verfahren beschrieben, um die verschiedenen Verbindungen gemäss der allgemeinen Formel (I) zu erhalten. Im Hinblick auf diese Beispiele gehört es zum allgemeinen Wissen des Fachmanns, die Verbindungen, die nicht explizit als Beispiel angegeben sind, über geeignete Modifikationen der Arbeitsbeispiele zu erhalten.
Folglich sollten die Arbeitsbeispiele nicht als den erfindungsgemässen Umfang beschränkend interpretiert werden, sondern nur als eine zusätzliche detaillierte Erklärung, die den Fachmann zu einem tieferen Verständnis der Erfindung führt.
BEISPIELE
Im experimentellen Teil der Beispiele werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
AcOEt: Ethylacetat
AcOH: Essigsäure
Boc: tert-Butoxycarbonyl
Bzl: Benzyl
DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
DCM: Dichlormethan
DIEA: N-Ethyldiisopropylamin
DIP-CI: Direkteinführungsprobe (direct introduction probe) – chemische Ionisierung
DMF: Dimethylformamid
DMSO-d₆: Dimethylsulfoxid-hexadeuterium
EDTA Na₂: Ethylendiamintetraessigsäure-Natriumsalz
EtOH: Ethanol
EtOEt: Diethylether
FAB: schnelle atomare Bombardierung (fast atomic bombardment)
CGMP: cyclisches Guanosin-3',5'-monophosphat
HPLC: Hochdruck-Flüssigchromatografie
McCN: Acetonitril
MeOH: Methanol
MS: Massenspektrometrie
ODQ: [1H-[1,2,4]Oxadiazol[4-3a]chinoxalin-1-on]
PyAOP: Hexafluorphosphat von 7-Azabenzotriazol-1-yl-oxytris(pyrrolidin)phosphonium
tBuOH: tert-Butanol
TFA: Trifluoressigsäure
Die Hydrochloride der Ausgangsaminosäuren werden wie in den deutschen Patentanmeldungen DE-A-3 023 830 und DE-A-2 801 849 beschrieben synthetisiert.
Die kernmagnetischen Resonanzspektren (NMR) wurden mit einem Varian Gemini 200-Apparat aufgenommen.
In den ¹H-NMR-Spektren werden die Arbeitsfrequenz und das verwendete Lösungsmittel zur Aufnahme des Spektrums angegeben. Die Position der Signale wird in 6 (ppm) angegeben, unter Verwendung des Signals der Protonen des Lösungsmittels als Referenz. Die Referenzwerte sind 7,24 ppm für Chloroform und 2,49 ppm für Deuteriumdimethylsulfoxid. In Klammern wird die Anzahl von Protonen angegeben, die dem gemessenen Signal durch elektronisches Integrieren entsprechen, und die Art des Signals wird unter Verwendung der folgenden Abkürzungen angegeben: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), dd (Dublett vom Dublett), sb (breites Signal), sc (komplexes Signal), d.e. D₂O (verschwindet während der Aufnahme des Spektrums nach Zugabe einiger Tropfen deuteriertem Wasser).
In den ¹³C-NMR-Spektren werden die Arbeitsfrequenz und das Lösungsmittel für jedes Spektrum angegeben. Die Position der Signale wird in 6 (ppm) angegeben unter Verwendung des Signals der Protonen des Lösungsmittels als Referenz. Die Referenzwerte sind 77,00 ppm für Chloroform und 39,50 ppm für Deuteriumdimethylsulfoxid.
Weiterhin werden kernmagnetische Resonanzexperimente unter Verwendung des Attached Proton Test (APT) durchgeführt.
Die Analyse durch HPLC, um die Reinheit der Proben zu bestimmen, wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

A – Allgemeiner Gradient: Säule: RP-C18, Symmetrie 150 × 3,9 mm, 5 μm, 100 A Mobile Phase: H₂O+H₃PO₄ 0,1%/CH₃CN + 5% H₂O + 0,1% H₃PO₄ Temperatur: Raumtemperatur Fluss: 1 ml/min Injektionsvolumen: 10 μl
B – Isokratisch: Säule: RP-C18, Symmetrisch 150 × 3,9 mm, 5 μm 100 A Mobile Phase: 50% H₂O+H₃PO₄ 0,1% und 50% CH₃CN + 5% H₂O + 0,1% H₃PO₄ Temperatur: Raumtemperatur Fluss: 1 ml/min Injektionsvolumen: 10 μl

Bei der Herstellung der Tripeptide werden Techniken der präparativen Chromatografie und HPLC verwendet, um das Rohprodukt zu reinigen, und die Identität des Produkts wird durch Massenspektrometrie und Aminosäureanalyse bestätigt. Die Reinheit der Tripeptide wird durch HPLC unter den folgenden Bedingungen analysiert: Säule vom Typ C18 Nucleosyl, 250 × 4 mm, 120 Å, 10 μm; Fluss 1 ml/min; Eluierungsmittel A = H₂O (+0,045% TFA) und B = CH₃CN (+0,036% TFA).
Die Ultraviolettspektren (UV) sind unter Verwendung eines Shimadzu UV-160 A-Spektrofotometers aufgenommen worden. Für jede der Verbindungen wird die Wellenlänge (λ) in nm und die molekulare Absorption (e) in cm-¹ mol^–1 l angegeben.
Für die Hochdruck-Flüssigchromatografie (HPLC) wurde ein Ultraviolett-Photodiodendetektor Hewlett Packard 1040 A verwendet.
BEISPIEL 1 Herstellung von N-Acetyl-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomercaptotetrahydropyran)]essigsäure (1)
Schritt 1: In einen 250 ml-Glaskolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, werden 4,0 g (17,6 mmol) des Hydrochlorids von 2-Amino-2-[4-(4-mercaptotetrahydropyran)]essigsäure und 60 ml einer 0,5 N Lösung von Kaliumhydroxid eingeführt. Danach werden 3,07 g (21,8 mmol) wasserfreies Kaliumcarbonat und 60 ml McCN hinzugefügt. Die Mischung wird in einem Eisbad abgekühlt, und 1,42 ml (19,7 mmol) Acetylchlorid, gelöst in 25 ml McCN, werden hinzugetropft. Zum Schluss wird 0,5 N Kaliumhydroxid hinzugefügt, bis der pH-Wert 9 bis 10 beträgt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Danach wird 2 N Salzsäure hinzugefügt, bis der pH-Wert 6 beträgt, und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. Der erhaltene Feststoff wird unter Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet und in 150 ml absolutem EtOH suspendiert und bei Raumtemperatur gerührt. Der unlösliche Rest wird filtriert und mit absolutem EtOH gewaschen. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. 3,98 g der Zwischenstufe N-Acetyl-2-amino-2-[4-(4-mercaptotetrahydropyran)]essigsäure werden als Rohprodukt erhalten, das verschiedenen präparativen Chromatografieumkehrphasen unterworfen wird, wobei 80 mg des Produkts in 90%-iger Reinheit erhalten werden (HPLC-Gradient A, λ = 205 nm).
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 7,40 (1H, d, J = 10 Hz, NH), 4,13 (1H, d, J = 10 Hz, CH), 3,75–3,50 (4H, s.c., CH₂), 1,90–1,80 (4H, s.c., CH₂), 1,65 (3H, s, CH₃).
¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 171,50 (CO-N), 168,90 (CO), 63,69 (CH₂), 63,27 (CH₂), 62,80 (CH), 49,18 (C), 37,58 (CH₂), 36,12 (CH₂), 23,01 (CH₃).
Schritt 2: 80 mg (0,34 mmol) N-Acetyl-2-amino-2-(4-(4-mercaptotetrahydropyran))essigsäure werden in 4.000 μl MeOH gelöst, und hiernach werden 500 μl 1 N HCl-Lösung und 136 μl 5 M NaNO₂-Lösung hinzugefügt. Die resultierende Lösung wird 1 Minute lang in einem Ultraschallbad behandelt und hiernach werden 50 μl 10 N NaOH und 14 μl H₂O hinzugefügt.
Aus der resultierenden Lösung wird ein Aliquot A zu 470 μl abgetrennt, und zu dem Rest wird Wasser im Überschuss zugefügt, gefroren und lyophilisiert, wobei 190 mg eines hygroskopischen Feststoffs B, der leicht feucht ist, erhalten werden.
HPLC (Gradient A):
λ 220 nm: Reinheit der Fraktion A 68%
λ 339 nm: Reinheit der Fraktion A 95%
NMR-Fraktion B:
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,00–7,50 (1H, s.c., NH), 4,50–4,00 (1H, s.c., CH), 3,80–3,40 (4H, s.c., CH₂), 2,40–1,80 (4H, s.c., CH₂), 1,88 (3H, s , CH₃).
¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 173,0 (CO), 169,52 (CO), 67,69 (CH₂-O), 63,45 (CH), 53,78 (C), 32,17 (CH₂), 22,80 (CH₃).
BEISPIEL 2 Herstellung von N-Acetyl-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomercapto-1-methylpiperidin)]essigsäure (2)
Schritt 1: In einen 250 ml-Glaskolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, werden 3,69 g (13 mmol) 2-Amino-2-[4-(4-mercapto-1-methylpiperidin)]essigsäure-hydrochlorid und 30 ml einer 0,5 N Lösung von Kaliumhydroxid eingeführt. Hiernach werden 2,2 g (16 mmol) wasserfreies Kaliumcarbonat und 30 ml McCN hinzugefügt. Die Mischung wird in einem Eisbad gekühlt, und 1,0 ml (14 mmol) Acetylchlorid, gelöst in 10 ml McCN, werden hinzugetropft. Anschliessend wird 0,5 N Kaliumhydroxid hinzugefügt, bis der pH-Wert 9 bis 10 beträgt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Hiernach wird 2 N Salzsäure hinzugefügt, bis der pH-Wert 6 beträgt, und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. Der erhaltene Feststoff wird unter Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet, und der getrocknete Feststoff wird in 100 ml absolutem EtOH suspendiert und bei Raumtemperatur gerührt. Der unlösliche Rest wird filtriert und mit absolutem EtOH gewaschen und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. 2,8 g des Zwischenprodukts N-Acetyl-2-amino-2-[4-(4-mercaptomethyl piperidin)]essigsäure werden als Rohprodukt erhalten, das verschiedenen präparativen Chromatografieumkehrphasen unterworfen wird, wobei 0,5 g des Produkts in 99 %-iger Reinheit erhalten werden (HPLC Gradient A, λ = 210 nm).
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,35 (1H, d, J = 10 Hz, NH), 4,43 (1H, d, J = 10 Hz, CH), 3,35–3,00 (4H, s.c., CH₂), 2,70 (3H, s, CH₃), 2,20–1,90 (4H, s.c., CH₂), 1,85 (3H, s, CH₃).
¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 170,55 (CO-N), 170,05 (CO), 61,77 (CH), 49,33 (CH₂), 49,28 (CH₂), 46,38 (C), 42,26 (CH₃), 33,05 (CH₂), 33,14 (CH₂), 22, 42 (CH₃) .
Schritt 2: 50 mg (0,20 mmol) N-Acetyl-2-amino-2-[4-(4-mercapto-1-methylpiperidin)]essigsäure werden in 800 μl 1 N HCl gelöst und hiernach werden 80 μl 5 M NaNO₂-Lösung hinzugefügt. Die resultierende Lösung wird 1 Minute lang in einem Ultraschallbad behandelt und hiernach werden 80 μl 10 N NaOH und 40 μl H₂O hinzugefügt.
Von der resultierenden Lösung werden 100 μl eines Aliquots A abgetrennt und der Rest wird eingefroren und lyophilisiert, wobei 190 mg eines Feststoffs B erhalten werden.
HPLC (Gradient A):
λ 230 nm: Reinheit der Fraktion A 90%;
Reinheit der Fraktion B 93%
λ 334 nm: Reinheit der Fraktion A 98%;
Reinheit der Fraktion B 98
NMR der Fraktion B:
¹H-NMR (200 MHz, D₂O): 4,71 (1H, 5, CH), 2,70–2,20 (8H, sc, CH₂), 1,95 (3H, s., CH₃-N), 1,71 (3H, s, CH₃-CO).
¹³C-NMR (50 MHz, D₂O): 172,51 (CO), 171,52 (CO), 61,08 (CH), 58,18 (C), 48,09 (CH₂-N), 48,01 (CH₂-N), 42,18 (CH₃-N), 30,44 (CH₂), 29,85 (CH₂), 20,17 (CH₃-CO).
BEISPIEL 3 Herstellung von N-Acetyl-2-amino-3-benzyl-3-S-nitrosomercapto-4-phenyl-butansäure (3):
Schritt 1: In einen 100 ml-Glaskolben, ausgestattet mit einem Magnetrührer, werden 2,0 g (5,9 mmol) 2-Amino-3-benzyl-3-mercapto-4-phenylbutansäure und 20 ml einer 0,5 N Lösung von Kaliumhydroxid eingeführt. Hiernach werden 1,0 g (7,2 mmol) wasserfreies Kaliumcarbonat und 20 ml McCN hinzugefügt. Die Mischung wird in einem Eisbad gekühlt, und 0,5 ml (6,5 mmol) Acetylchlorid, gelöst in 8 ml McCN, werden hinzugetropft. Im Anschluss wird 0,5 N Kaliumhydroxid hinzugefügt, bis der pH-Wert 12 bis 13 beträgt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Hiernach wird 2 N Salzsäure hinzugefügt, bis der pH-Wert 6 beträgt, und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. Das erhaltene Rohprodukt wird in 100 ml absolutem EtOH suspendiert und bei Raumtemperatur gerührt. Der unlösliche Rest wird abfiltriert und mit absolutem EtOH gewaschen. Das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. Der Rest wird in Wasser umkristallisiert. Der unlösliche Teil wird abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wird eingefroren und lyophilisiert. 1,64 g des Zwischenprodukts, N-Acetyl-2-amino-3-benzyl-3-mercapto-4-phenyl-butansäure, werden erhalten. Ausbeute: 81%.
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 7,68 (1H, d, J = 8 Hz, NH), 7,35–7,05 (10H, sc, CH_ar), 4,36 (1H, d, J = 8 Hz, CH), 3,42–3,02 (2H, sc, CH₂-C_ar) 2,95–2,55 (2H, sc, CH₂), 1,82 (3H, s, CH₃).
¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 172,94 (CO-N), 169,08 (CO), 138,55 (C_ar) 138,16 (C_ar), 132,36 (2CH_ar), 131,89 (2CH_ar), 127,78 (2CH_ar), 127,53 (2CH_ar), 126,44 (CH_ar), 126,26 (CH_ar), 60,16 (CH), 55,62 (C), 43,70 (CH₂), 42,94 (CH₂), 23,14 (CH₃).
Schritt 2: 0,62 g (1,8 mmol) N-Acetyl-2-amino-3-benzyl-3-mercapto-4-phenyl-butansäure werden in 25 ml MeOH gelöst und anschliessend werden 25 ml 1 N HCl und 250 mg einer NaNO2-Lösung in 25 ml H₂O hinzugefügt. Die resultierende Mischung wird 35 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen unter reduziertem Druck unter Anwesenheit von P₂O₅ werden 0,33 g eines Feststoffs erhalten.
HPLC (isokratisch B):
λ 220 nm: Reinheit 91
λ 342 nm: Reinheit 100
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,77 (1H, d, J = 10 Hz, NH), 7,28–7,00 (10H, sc, CH_ar), 5,33 (1H, d, J = 10 Hz, CH), 4,12–3,90 (2H, sc, CH₂), 3,88–3,38 (2H, sc, CH₂), 1,86 (3H, s, CH₃).
¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 171,55 (CO-N), 169,67 (CO-O), 135,51 (C_ar), 135,27 (C_ar), 131,52 (CH_ar), 131,41 (CH_ar), 128,15 (CH_ar), 128,05 CH_ar), 127,04 (CH_ar), 65,13 (CH), 56,11 (CH), 40,91 (CH₂), 40,15 (CH₂), 22,29 (CH₃) .
BEISPIEL 4 Herstellung von N-[N-γ-L-Glutamyl-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomercapto)-tetrahydropyran)acetyl)glycin (4)
Schritt 1: In einen 250 ml-Glaskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, werden 5,8 g (25,5 mmol) 2-Amino-2-(4-(4-mercaptotetrahydropyran))essigsäurehydrochlorid, 4,7 g (25,5 mmol) α-Brom-p-xylol und 100 ml einer 3:1-Mischung von H₂O und EtOH gemischt. 11 ml Triethylamin werden hinzugefügt, eine Argonatmosphäre wird geschaffen, und die Mischung wird 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Weitere 50 ml der 3:1 H₂O/EtOH-Mischung werden hinzugefügt und die Mischung wird weitere 2 Stunden gerührt. Die resultierende Suspension wird filtriert und mit 100 ml Wasser und 50 ml EtOH gewaschen. Ein Feststoff wird erhalten, der unter reduziertem Druck getrocknet wird. 300 ml konzentrierte Salzsäure werden über den Feststoff gegeben und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. Diese Säurebehandlung wird ein zweites mal wiederholt, wobei ein Feststoff erhalten wird, der unter reduziertem Druck getrocknet wird. 1,59 g des erwünschten Zwischenprodukts werden erhalten.
1H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,80–8,30 (3H, sb, H₃N⁺), 7,26 (2H, d, J = 8 Hz, CH_ar), 7,12 (2H, d, J = 8 Hz, CH_ar), 4,03 (1H, s, CH-N), 3,85–3,55 (6H, sc, CH₂-C_ar, CH₂-O), 2,26 (3H, s, CH₃), 2,05–1,08 (4H, sc, CH₂).
¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 168,98 (CO), 136,64 (C_ar), 133,80 (C_ar) 129,55 (CH_ar), 129,29 (CH_ar), 62,36 (CH₂-O), 59,85 (CH-N), 49,15 (C), 32,03 (CH₂), 31,19 (CH₂), 30,84 (CH₂), 20,69 (CH₃).
Schritt 2: 1.004 mg des Hydrochlorids von 2-Amino-2-(4-(4-(p-methyl-benzylmercapto)tetrahydropyran)-essigsäure (3,029 mmol) werden in 20 ml t-BuOH/H₂O (2:1) suspendiert, und 5% NaOH wird hinzugefügt, bis der pH-Wert 9 beträgt. Hiernach werden 3 Äquivalente von Boc₂O hinzugefügt und die Mischung wird 30 Minuten lang umgesetzt, wonach der pH-Wert wiederum auf 9 eingestellt wird. Die Reaktion wird weitere 30 Minuten verlängert und der pH-Wert wird wiederum korrigiert. Durch Vergleich mit der Ausgangsaminosäure unter Verwendung von Dünnschichtchromatografie (DC) wird bestätigt, dass die Reaktion vollständig abgelaufen ist.
Das Produkt wird durch zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit 50 ml Hexan isoliert, und die wässrige Phase wird mit 1 N HCl behandelt, bis der pH-Wert 2 beträgt. Hiernach werden drei Extraktionsschritte mit jeweils 60 ml AcOEt durchgeführt. Die AcOEt-Lösung wird mit wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, und nach Entfernung des Lösungsmittels durch Verdampfen wird das Produkt wiederum in DCM gelöst und wiederum verdampft. Dieser Schritt wird weitere zwei mal wiederholt, wobei 1.191 mg (3,015 mmol) des N-Boc-geschützten Zwischenprodukts erhalten werden.
Das Produkt ist charakterisiert durch:

(a) DC, mit CHCl₃/MeOH/AcOH 85:10:5 als mobile Phase. R_f = 0,48, wobei kein Signal des Ausgangsmaterials beobachtet wird.
(b) HPLC in einem Gradienten von 10 bis 100% von McCN in 30 Minuten und isokratisch bei 100% von McCN über 5 Minuten. Die resultierende Reinheit betrug 96% (220 nm).
(c) Massenspektrometrie durch FAB-Technik: M_berechnet = 395, (M + H⁺)_{experimentell} = 396,0
(d) NMR (CDCl₃): 7,18 (2H, d, J = 8 Hz), 7,09 (2H, d, J = 8 Hz), 5,54 (1H, d, J = 11,2 Hz), 4,44 (1H, d, J = 8,3 Hz), 3,69 (1H, d, J = 11,2 Hz), 3,57 (1H, d, J = 11,2 Hz), 3,75–3,98 (4H, sb), 2,32 (3H, s), 1,26–2,19 (4H, sb) , 1,46 (9H, s).

Schritt 3: Das Tripeptid wird durch Techniken der Festphasensynthese hergestellt, ausgehend von 1.595 mg eines Boc-Gly-OCH₂-Pam-Harzes (Neosystem, Referenz-Nr. RP00801) mit einer Substituierung von 0,63 mmol/g. Die Arbeitsskala beträgt 1,005 mmol.
Das allgemeine Protokoll für die Zugabe der verbleibenden Aminosäuren lautet wie folgt:

(1) Das Harz wird durch fünfmaliges Waschen über 0,5 Minuten mit DCM aufgequollen.
(2) Die Boc-Gruppe wird mit 40 % TFA in DCM, 1 × 1 Minute und 1 × 20 Minuten, entfernt.
(3) Es wird mit DCM gewaschen, 5 × 0,5 Minuten.
(4) Es wird mit Ninhydrin getestet.
(5) Es wird mit DMF gewaschen, 3 × 1 Minute.
(6) Die Kupplung wird über einen Zeitraum von 1,5 Stunden durchgeführt.
(7) Es wird mit DMF gewaschen, 3 × 1 Minute.
(8) Es wird mit DCM gewaschen, 5 × 0,5 Minuten.
(9) Es wird mit Ninhydrin getestet.

In dem Fall, dass der Ninhydrintest im letzten Schritt positiv ist, wird mit den Kupplungsreaktionen unter Wiederholung der Schritte (5) bis (8) fortgefahren.
Die Kupplung wird mit 6 Äquivalenten (Äq) von DIEA, 3 Äq Boc-Aminosäure und 3 Äq aktivem Mittel, welches in diesem Fall PyAOp (Hexafluorphosphat von 7-Azabenzotriazol-1-yl-oxytris(pyrrolidinophosphonium) ist. Für die Kupplung von γ-Glu wird Boc-Glu-(α-OBzl) verwendet.
Im Anschluss an diese Kupplungssequenz wird das resultierende Peptidylharz einer Acidolyse mit HF/p-Kresol (9:1) 1 Stunde lang bei 0°C unterworfen. Nach Verdampfen wird der feste Rest mit wasserfreiem EtOEt extrahiert und hiernach wird das Peptid durch Extraktion mit AcOH 10 % isoliert. Nach Vermindern des Volumens durch Verdampfen wird das Rohprodukt lyophilisiert und ist charakterisiert durch:

(a) HPLC in einem Gradienten von 5 bis 65 % von McCN in 30 Minuten.
(b) MS durch Elektrospraytechnik: M_berechnet = 377, (M + H+)_{experimentell} = 378,2.

Die Menge des Peptids wird durch Aminosäureanalyse quantifiziert: m = 329 mg (0,873 mmol). Bei allen Peptidquantifizierungen wird die Peptidanalyse bei Zugabe eines externen Standards von Ile (Isoleucin) zu den Proben zur Hydrolyse verwendet.
Die Reinigung des Tripeptids (in zwei Chargen) wird durch HPLC in präparativem Massstab durchgeführt. Das verwendete System ist das folgende:

– Säule: C18 Nucleosyl, 200 × 20 mm, 120 Å, 10 μm
– Eluierungsmittel: A = H₂O (+0,1% TFA), B = McCN (+0,1 & TFA)
– Gradient: isokratisch 0% B 40 Minuten lang + Gradient von 0 bis 10% B 40 Minuten
– Fluss: 25 ml/min.

Eine Gesamtmenge von 227 mg (0,602 mmol) des Zwischentripeptids wird erhalten, die charakterisiert ist durch:

(a) HPLC in einem Gradienten von 5 bis 45 % McCN in 20 Minuten. Die resultierende Reinheit beträgt 95 % (220 nm). Der kleine Peak bei 8,4 Minuten wird in relativen Verhältnissen kleiner, bis er durch fortwährendes Verdünnen der aufgetragenen Probe verschwindet. Dementsprechend wird geschlossen, dass er einer Aggregation des Tripeptids (und nicht einer Oxidation) entspricht und wird daher als ein erhaltenes Produkt erachtet.
(b) MS-Elektrospray: M_berechnet = 377 (M + H+)_{experimentell} = 378,2.

Schritt 4: Zu einer Lösung von 14,2 mg (0,38 mmol) des in Schritt 3 erhaltenen Tripeptids in 800 μl 1 N HCl werden 76 μl einer 0,5 M NaNO₂-Lösung hinzugefügt. Es wird 1 Minute lang in einem Ultraschallbad bei Raumtemperatur gerührt, und hiernach werden 80 μl einer 10 N NaOH-Lösung hinzugefügt. Die erhaltene Lösung wird eingefroren und lyophilisiert und der erhaltene Feststoff ist charakterisiert durch:
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,90–8,50 (2H, sb, NH), 5,35 (1H, d, J = 10 Hz, CH), 4,10–3,00 (3H, sc, CH₂, CH), 1,95–1,65 (4H, sc, 2CH₂).
¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 172,18 (CO-N), 171,21 (CO-N), 168,40 (CO-O), 63,03 (CH₂), 62,31 (C), 59,56 (CH), 53,19 (CH), 41,20 (CH₂), 32,94 (CH₂), 31,71 (CH₂), 31,41 (CH₂), 27,12 (CH₂).
HPLC (Verfahren A): λ 220 nm (Reinheit 94 %); λ 334 nm (Reinheit 95 %)
UV: λ 346 nm, ε(H2Ο) 502 cm^-1 mol^-1 l
BEISPIEL 5 Herstellung von N-[N-γ-L-glutamyl-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomercapto-1-methyl-piperidin)acetyl]glycin (5)
Schritt 1: In einen 100 ml-Glaskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, werden 6,4 g (23 mmol) des Dihydrochlorids von 2-Amino-2-(4-(4-mercapto-1-methylpiperidin)essigsäure, 4,3 g (23 mmol) α-Brom-p-xylol und 40 ml einer 1:1-Mischung von H₂O und EtOH gemischt. 13 ml Triethylamin werden hinzugefügt, eine Argonatmosphäre wird geschaffen und die Mischung wird 42 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. von der resultierenden Lösung wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und zu dem erhaltenen Rohprodukt werden 20 ml absoluter EtOH hinzugefügt. Der erhaltene Feststoff wird filtriert und nacheinander mit absolutem EtOH und EtOEt gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet. 2,11 g des Zwischenprodukts, dem Hydrochlorid von 2-Amino-2-(4-(4-p-methylbenzylmercapto)-1-methylpiperidin))-essigsäure, werden erhalten. Ausbeute: 29,6.
Die NMR-Spektren werden in D₂O aufgenommen und als Referenz wird 4,75 ppm für HDO genommen.
1H-NMR (200 MHz, D₂O): 7,28 (2H, d, J = 8 Hz, CH_ar), 7,15 (2H, d, J = 8 Hz, CH_ar), 3,64–3,74 (2H, sc, CH₂-C_ar), 3,62 (1H, s, CH-N), 3,4–3,1 (4H, sc, CH₂-N), 2,76 (3H, s, CH₃-N), 2,24 (3H, s, CH₃), 2,15–1,92 (4H, sc, CH₂).
¹³C-NMR (50 MHz, D₂O): 173,15 (CO), 141,00 (Ca_r), 136,39 (C_ar) 132,58 (CH_ar), 131,95 (CH_ar), 63,57 (CH-N), 52,48 (CH₂)⁺, 50,65 (C), 45,66 (CH₃-N), 34,05 (CH₂), 32,35 (CH₂), 31,28 (CH₂), 22,77 (CH₃).
Schritt 2: Ausgehend von 1.016 mg (2,958 mmol) des in dem vorhergehenden Schritt erhaltenen Zwischenprodukts und unter Weiterverarbeitung in der Weise wie in Schritt 2 von Beispiel 4 werden 1.016 mg (2.490 mmol) des N-Boc-geschützten Zwischenprodukts erhalten, das charakterisiert ist durch:

(a) CCF (mobile Phase CHCl₃/MeOH/AcOH 85:10:5). R_f = 0,32, wobei kein Signal des Ausgangsprodukts beobachtet wird.
(b) HPLC-Gradient von 10 bis 100 % von McCN in 30 Minuten. Die Reinheit beträgt 96 % (220 nm).
(c) MS durch FAB-Technik: M_berechnet = 408 ((M + H⁺)_{experimentell} = 408,9.
(d) MS durch Elektrospraytechnik: (M + H⁺)_{experimentell} = 409,3.

Schritt 3: Die Tripeptid-Zwischenstufe wird unter Verwendung der in Schritt 3 von Beispiel 4 beschriebenen Methode, ausgehend von 794 mg des oben erwähnten Harzes, erhalten. Die Arbeitsskala beträgt 0,5 mmol. Aufgrund der Schwierigkeiten, das Boc-Derivat löslich zu machen, wird N-Methylmorpholin als Base (3 Äquivalente) anstelle von DIEA in der oben erwähnten Kupplungsreaktion verwendet. Nach Einführung von γ-Glu wird das Tripeptid zusammengeführt und die Peptidharzbindung wird durch Acidolyse in der gleichen Weise wie oben beschrieben gespalten. Letztlich wird ein Rohrodukt in 10 % AcOH erhalten, welches lyophilisiert und hiernach quantifiiert wird. 137 mg (0,351 mmol) des Tripeptid-Zwischenprodukts werden erhalen und sind charakterisiert durch:

(a) HPLC, isokratischer Gradient 0 % für 10 Minuten + 5 bis 65 % McCN für 30 Minuten. Es wird beobachtet, dass das injizierte Produkt in Essigsäurelösung am Anfang eluiert wird, was es erforderlich macht, die Aliquots zu lyophilisieren, um die Säure zu eliminieren und das Lyophilisat in 1 mM HCl wieder aufzulösen. So konnte das Peptid in der Chromatografie beobachtet werden, und es eluiert bei 6,8 Minuten in dem verwendeten Graienten.
(b) MS durch Elektrospraytechnik: M_berechnet = 390, (M + H⁺)_{experimentell} = 391,2.

Die Reinigung des Rohprodukts wird durch HPLC in präparativem Masstab mit den bereits in Beispiel 4 beschriebenen Parametern durchgeführt. Es wird auch isokratisch bei 0 % B für 40 Minuten, gefolgt von einem Gradienen von 0 bis 10 % B für 40 Minuten durchgeführt. So werden 107 mg (0,274 mmol) des Produkts erhalten, das charakterisiert ist durch

(a) HPLC-Gradient von 0 % bis 0 % für 10 Minuten plus 0 % bis 30 % für 20 Minuten. Die Reinheit beträgt 94 % (220 nm). Es wird bestätigt, dass der zusätzliche Peak bei 8,0 Minuten in diesem Fall wieder der Aggregation entspricht, und dieser wird dementsprechend dem richtigen Produkt zugeordnet.
(b) MS durch Elektrospraytechnik: M_berechnet = 390 (M + H⁺)_{experimentell} = 391,1.

Schritt 4: Ausgehend von 10,0 mg (0,026 mmol) der in dem vorhergehenden Schritt erhaltenen Tripeptid-Zwischenstufe wird die Nitrosierung wie in Schritt 4 von Beispiel 4 unter Verwendung von 52 μl 0,5 M NaNO₂ durchgeführt. Das erhaltene Produkt ist charakterisiert durch:
¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 171,57 (CO-N), 170,99 (CO-N), 170,76 (CO-N), 168,20 (CO-O), 60,23 (C), 59,53 (CH), 51,57 (CH), 49,02 (CH₂), 42,20 (CH₃), 41,59 (CH₂), 30,49 (CH₂), 29,75 (CH₂), 29,31 (CH₂), 26,05 (CH₂).
HPLC (Verfahren B): λ 220 nm (Reinheit 74 %); λ 334 nm (Reinheit 88 %).
UV: λ 346 nm, ε(H₂O) 198 cm^-1 mol^-1 l
BEISPIEL 6 Herstellung von N-[N-γ-L-glutamyl-2-amino-3-benzyl-3-(S-nitrosomerapto)-4-phenylbutanoyl]glycin (6)
Schritt 1: In einen 100 ml-Glaskolben, ausgestattet mit Magnetrührer, werden 1,25 g (3,7 mmol) des Hydrochlorids von 2-Amino-3-benzyl-3-mercapto-4-phenylbutansäure, 0,68 g (3,7 mmol) α-Brom-p-xylol und 40 ml einer 1:1-Mischung von H₂O und EtOH gemischt. 1,6 ml Triethylamin werden hinzugefügt, und der Grossteil des suspendierten Feststoffs wird gelöst. Eine Argontmosphäre wird geschaffen und die Mischung wird 24 Stunden lang bei Raumemeratur gerührt. Das Ethanol und ein Teil des Triethylamins werden unter reduziertem Druck entfernt. Die resultierende wässrige Suspension wird filtriert und ein weisser Feststoff wird erhalten. Dieser wird durch Umehrphasen-Säulenchromatografie mit CH₃CN-H₂O gereinigt. 100 ml MeOH/HCl (1:1) werden zu dem erhaltenen Feststoff gegeben, und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt. 0,5 g des Zwischenprodukts, Hydrochlorid von 2-Amino-3-benzyl-3-(4-methylbenzylmercapto)-4-phenylbutansäure, werden erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆): 8,95–8,50 (3H, sb, H₃N⁺), 7,45–7,25 (10H, sc, CH_ar), 7,08 (2H, d, J = 10 Hz, CH_ar), 6,98 (2H, d, J = 10 Hz, CH_ar) 4,05 (1H, s, CH-N), 3,55–3,0 (4H, sc, CH₂-C₆H₅, CH₂-C_ar), 2,90–2,60 (2H, sc, CH₂), 2,20 (3H, s, CH₃).
¹³C-NMR (50 MHz, DMSO-d₆): 168,70 (CO), 136,53 (C_ar), 136,00 (C_ar) 134,94 (C_ar), 132,50 (C_ar), 131,18 (CH_ar), 129,169 (CH_ar), 128,90 (CH_ar), 128,26 (CH_ar), 128,02 (CH_ar), 127,07 (CH_ar), 57,06 (CH-N), 53,64 (42,22 (CH₂), 41,65 (CH₂), 31,90 (CH₂-S), 20,48 (CH₃).
Schritt 2: Ausgehend von den zwei im vorhergehenden Schritt erhalteen Fraktionen (180 mg der Reinheit 83 % und 530 mg der Reinheit 94 %) und Fortführen wie in Schritt 2 von Beispiel 4 beschrieben, werden 733 mg (1,45 mmol) des N-Boc-geschützten Zwischenprodukts erhalten und charakterisiert durch:

(a) CCF (CHCl₃-MeOH-HOAc 85:10:5), R_f = 0,63.
(b) HPLC-Gradient von 10 bis 100 % McCN, 30 Minuten, isokratisch 100 %, 5 Minuten, Reinheit: 91 % (220 nm).
(c) EM-MALDI-TOF (Massenspektrum): Matrix von Dihydroxybenzoesäure, M_berechnet = 505 (M + H⁺)_{experimentell} = 528,585 (M+Na)
(d) NMR: Das Vorhandensein der Boc-Gruppe wird bestätigt.

Schritt 3: Die Tripeptid-Zwischenstufe wird erhalten unter Verwendung des in Schritt 3 von Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens, ausgehend von 0,43 mmol des oben erwähnten Harzes. Nach dem Acidolyseschritt wird ein Rohrodukt isoliert, das 14,4 mg (29,96 μmol) der Tripeptid-Zwischenstufe enthält, die charakterisiert ist durch:

(a) Analytisches HPLC, Gradient von 5 bis 65 % in 30 Minuten, Reinheit etwa 95 %.
(b) EM-Elektrospray M_berechnet = 487 (M + H⁺) = M_{experimentell} 488,3.

Schritt 4: Ausgehend von 5,7 mg (0,012 mmol) der im zuvor genannten Schritt erhaltenen Tripeptid-Zwischenstufe wurde die Nitrosierung wie in Schritt 4 von Beispiel 4 beschrieben unter Verwendung von 24 μl 0,5 M NaNO₂ bewirkt. Das erhaltene Produkt ist charakterisiert durch:
HPLC (Verfahren A): λ 220 nm Reinheit 68 %; λ 334 nm Reinheit 86 %.
UV: λ 345 nm, ε(H₂O) 368 cm^-1 mol^-1 l.
BEISPIEL 7
Tests für in vitro-Gefässerweiterung
Das in den Assays verwendete Verfahren ist im wesentlichen dasselbe wie in den folgenden Referenzen beschrieben:

– R.F. Furchgot, "Methods in nitric oxide research", Feelisch & Stamler, Herausgeber, John Wiley & Sons, Chichester, England, Seiten 567 bis 581.
– K. Trongvanichnam et al., Japan. J. Pharmacol. 1996; 71: 167–173.
– E. Salas et al., Eur. J. Pharmacol. 1994; 258: 47–55.

Die Verbindungen werden in fünf verschiedenen Konzentrationen Betetet, bei einem Konzentrationsbereich von 0,001 bis 10 mM, unter Verwendung von 6 bis 9 arteriellen Ringen für jede Verbindung. Die erhaltenen Resultae wurden mit denen für S-Nitrosoglutathion (GSNO) verglichen, das als Refeenzrodukt verwendet wurde.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt und als CE₅₀ (wirksame Konzentration 50) ausgedrückt, die die Konzentration jeder der getesteten Verbindungen ist, bei der sich eine Gefässerweiterung von 50% des zuvor mit 1 μM Norepinephrin kontrahierten, arteriellen Ringes zeigt.
TABELLE 1 Test für Gefässerweiterung
Wie beobachtet werden kann, weisen alle getesteten Verbindungen eine potente gefässerweiternde Aktivität auf, die ähnlich oder besser als die der Referenzverbindung (GSNO) ist, und die Verbindung 2 weist eine gefässerweiternde Aktivität auf, die der des Referenzprodukts stark überlegen ist.
BEISPIEL 8
In vitro-Tests für die Inhibierung der Plättchenaggregation
Das in den Assays verwendete Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie in den folgenden Referenzen:

– J. Loscalzo et al., In: Methods in nitric oxide research (M. Feelisch, J.S. Stamler, Herausgeber), John Wiley & Sons, Chichester, England, Seiten 583 bis 591.
– M.W. Radomski et al, Br. J. Pharmacol. 1987, 92: 181–187.
– E. Salas et al., Br. J. Pharmacol. 1994, 112: 1071–1076.

Die Verbindungen werden in vier verschiedenen Konzentrationen unter Verwendung von Plättchen von 5 bis 23 verschiedenen Spendern getestet. Die erhaltenen Ergebnisse werden mit denen von S-Nitrosoglutathion (GSNO) verliehen, das als Referenzprodukt verwendet wird.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt und sind als IC₅₀ (Inhibieungskonzentration 50) ausgedrückt, welches die Konzentration jeder der geesteten Verbindungen ist, bei der sich eine Inhibierung von 50 % der erhaltenen Aggregation mit einer submaximalen Kollagenkonzentration (1 μg/ml) zeigt.
TABELLE 2 Inhibierungstests der Plättchenaggregation
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, wiesen alle getesteten Verbindungen eine potente inhibierende Aktivität auf die Aggregation der Plättchen auf, die der der Referenzverbindung (GSNO) ähnlich oder überlegen ist, und die Verbindungen (1) und (5) weisen eine inhibierende Wirkung auf die Plättchenggregation auf, die der des Referenzprodukts stark überlegen ist.
BEISPIEL 9
In vitro-Tests der Erhöhung des Intraplättchenniveaus von GMPc
Die in Beispiel 5 erhaltene Verbindung (5) wird in vitro getestet, um ihre Kapazität zu untersuchen, das Intraplättchenniveau von GMPc in einer Präparation von humanen, gewaschenen Plättchen zu erhöhen.
Das in dem Test verwendete Verfahren ist im wesentlichen das gleiche, wie es in den in Beispiel 8 zitierten Referenzen beschrieben ist.
Die Verbindungen werden in vier verschiedenen Konzentrationen unter Verwendung von verschiedenen Plättchen von 5 Spendern getestet. Die erhalenen Resultate werden mit denen von GSNO (Referenzprodukt) und mit den Grundwerten verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt, ausgerückt als pmol/10⁹ Plättchen.
TABELLE 3 Test der Erhöhung des Intraplättchenniveaus von GMPc
Die Verbindung (5) erhöht das Intraplättchenniveau von GMP in ähnlicher Weise wie die GSNO-Referenz. Es sollte erwähnt werden, dass bei Werten nahe dem IC₅₀ die Verbindung (5) Niveaus von GMPc induziert, die niedriger als die von GSNO sind, wenn dieses bei Konzentrationen nahe an seinem IC50 verwendet wird.
BEISPIEL 10
In vitro-Test der Blockierung der Plättchenaggregationsinhibierung
Die verwendete Methode in dem Test ist im wesentlichen die gleiche wie in den in Beispiel 8 zitierten Referenzen beschrieben, und vervollständigt durch die Referenz:

– M.A. Moro et al., Pr. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 1480–5.

Der ODQ wird in vitro getestet, um die Inhibierung der Plättchenggreation zu testen, die durch die erhaltenen Produkte in humanen, gewacheen Plättchenpräparaten erreicht wird.
Die in Beispiel 5 erhaltene Verbindung (5) wird in drei verschiedenen Konzentrationen getestet, in Anwesenheit und in Abwesenheit von ODQ (1 μM) unter Verwendung von Plättchen von 5 verschiedenen Spendern. Die erhaltenen Resultate werden mit denen für GSNO (Referenzprodukt) und mit den Werten in Abwesenheit von ODQ verglichen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 gezeigt und ausgedrückt als Prozentsatz der Inhibierung der maximalen Aggreation.
TABELLE 4 Referenzprodukt (GSNO)
TABELLE 5 Verbindung (5)
Das ODQ (1 μM) kann die inhibierende Wirkung von GSNO und der Verbinung (5) blockieren, wenn die IC₅₀-Dosis der Verbindungen verwendet wird. Bei höheren Dosierungen als IC₅₀ wird die Wirkung der Inhibierung der Aggreation im Fall der Verbindung (5) im Vergleich mit dem Referenzprodukt besser blockiert.

Claims

S-Nitrosothiolderivate von Penicillamin oder Glutathion und ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze, entsprechend der folgenden allgemeinen Formel (I)
worin: A und B Phenylgruppen sind oder zusammen den Rest -CH₂-Q-CH₂- zur Bildung eines Rings aus sechs Einheiten bilden, worin Q ein Sauerstoffatom, ein Schwefelatom oder eine Gruppe N-R³ darstellt, worin R3 Wasserstoff oder eine C_1–4-Alkylgruppe ist; R¹ ein Acylrest ist, der eine aliphatische C_1–5-Acylgruppe oder der Rest von Glutaminsäure, gebunden über ihr Nicht-Aminosäurecarboxyl, sein kann; R² eine Hydroxygruppe oder ein Glycinrest, gebunden über eine Peptidbindung, ist; unter dem Vorbehalt, dass, wenn R1 ein aliphatischer Acylrest ist, R2 eine Hydroxygruppe ist und, falls R¹ ein Glutaminsäurerest ist, R2 ein Glycinrest ist.
S-Nitrosothiole gemäss Anspruch 1, entsprechend der folgenden allgemeinen Formel (II):
worin A und B die oben genannten Werte besitzen und R4 eine C_1–4-Alkylgruppe ist.
Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2: N-Acetyl-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomercaptotetrahydropyran)]essigsäure (1)
Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2: N-Acetyl-2-amino-2-[4-(4-S-nitrosomercapto-l-methylpiperidin)essigsäure (2)
Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2: N-Acetyl-2-amino-3-benzyl-3-S-nitrosomercapto-4-phenyl-butansäure (3)
S-Nitrosothiole gemäss Anspruch 1, entsprechend der folgenden allgemeinen Formel (III):
worin A und B die oben genannten Werte besitzen.
Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 6: N[N-γ-L-Glutamyl-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomercapto)tetrahydropyran)-acetyl]-glycin (4):
Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 6: N[N-γ-L-Glutamyl-2-amino-2-(4-(4-S-nitrosomercapto-1-methylpiperidin)-acetyl]-glycin (5):
Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 6: N[N-γ-L-Glutamyl-2-amino-3-benzyl-3-(S-nitrosomercapto)-4-phenylbutanoyl]-glycin (6):
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine oder mehrere Verbindungen) gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 als Wirkstoff(e), gegebenenfalls zusammen mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten, Aktivatoren, Chelatbildnern und/oder Stabilisatoren.
Verwendung der Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Kreislaufstörungen.
Verwendung gemäss Anspruch 11 von Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Störungen des kardiovaskulären Systems.