DE60005007T2

DE60005007T2 - Robustes autofokussystem für mikroskop

Info

Publication number: DE60005007T2
Application number: DE60005007T
Authority: DE
Inventors: Jan-Mark Geusebroek
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1999-06-04
Filing date: 2000-05-30
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2020-05-31
Also published as: AU5399200A; NZ515390A; CA2374910C; KR20020001883A; ATE249057T1; WO2000075709A1; JP2003501693A; IL146882A0; AU773652B2; ZA200109941B; EP1190271A1; NO20015901L; KR100699445B1; DK1190271T3; NO20015901D0; CA2374910A1; DE60005007D1; EP1190271B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Autofokussystem, insbesondere ein Autofokussystem, das für eine große Bandbreite von verschiedenen Mikroskoptypen geeignet ist, beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, für ein Fluoreszenz-Mikroskop oder ein Phasenkontrast-Mikroskop.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Zusammen mit der Einführung des Hochdurchsatz-Screening gewinnt die quantitative Mikroskopie in der pharmazeutischen Forschung an Bedeutung. Das vollautomatische Gewinnen von Mikroskopbildern ist ein ohne Bedienpersonal ablaufender Vorgang, die Kopplung mit einem automatischen Bildanalysesystem ermöglicht die Untersuchung morphologischer Veränderungen. Time-Lapse- bzw. zeitaufgelöste Versuche zeigen die Auswirkung von Arzneimittelverbindungen auf die Dynamik lebender Zellen. Die histochemische Beurteilung von festen Gewebeschnitten wird zum Quantifizieren pathologischer Veränderungen verwendet.
Ein kritischer Schritt beim automatischen Screening ist die Fokussierung. Schnelle und zuverlässige Autofokusverfahren zum Gewinnen von Mikroskopbildern sind für den Routineeinsatz in großem Umfang unerlässlich. Autofokus ist auch eine Voraussetzung für jedes vollautomatische Mikroskop-basierte Bildverarbeitungssystem, das Bereiche scannen muss, die größer als ein einziges Feld sind. Diese Autofokus-Voraussetzung kann durch mehrere Faktoren zustande kommen, einschließlich der mechanischen Instabilität des Mikroskops und der Ungleichmäßigkeit der Probe und/oder von deren Behälter, z.B. eines Objektträgers aus Glas. Beispielsweise könnte eine thermische Ausdehnung die Ursache für einige Mikrometer Instabilität in Mikroskopen mit Lampen sein, die als ungleichmäßig verteilte Wärmequellen agieren. Mechanische Instabilität kann ebenfalls aus einem Spiel zwischen sich bewegenden Komponenten in dem Tischantriebsmotor und -getriebe des Mikroskops entstehen. Vorzugsweise sollten Autofokus-Algorithmen im Allgemeinen auf eine große Bandbreite von Mikroskop-Modi und eine große Bandbreite von Präparierungstechniken und Probentypen anwendbar sein. Obwohl Autofokussierung in der Literatur ein seit langem bekanntes Thema ist, steht eine solche allgemein anwendbare Lösung nicht zur Verfügung. Die Verfahren sind oft für einen Bildgebungsmodus ausgelegt. Des Weiteren sind die Annahmen hinsichtlich der Bestimmung der Brennebene in der Fluoeszenz-Mikroskopie nicht mit denjenigen in der Phasenkontrast-Mikroskopie kompatibel. Es besteht seit langem ein Bedarf an einem Verfahren, das generell in der Lichtmikroskopie anwendbar ist.
Aus der Fourier-Optik wurde abgeleitet, dass gut fokussierte Bilder mehr Details enthalten aus defokussierte Bilder. Herkömmlicherweise wird eine Fokusauswertung verwendet, um die Detailmenge zu messen. Die Fokuskurve kann durch Sampling der Fokusauswertung für verschiedene Brennebenen geschätzt werden. Einige Beispiele für Fokuskurven sind in den 1A bis 1C gezeigt. Der beste Fokus wird durch Suchen nach dem Bestwert in der Fokuskurve ermittelt. In einem herkömmlichen Näherungsverfahren wird der Wert der Fokusauswertung für einige Fokuspositionen geschätzt. Die Bewertung der Auswertungswerte gibt an, wo die nächste Wertabnahme auf der Fokuskurve erfolgen soll. Durch das fortgesetzte Wiederholen des Prozesses soll die Konvergenz in der Brennebene sichergestellt werden. Ein größerer Nachteil ist, dass bei solchen Optimierungsprozessen 1) eine unimodale Fokusfunktion und 2) ein breitgefasster Extremwert vorausgesetzt wird, um einen breiten Fokusbereich zu erhalten. Die Beispiel-Fokuskurven in den 1A bis 1C zeigen, dass dies im Allgemeinen nicht zutrifft. In Wirklichkeit hängt die Fokuskurve von der Mikroskopein stellung, dem Bildgebungsmodus und den Vorbereitungsmerkmalen ab. Wenn die angenommene Form der Fokuskurve nicht mit der tatsächlichen Fokuskurve übereinstimmt, oder wenn örtliche Extremwerte auftreten, ist die Konvergenz in der Brennebene nicht garantiert, siehe "A comparison of different foucus functions for use in autofokus algorithms", Cytometry 1985; 6: S. 81–91, Groen et al.
Groen et al. schlagen acht Kriterien zum Vergleichen der Leistung von Autofokus-Funktionen vor. Diese sind: 1) Unimodalität bzw. das Vorhandensein eines einzigen Höchstwerts oder Mindestwerts; 2) Präzision bzw. Zusammenfallen von Extremwert und bestem Fokus; 3) Reproduzierbarkeit bzw. ein scharfer Extremwert; 4) Bereich bzw. vertikale Entfernung, über welche die Funktion die Richtung des besten Fokus eindeutig bestimmt; 5) allgemeine Anwendbarkeit bzw. die Fähigkeit, mit verschiedenen Klassen von Bildern zu arbeiten; 6) Unempfindlichkeit gegenüber anderen Parametern bzw. Unabhängigkeit von Einflüssen, wie beispielsweise Änderungen der durchschnittlichen Intensität; 7) Videosignal-Kompatibilität bzw. die Fähigkeit, das gleiche Videosignal zu verwenden wie das, das für die Bildanalyse eingesetzt wird; und 8) Implementierung, das heißt, es sollte möglich sein, die Funktion rasch zu berechnen. Groen et al. schlossen, dass drei Autofokus-Funktionen, d.h. zwei Gradientfunktionen und die Intensitätsabweichung, die besten Leistungen erzielten. Allerdings erzielten einige Autofokus-Funktionen, die bei einem Prüfobjekt gut abschnitten, bei anderen keine gute Leistung, und die Autoren warnen vor einer Extrapolation der Ergebnisse für andere Bildgebungsmodi und Prüfobjekte. Unter Unempfindlichkeit gegenüber anderen Parametern ist die Robustheit gegenüber Rauschen und optischen Artefakten zu verstehen, die allgemein in der mikroskopischen Bildgewinnung vorkommen. Des Weiteren ist bevorzugt zu vermeiden, dass die Unimodalität der Fokuskurve eine absolut notwendige Voraussetzung ist, da Unimodalität in der regelmäßigen Praxis nicht erzielt werden kann. Infolgedessen ist der Bereich der Breite des Extremwerts in der Fokuskurve von geringerer Relevanz.
Die meisten Autofokusverfahren fallen in zwei Kategorien: Positionsabtastung und Bildinhaltsanalyse. Positionsabtastverfahren, wie beispielsweise Interferometrie, erfordern eine unabhängige Kalibrierung der besten Fokusposition und, was noch wichtiger ist, eine einzige klar umrissene Oberfläche, von der Licht oder Schall reflektiert werden sollen. In der Lichtmikroskopie sind häufig zwei reflektierende Oberflächen vorhanden, das Deckglas und der Objektträger. Außerdem können Gewebeproben eine beträchtliche Tiefe aufweisen, und der beste Fokus wird nicht notwendigerweise auf der Oberfläche des Glases erzielt. Diese Probleme machen Scanverfahren bezüglich der absoluten Position für den Einsatz in der Lichtmikroskopie unpraktisch. Funktionen der Bildinhaltsanalyse hängen nur von den Merkmalen ab, die direkt vom Bild gemessen werden. Der beste Fokus wird durch Vergleichen dieser Merkmale in einer Reihe von Bildern ermittelt, die in unterschiedlichen vertikalen Positionen gewonnen wurden. Dieses Autofokusverfahren erfordert keine unabhängige Referenz und wird nicht wesentlich durch zusätzliche reflektierende Oberflächen beeinträchtigt. Die bedeutendste Einschränkung ist die Geschwindigkeit, die von der Videogeschwindigkeit, der vertikalen Neupositionierungszeit, der Funktionsberechnungszeit und dem Suchbereich abhängt.
Die Unsicherheit bei der Anwendung von Autofokus-Testergebnissen von einem Mikroskopverfahren auf ein anderes führte zu der vorliegenden Erfindung. Die Entwicklung der vorliegenden Erfindung umfasste die Untersuchung der Autofokus-Leistung in der Mikroskopie von fluoreszierend angefärbten biologischen Proben. Das Fluoreszenzsignal kann direkt für den Autofokus verwen det werden. Allerdings können Probleme, die von anderen zusammengefasst wurden, wie beispielsweise Chen (Chen L. B.: Fluorescent labeling of mitochondria, in Fluorescence Microscopy in Living Cells in Culture, Teil A, Wanug Y. L. und Taylor D.L., Hrsg., Academic Press, San Diego, 103–123, 1989), die ein Ausbleichen von Fotos und die Bildung von freien Radikalen, Singulett-Sauerstoff und Wärme umfassen, Bedingungen schaffen, unter denen eine Minimierung der Fluoreszenz-Erregung kritisch wird. Die kritischsten Bedingungen treten wahrscheinlich bei der Analyse lebender Zellen auf. Wenn das Signal schwach ist und aus Toxizitätsgründen keine Mittel zum Verhindern eines Ausbleichens von Fotos eingesetzt werden können, könnte das Signal leicht vollkommen verloren gehen in den 5–10 Videobildern der Belichtung, die für Autofokus erforderlich ist. Außerdem sind die Fluoreszenz-Nebenprodukte selbst toxisch, und ein übermäßiges Ausgesetztsein könnte die Ergebnisse verfälschen oder die lebenden Zellen schädigen. Es ist daher wünschenswert, nach einer nicht destruktiven Bildgebungstechnik für den Autofokus zu suchen. Bei der Hellfeld-Mikroskopie erscheinen fluoreszierend angefärbte Zellen nicht angefärbt, wobei sie einen äußerst geringen Kontrast aufweisen. Die Phasenkontrast-Mikroskopie andererseits erzielt Hochkontrastbilder von nicht angefärbten Zellen und ist für Autofokus nützlicher. Es wäre vorzuziehen, wenn ein einziger Autofokus-Algorithmus eine gute Autofokus-Leistung für Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Mikroskopie bereitstellen würde.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Autofokusverfahren bereitzustellen, das allgemein in unterschiedlichen Mikroskop-Modi anwendbar ist.
Eine weitere Aufgabe ist es, ein Autofokusverfahren bereitzustellen, das besonders für eine Einsatzumgebung ohne Bedienpersonal geeignet ist, wie beispielsweise Hochdurchsatz-Screening.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Autofokusverfahren bereitzustellen, das besonders zum Erfassen und Überwachen von Bildern geeignet ist, die sich mit der Zeit verändern.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Autofokusverfahren bereitzustellen, das unanfällig gegenüber störenden Faktoren ist, die allgemein in der Mikroskopie auftreten, wie beispielsweise Rauschen, optische Artefakte und Staub auf der Präparierungs-Oberfläche.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zum Autofokussieren eines optischen Instruments zum Betrachten eines Gegenstands und einen Autofokussierungs-Mechanismus, wie in den Ansprüchen dargelegt.
In dem oben genannten Verfahren, der Vorrichtung und dem Mechanismus kann die räumliche Ausdehnung der Glättungsfunktion manuell oder elektronisch oder durch eine Kombination aus beidem eingestellt werden. Beispielsweise kann die räumliche Ausdehnung manuell eingestellt werden. Der Bediener kann eine Abmessung eines Objekts in dem zu erfassenden Bild eingeben, das für Autofokussierzwecke verwendet werden soll. Alternativ kann ein Standardwert von der Vorrichtung gewählt und ein Fokussierversuch unternommen werden. Wird keine geeignete Fokusauswertung erzielt, kann eine alternative räumliche Ausdehnung für die Glättungsfunktion von der Vorrichtung automatisch ausgewählt werden. Alternativ kann der Bediener einen Bereich eingeben, beispielsweise 1 bis 5 Mikrometer, und die Vorrichtung wählt die räumliche Ausdehnung der Glättungsfunktion basierend auf einem von dem Bereich abgeleiteten Wert aus, beispielsweise den Durchschnittswert oder den niedrigsten Wert, der von dem Bereich abgeleitet wurde. Dieser Wert kann für einen ersten Versuch zur Autofokussierung verwendet werden. Wenn dieser erste Versuch nicht erfolgreich verläuft, kann die Vorrichtung einen anderen Wert wählen, der in dem vom Bediener angegebenen Bereich liegt. Je größer die räumliche Ausdehnung der Glättungsfunktion ist, um so geringer ist das Rauschen in dem Bild, aber um so höher ist auch die Möglichkeit, dass kleine Objekte in dem Bild vom Filter nicht "gesehen" und daher auch nicht für die Autofokussierung verwendet werden. Wenn diese kleinen Objekte Staubpartikel sind, ist das fehlende Erkennen dieser Partikel durch den Filter ein Vorteil. Daher kann ein höherer Wert der räumlichen Ausdehnung fehlerhafte Ergebnisse eliminieren, die durch "Rauschen", wie beispielsweise Staubpartikel, verursacht werden. Die räumliche Ausdehnung sollte nicht zu groß gewählt werden, da sonst die Objekte, die in dem Bild betrachtet werden sollen, kleiner als die räumliche Ausdehnung der Glättungsfunktion sein können, mit dem Resultat, dass die Details des gesuchten Objekts die Konvergenz des Filters in der richtigen Fokusposition nicht mehr aussteuern. Die Möglichkeit zum manuellen oder elektronischen Auswählen der räumlichen Ausdehnung der Glättungsfunktion bietet den Vorteil, dass die optimale Glättungsausdehnung gewählt werden kann, wodurch das Rauschen auf ein Minimum reduziert wird, das Autofokussiersystem gleichzeitig jedoch immer noch die Brennpunktposition basierend auf dem in dem Bild zu erfassenden Objekt auswählen kann.
Im Allgemeinen bestimmt bei allen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die räumliche Ausdehnung des Gradientfilters in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wie das Rauschen aus dem Autofokussiervorgang unter Verwendung des erfassten und gefilterten Bildes ausgeschlossen wird. Ein reales Bild kann große Objekte, die von Interesse sind, eingebettet in einer Matrix von kleinen Objekten umfassen. Beim Filtern des Bildes wirken die kleinen Objekte wie Rauschen. Wenn eine feinkörnige Autofokussiertechnik verwendet wird, stellt sich der Autofokussiermechanismus immer auf die kleinen Objekte ein. Vorzugsweise kann die räumliche Ausdehnung des Gradientfilters in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung durch den Bediener eingestellt werden und/oder ist elektronisch einstellbar. Durch Ändern der räumlichen Ausdehnung des Gradientfilters in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann ein Bereich von kleinen bis großen Objekten in dem Bild von dem Autofokus-Filter gewählt werden. Das heißt, der Beitrag von kleinen oder großen Details in dem Bild zur Fokusauswertung hängt mehr oder weniger von der räumlichen Ausdehnung des Filters ab. Beispielsweise umfasst die vorliegende Erfindung eine Änderung des Werts der räumlichen Ausdehnung des Gradientfilters, wenn keine geeignete Fokusauswertung bei einer ersten Einstellung der räumlichen Ausdehnung erzielt wird. Des Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung ein paralleles Filtern jedes Bildes mit mehreren verschiedenen räumlichen Ausdehnungen für den Filter. Daher werden für jedes Bild, das während des Autofokus-Scans erfasst wird, gleichzeitig mehrere Fokusauswertungen durch die parallele Verarbeitung der Bilddaten mit mehreren verschiedenen räumlichen Ausdehnungen erhalten. Am Ende der Bewegung des zu betrachtenden Objekts wird eine Vielzahl von Fokuskurven erhalten, aus denen die beste ausgewählt werden kann. Die vorliegende Erfindung umfasst auch andere Verfahren zum Erhalten einer geeigneten Fokusauswertung, wenn mit den ersten Einstellungen kein Anfangswert erhalten wird. Wenn beispielsweise anfänglich keine geeignete Fokusauswertung erhalten wird, umfassen das Verfahren und das System in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung einen oder mehrere Neufokussierversuche in Probenfeldern, die dem Feld benachbart sind, in dem keine gute Fokussierung erzielt wurde. Die vorliegende Erfindung umfasst auch das Berechnen einer Vielzahl von Fokusauswertungen für jedes Bild, wobei für jede Berechnung eine andere räumliche Ausdehnung verwendet wird. Um Zeit zu sparen, kann dies parallel erfolgen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine selektive Einstellung des Bereichs der Werte der räumlichen Ausdehnung, die für jedes Bild verwendet wird. Durch die Angabe eines Bereichs versuchen das Autofokussystem und -verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht, sich auf Elemente einzustellen, die zu groß oder zu klein sind.
Es wird nicht vorweggenommen, dass eine spezifische Implementierung des digitalen Gradientfilters in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung sich einschränkend auf die vorliegende Erfindung auswirkt. Beispielsweise kann der digitale Filter implementiert werden als ein Konvolutionsfilter "ter Haar Romey BM, "Geometry driven Diffusion in Computer Vision", Boston, Kluwer academic Publishers, 1999, Seite 439", als ein Rekursivfilter (van Vliet et al. "Recursive Gaussian derivative filters", Proc. ICPR '98, IEEE Computer Soc. Press, 1998, Seite 509–514), als ein morphologischer Filter (van den Boomgaard et al. "Quadratic structuring and functions in mathematical morphology", Mathematical morphology and its application to signal processing", Band 3, 1996) oder ähnliches.
Das Autofokussiersystem, der Mechanismus und das Verfahren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können eine vorteilhafte Verwendung in einem Mikroskop finden.
Die Unteransprüche definieren diskrete Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Die vorliegende Erfindung wird im Anschluss unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A bis 1C sind Beispiele für gemessene Fokuskurven für a) ein Hellfeld-Bild eines angefärbten Neuronalgewebes von Mäusen, b) ein Bild von fluoreszierenden Kügelchen, und c) ein Phasenkontrast-Bild von lebenden PC12-Zellen, einer Ratten-Pheochromocytom-Zellinie.
2 ist eine schematische Darstellung eines Mikroskopsystems, auf das die vorliegende Erfindung angewendet werden kann.
3A bis 3E sind schematische Darstellungen von mathematischen Funktionen, die zum Definieren des Gradientfilters in Übereinstimmung mit Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
4A bis 4F zeigen die Durchschnitts-, Mindest- und Höchst-Fokusauswertungen (Schiedseinheiten) als Funktion der z-Position (optische Achse des Mikroskops), die in Übereinstimmung mit einem Verfahren der vorliegenden Erfindung gemessen wurden, a) quantitative neuronale Morphologie, b) Kardiomyozyt-Dedifferenzierung, c) immunhistochemische Markerdetektion, d) C. Elegans GFP-VM Screening, e) und f) immunzytochemische Markerdetektion, jeweils Nuklei und Immunsignal. Die gemessenen Fokuskurven, die mit "max." und "min." angegeben sind, stellen die Fokusereignisse dar, die zu der niedrigsten und höchsten Auswertung führten, welche die Veränderlichkeit und den Einfluss von Rauschen auf den Schätzwert der Fokusauswertung angibt.
5 ist eine Darstellung zur Veranschaulichung der Auswirkung von verschiedenen räumlichen Ausdehnungen für den Gradientfilter in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
BESCHREIBUNG DER VERANSCHAULICHENDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN:
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf gewisse Zeichnungen und Ausführungsformen beschrieben, doch ist die Erfindung nicht darauf beschränkt, sondern nur durch die Ansprüche. Die vorliegende Erfindung wird auch hinsichtlich eines Mikroskopsystems beschrieben, doch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt, sondern nur durch die Ansprüche. Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung eine vorteilhafte Anwendung in jedem optischen Instrument finden, in dem ein Autofokus von Bedeutung ist. Des weiteren wird die vorliegende Erfindung hauptsächlich unter Bezugnahme auf ein Mikroskop mit einem entlang der optischen Achse des Mikroskops beweglichen Objekttisch beschrieben, doch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt, sondern umfasst optische Instrumente, mit denen eine Fokussierung durch das Einstellen eines Objektivs des optischen Instruments erzielt wird und nicht durch Bewegen des Prüfobjekts. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Kombinationen aus beidem, beispielsweise das Einstellen eines Objekts innerhalb eines ersten Bereichs und, wenn keine geeignete Fokusauswertung erzielt wird, das Bewegen des Objekttischs entlang der optischen Achse, gefolgt von einem weiteren Fokussierversuch.
2 zeigt ein optisches Instrument, ein Mikroskopsystem 1, auf welches das Autofokussystem gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann. Die Hardware-Komponenten des Systems 1 umfassen ein Mikroskop 1, einen motorisierten Tisch 2, der durch ein Paar von XY-Motoren 3 und einen Z-Motor 5 gesteuert wird, eine XYZ-Tisch-Steuervorrichtung 6, eine Videokamera 7, einen Bildprozessor und Host-Prozessor 9 mit einer Video-Bildfangschaltung 8. Ein separater Bildprozessor einschließlich Video-Bildfangschaltung kann bereitgestellt sein, doch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt. Die XYZ-Tisch-Steuervorrichtung steuert die Bewegungen unabhängig in die X-, Y- und Z-Richtungen. Die Z-Richtung verläuft entlang der optischen Achse (Brennachse) des Mikroskops 10. Typischerweise wird der Mikroskoptisch 2 durch die Schrittmotoren oder Gleichstrom-Servomotoren computergesteuert seitlich und vertikal bewegt. Geeignete Komponenten werden des Weiteren im Folgenden in der Beschreibung der Beispiele beschrieben. Das Prüfobjekt 4, das durch das Mikroskop 10 zu betrachten ist, befindet sich auf dem Tisch 2. Lampen, beispielsweise Fluoreszenzlampen und anderes optisches Zubehör, die dem Fachmann bekannt sind, werden nicht beschrieben.
Obwohl die vorliegende Erfindung hauptsächlich unter Bezugnahme auf einen XYZ-Tisch 2 beschrieben wird, (Bewegungen in drei orthogonale Richtungen), ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt. Zum Erzielen einer Fokussierung besteht nur eine Anforderung für eine relative Bewegung zwischen dem Objektiv 11 des Mikroskops 10 und dem Prüfobjekt 4. Es wird nicht vorweggenommen, dass das Verfahren, um dies zu erzielen, eine Einschränkung der vorliegenden Erfindung ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch optische Vorrichtungen, in denen ein Objektiv 11 eingestellt wird, um eine Fokusposition zu bestimmen, anstatt das Prüfobjekt entlang der optischen Achse zu bewegen. In solch einem optischen Instrument kann das Objektiv 11 durch jede geeignete Einstellvorrichtung eingestellt werden, die durch den Host-Prozessor gesteuert werden kann, wie beispielsweise ein piezoelektrischer Objektivpositionierer. Der Positionierer kann sich zwischen dem Objektivrevolver und dem Objektiv 11 befinden. Ein solcher Positionierer ist bei Polytech, PI, Costa mesa, Kalifornien, USA erhältlich, beispielsweise eine Regeleinrichtung E-810.10. Mit solch einem System wird das Objektiv 11 eingestellt, anstatt dass das Prüfobjekt entlang der optischen Achse des Mikroskops bewegt wird. Kombinationen von Objektiv- und Prüfobjektbewegung sind auch im Umfang der vorliegenden Erfindung enthalten.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann die Messung der Fokusauswertung auf der Basis des Energiegehalts eines linear gefilterten Bildes vorge nommen werden. Des Weiteren wird eine optimale Fokusauswertung vorzugsweise durch einen Gradientfilter ausgegeben.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist der Gradientfilter in seiner räumlichen Ausdehnung zu beiden Seiten des Pixels des erfassten Bildes, das verarbeitet wird, begrenzt. Beim digitalen Filtern wird der zu filternde Pixelwert auf eine bestimmte Weise mit Pixelwerten von Pixeln um das gefilterte Pixel kombiniert. Die Glättungsfunktion weist eine räumliche Ausdehnung auf, d.h. sie ist eine Entfernungsfunktion und bestimmt, ob der Wert eines Pixels in einer gewissen Entfernung von dem gefilterten Pixel in den Filtervorgang für dieses Pixel mit einbezogen werden soll oder nicht, und, falls ja, mit welcher Wichtung. Versuche haben gezeigt, dass diese räumliche Ausdehnung nicht weniger als drei Pixel zu beiden Seiten des gefilterten Pixels betragen sollte. Eine reduzierte räumliche Ausdehnung kann zu weniger präzisem Autofokussieren führen oder sogar zur Unfähigkeit, bei manchen Arten von Bildern eine Fokusposition zu finden. Der Gradientfilter kann einen oder mehrere Operatoren umfassen. Beispielsweise kann der Gradientfilter wenigstens einen der folgenden Punkte umfassen:

1) einen Gradientoperator zum Generieren des ersten räumlichen Differentials des Bildes oder das einer höheren Ordnung, gefolgt von einem Glättungsoperator, der die räumliche Ausdehnung des digitalen Filterns zu beiden Seiten des gefilterten Pixels festlegt und begrenzt.
2) einen kombinierten Gradient- und Glättungsoperator, der Gradient- und Glättungsoperationen in einem Durchgang ausführt.
3) einen Glättungsoperator, der auf das Bild angewendet wird, um die räumliche Ausdehnung der an dem Filtervorgang beteiligten Pixel um das gefilterte Pixel zu begrenzen, gefolgt von einem Gradientoperator, um ein erstes räumliches Differential des geglätteten Bildes oder einer höheren Ordnung zu generieren.

In Übereinstimmung mit Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der digitale Gradientfilter eine mathematische Funktion aufweisen, die einen negativen und positiven Zacken um deren Ursprung besitzt, wobei die mathematische Funktion hinsichtlich der räumlichen Ausdehnung darin begrenzt ist, dass sie sich über eine geringere Entfernung oder eine Entfernung gleich der Bildgröße erstreckt, und dass sie sich wenigstens über drei Pixel zu beiden Seiten eines Pixels erstreckt, dessen Wert gefiltert wird. Vorzugsweise weist die Funktion nur einen Nulldurchgang in der räumlichen Ausdehnung auf.
Beispiele von Funktionsarten, die in Ausführungsformen des Gradientfilters in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind, sind in den 3A bis 3E gezeigt. 3A stellt eine Funktion mit ihrer X-Achse als die räumliche Achse in Pixeleinheiten dar, und ihre Y-Achse ist der Wichtungsfaktor, der für das digitale Filtern verwendet wird. Der räumliche Ursprung fällt vorzugsweise mit dem zu filternden Pixel zusammen (wie dargestellt). Die Funktion ist die räumliche Ableitung einer normalen Gaußschen Kurve. Es ist zu sehen, dass die Funktion zwei Zacken aufweist, einen positiven und einen negativen zu beiden Seiten des räumlichen Nullpunkts. Diese Zacken dehnen sich über eine räumliche Entfernung von wenigstens 3 Pixeln zu beiden Seiten des räumlichen Ursprungs aus. Tatsächlich weist die Funktion in dem gezeigten Beispiel nennenswerte Werte bis zu 7 Pixel zu beiden Seiten des Ursprungs auf. Die Auswirkung des Vorzeichenunterschieds der Zacken zu beiden Seiten des räumlichen Ursprungs dient zum Bestimmen eines Gradienten des Bildes, wenn die Funktion zum digitalen Filtern verwendet wird. Innerhalb der Ausdehnung der Funktion, die nennenswerte Werte aufweist, gibt es nur einen Nulldurchgang. Dies ist vorzugsweise am räumlichen Ursprung der Fall, wie in 2A dargestellt, d.h. der Nulldurchgang fällt mit dem zu filternden Pixel zusammen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf eine Ableitung der Gaußschen Kurve als die Funktion beschränkt, die den Gradientfilter definiert. Wie in 3B dargestellt, kann auch eine Besselfunktion ungerader Ordnung verwendet werden, (die Figur zeigt eine Besselfunktion erster Ordnung), oder eine andere Funktion, die positive und negative Zacken zu beiden Seiten des räumlichen Ursprungs besitzt. Wie aus 3B ersichtlich ist, weist die Besselfunktion erster Ordnung zwei Zacken auf, einen positiven und einen negativen zu beiden Seiten des räumlichen Ursprungs. Aufgrund der Tatsache, dass eine Besselfunktion mehr als einen Nulldurchgang besitzt, wird die räumliche Ausdehnung der Besselfunktion vorzugsweise (beispielsweise durch Abbrechen) auf die Entfernung zu beiden Seiten des Ursprungs begrenzt, die innerhalb des ersten Nicht-Ursprungs-Nulldurchgangs liegt, wobei dies in 3B beispielsweise bedeuten würde, die Besselfunktion etwa am vierten Pixel abzubrechen, so dass Werte der Funktion bei höheren Pixelwerten (oder niedrigeren negativen Werten) Null oder vernachlässigbar sind. Dies wird durch die gepunktete Linie dargestellt.
Ein alternatives Näherungsverfahren wäre, die Besselfunktion so zu dämpfen, dass die Anzahl der Nulldurchgänge reduziert wird. Die Funktion in 3C ist eine gedämpfte Version der Besselfunktion erster Ordnung von 3B, wobei die Dämpfungsfunktion x² + 1 verwendet wird. Es ist ersichtlich, dass die Auswirkung der Dämpfung dazu dient, die Y-Achsen-Werte nach dem vierten Pixel effektiv auf Null zu reduzieren. Dementsprechend bricht die Dämpfungsfunktion die Besselfunktion tatsächlich so ab, dass nur ein Nulldurchgang innerhalb des Bereichs ± 3 Pixel vorhanden ist, und die Werte bei höheren Pixelwerten tatsächlich Null sind.
Der digitale Gradientfilter gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht auf eindimensionales Filtern beschränkt, wie dies durch die Filterfunktionen von 3A bis 3C angegeben würde. Eine dreidimensionale Darstellung einer zweidimensionalen Gradientfilterfunktion in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist schematisch in 3D gezeigt. 3D stellt ein zweidimensionales räumliches Differential einer zweidimensionalen normalen Gaußschen Kurve dar . Die X- und Y-Achsen liegen in der Ebene des erfassten Bildes und besitzen Pixelzahlen als Einheiten. Die Z-Achse stellt die Wichtung dar, die auf die relevante Pixelzahl angewendet wird, wie sie im Filterprozess verwendet wird. Der Ursprung 0,0,0 liegt auf dem zu filternden Pixel. Die Funktion weist zwei dreidimensionale Zacken auf, einer davon positiv und einer negativ. Der Ursprung der zwei Zacken fällt vorzugsweise mit dem zu filternden Pixel zusammen. Die Drehung der Ausrichtung der Zacken, wie schematisch in 3E gezeigt, ist ebenso in der vorliegenden Erfindung enthalten und reduziert die Wirksamkeit des Filterns nicht.
In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform des Bildfilters der vorliegenden Erfindung wird eine zweidimensionale Gaußsche Ableitung, wie in 3D dargestellt, in der Ebene des Bildes verwendet, (den x-, y-Koordinaten eines x-y-z-Koordinatensystems, in dem die Richtung z senkrecht zu dem abzubildenden Prüfobjekt verläuft, d.h. die Richtung z verläuft in der Fokussierrichtung), um die Fokusauswertung zu messen. Das σ des Gaußschen Filters bestimmt die Ausdehnung des Filterns und steht mit der Skalierung von markanten Merkmalen in Zusammenhang.
Eine geeignete Fokusfunktion ist:
wobei f (x, y) der Grauwert des Bildes ist, Gx(x,y,σ) und Gy(x,y,σ) die Gaußschen Ableitungen erster Ordnung in der x- und y-Richtung bei Skalierung σ sind, NM die Gesamtanzahl von Pixeln in dem Bild ist, und fx, fy jeweils die Bildableitungen bei Skalierung σ in der x- und y-Richtung sind. Des Weiteren ist eine Diskussion von Gaußschen Gradientfiltern in dem Artikel von ter Haar Romey BM, "Geometry driven Diffusion in Computer Vision", Boston, Kluwer academic Publishers, 1999, Seite 439; und in "Traitement de l'image sur micro-ordinateur", Jean-Jacques Toumazet, Sybex, 1987, Seite 156 bis 158 zu finden, die das Verfahren von J. F. Canny beschreibt.
Häufig lässt sich ein Kompromiss zwischen Rauschempfindlichkeit und Detailempfindlichkeit für eine spezielle Mikroskop-Einstellung beobachten. Beispielsweise ist bei der Fluoreszenz-Mikroskopie das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) häufig niedrig, und es werden relativ glatte Bilder untersucht. Bei der Phasenkontrast-Mikroskopie ist das Signal-Rausch-Verhältnis hoch, und kleine Details (die Phasenübergänge) müssen erfasst werden. Die Autofokussier-Präzision hängt vom Signal-Rausch-Verhältnis ab, wie es sich durch den Fokusauswertungsfilter ausbreitet. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das σ des Gaußschen Filters durch den Bediener frei gewählt werden, so dass es innerhalb des Bereichs von 3 Pixeln zur Größe des Bildes liegt. Der Wert von σ wird vorzugsweise so gewählt, dass das Rauschen in höchstem Maß unterdrückt wird, während die Reaktion auf interessante Details im Bild erhalten bleibt. Bei strichähnlichen Strukturen entspricht der Wert von σ vorzugsweise
wobei die Dicke des Strichs durch d angegeben wird. Angenommen, das kleinste zu fokussierende Detail kann als strichförmig betrachtet werden, dann liefert die Gleichung 2 eine Angabe für den Wert von σ. Die Brennebene des Mikroskops liegt angenommen in einem vordefinierten Intervall Δz um die Start-z-Position z. Der Scannertisch wird in Position z_min = z – ½Δz nach unten bewegt. Eine Gegenbewegungskorrektur wird angewendet, indem eine Näherung an die Fokusposition immer aus der gleichen Richtung erfolgt, d.h. der Tisch wird weiter abgesenkt als erforderlich und wieder in die angegebene Position angehoben. Infolgedessen wird eine mechanische Toleranz in den Zahnrädern ausgeschaltet.
Wenn t = 0 ms beträgt, beginnt die Tisch-Steuervorrichtung damit, den Tisch anzuheben, um das vollständige Fokusintervall Δz zu durchqueren. Während der kontinuierlichen Tischbewegung durch den Fokus werden sukzessive Bilder der Präparierung in Intervallen von 40 ms oder in anderen Standard-Videogeschwindigkeiten aufgenommen. Die Fokusauswertung jedes erfassten Bildes wird anschließend berechnet. In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Bildpuffer für das nächste Videobild wieder verwendet, wodurch nur zwei Bildspeicher-Puffer gleichzeitig aktiv sein müssen. Einer der Puffer wird verwendet, um die Daten bereitzustellen, die für die Berechnung der Fokusauswertung des vorher erfassten Bildes erforderlich sind, während der andere zum Erfassen des nächsten Bildes verwendet wird. Daher wird das Berechnen der Fokusauswertung vorzugsweise innerhalb der Zeit eines Videobildes vorgenommen.
Sobald der Tisch das Ende des Fokusintervalls erreicht hat, wird die Zeitvorgabe bei t = td ms gestoppt. Eine Schätzung der Fokuskurve wird aus den Fokusauswertungs-Ergebnissen für das vollständige Fokusintervall erhalten. Der globale Bestwert in der Schätzung für die Fokuskurve stellt die Brennebene dar, die als die endgültige Fokussierungsposition des Prüfobjekts zu verwenden ist. Jede z-Position wird von der Zeit berechnet, zu der das entsprechende Bild erfasst wurde. Wenn eine lineare Bewegung des Tischs angenommen wird, entspricht die Position, in der das Bild zum Zeitpunkt ti aufgenommen wird,
wobei t_d die Bewegungsdauer darstellt, Δz das Fokusintervall ist, und z_min die Anfangsposition (Position bei t = 0 ms) ist.
Es wurde festgestellt, dass als sicher angenommen werden kann, dass die Fokuskurve um die Brennebene parabolisch verläuft. Davon ausgehend kann eine hohe Fokuspräzision durch quadratische Interpolation erzielt werden. Wenn eine lineare Tischbewegung angenommen wird, bzw. z = V_t + z_min kann die Fokuskurve um die Brennebene annähernd bei s(t) = c + bt + at2 (4)liegen.
Die exakte Fokusposition wird erhalten, indem eine Parabel durch den erfassten Bestwert und deren benachbarte Messungen gelegt wird. Für den erfassten Bestwert wird s (t₀) = s₀ zum Zeitpunkt t = t₀ angenommen. Die Zeitachse kann neu definiert werden, so dass der erfasste Bestwert im Zeitpunkt t = 0 liegt. Danach werden die benachbarten Auswertungen jeweils mit (s_n, t_n) und (s_p, t_p) angegeben. Die Auflösung nach a, b und c ergibt
Die Parabelspitze, und damit die verstrichene Zeit bis zur Fokusposition, werden angegeben durch
Die Brennebene befindet sich in einer Position, die angegeben wird durch:
auf welche das Prüfobjekt bewegt wird, wobei die Gegenbewegungskorrektur berücksichtigt wird.
Die Tiefe des Feldes eines optischen Systems wird als die axiale Entfernung von der Brennebene definiert, über die Details immer noch mit zufrieden stellender Schärfe beobachtet werden können. Die Dicke des Schnitts, der als fokussiert betrachtet werden kann, wird dann angegeben durch:
wobei n der Brechungsindex des Mediums ist, λ die Wellenlänge des verwendeten Lichts und NA die numerische Apertur des Objektivs. Die Fokuskurve wird bei Nyquistfrequenz abgenommen, wenn mit z_d-Intervallen gemessen wird. Normale Video-Hardware nimmt Bilder mit einer festgelegten Geschwindigkeit auf. Daher kann die Abnahmedichte der Fokuskurve nur durch Einstellen der Tischgeschwindigkeit auf eine Bewegung von z_d μm pro Videobild-Zeit beeinflusst werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch zusätzliche Verfahrensschritte, wenn die Fokusauswertung nach dem Filtern mit einem Wert von σ nicht gut genug ist, oder wenn der Versuch, die Fokusauswertung in ein Polynom, beispielsweise eine Parabel zu fassen, nicht erfolgreich ist, d.h. wenn kein ausgeprägtes Maximum in den Fokusauswertungen vorhanden ist. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Filterschritt mit einem anderen Wert von σ wiederholt werden. Dieser zweite Wert von σ kann automatisch durch den Host-Prozessor 9 eingestellt werden. Wenn beispielsweise keine geeignete Fokusauswertung oder ein Höchstwert daraus erzielt werden kann, kann der Host-Prozessor 9 den Wert von σ erhöhen und die Fokussierungsschritte wiederholen. Alternativ oder zusätzlich können, wenn keine geeignete Fokusauswertung oder ein Höchstwert aus der Fokusauswertung erzielt wird, ein Feld des Prüfobjekts, das dem zum Fokussierversuch verwendeten Feld benachbart ist, ausgewählt und die Fokussierungsschritte in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden. Dieser Prozess kann durch die elektronische Einstellung verschiedener Werte von σ auf die neue Feldposition und das erneute Wiederholen der Fokussierungsschritte ausgedehnt werden. Nach einer vorgegebenen Anzahl von Fehlschlägen kann der Autofokusvorgang beendet werden, und das relevante Feld bzw. Prüfobjekt kann auf bestimmte Weise gekennzeichnet werden, um anzugeben, dass eine Fokussierung nicht möglich war.
Vorzugsweise kann die räumliche Ausdehnung σ des Gradientfilters in Übereinstimmung mit der vorliegencen Erfindung zum Optimieren der Rauschunterdrückung und der Objektlage eingestellt werden. In Übereinstimmung mit bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der Bediener eine räumliche Ausdehnung für den Fokussierungsprozess eingeben. Beispielsweise kann der Bediener einen Wert von 3 Mikrometer in den Host-Prozessor 9 aus 2 eingeben. Der Prozessor berechnet den Wert von σ auf der Basis von Gleichung 2 und verwendet diesen für den Gradientfilter. Alternativ gibt der Bediener einen Bereich in den Host-Prozessor 9 ein, beispielsweise 2 bis 5 Mikrometer. Der Host-Prozessor 9 ist programmiert, einen Wert aus diesem Bereich auszuwählen, beispielsweise den Mittelwert 3,5 oder den niedrigsten Wert von 2 Mikrometern, und den Wert σ aus der Gleichung 2 unter Verwendung dieses Werts zu bestimmen. Wenn die Fokussierung nicht erfolgreich ist, d.h. die Fokusauswertungswerte nicht angemessen sind oder kein Höchstwert gefunden wird, kann der Host-Prozessor 9 nacheinander und automatisch andere Ausdehnungswerte innerhalb des Bereichs auswählen, der vom Bediener eingegeben wurde. Alternativ kann der Prozessor Werte für σ ohne Bedienereingabe wählen. Beispielsweise kann er mit einem Standardwert beginnen und andere Werte wählen, wenn sich dies als nicht erfolgreich herausstellt. Der exakte Wert von σ ist unkritisch, und der digitale Filter in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist robust. Wie in 5 dargestellt, wird die gleiche Fokussierungsposition über eine Reihe von σ-Werten identifiziert.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Berechnen der Fokusauswertung für jedes Bild an jeder Z-Position mit einer Vielzahl von σ-Werten, beispielsweise σ₁, σ₂ ... σ_N. Dies kann parallel erfolgen. Die Obergrenze hinsichtlich der Anzahl von σ-Werten N kann nur durch die Fähigkeit des Host-Prozessors 9 begrenzt werden, die Fokusauswertungen innerhalb einer angemessenen Zeit zu berechnen. Wenn die Fokusauswertungen 1–N für alle Bilder berechnet worden sind, wird jeder Satz von Auswertungen, der mit einem σ-Wert verbunden ist, über eine geeignete Kurve gelegt, beispielsweise ein Polynom, um die Fokusposition wie oben beschrieben zu erhalten. Das Ergebnis ist ein Satz von N Fokuspositionen oder weniger, wenn einige der σ-Werte nicht zu einer Fokusposition führten. Verschiedene Algorithmen können angewendet werden, um die beste Fokusposition aus den erzielten Fokuspositionen zu erhalten. Beispielsweise wird vorweggenommen, dass mehrere der Fokuspositionen die gleichen oder annähernd die gleichen sein werden. Daher kann es eine Ansammlung von Fokuspositionen geben. Die Ansammlung kann durch digitale Verarbeitungstechniken extrahiert werden, beispielsweise durch Eliminieren extremer Fokuspositionen, die mehr als eine dreifache Standardabweichung (kleinste Quadrate) aufweisen, aus der durchschnittlichen Fokusposition, die aus dem Satz von Fokuspositionen berechnet wurde. Anschließend wird eine durchschnittliche beste Fokusposition als die Fokusposition gewählt.
Die Anzahl verschiedener σ-Werte N muss im Allgemeinen nicht groß sein. Da der Wert von σ bestimmt, welche Elementgröße durch den Filtervorgang für die Autofokussierung gewählt wird, verändern kleine Änderungen von σ im allgemeinen den festgelegten Brennpunkt nicht besonders viel (siehe 5). Daher kann ein breitgefasstes σ verwendet werden. Zweitens ist es in Bezug auf den Filter unerwünscht, große oder kleine Elemente des Bildes auszuwählen, die nicht mit dem gewünschten fokussierten Objekt in Zusammenhang stehen. Daher wird in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn der Bereich der σ-Werte durch den Bediener eingestellt werden kann. Auf diese Weise hat der Bediener einige Kontrolle darüber, welche Elemente des Bildes für die Autofokussierung ausgewählt werden.
Zum Berechnen der Fokusauswertung innerhalb der Videobild-Zeit für aktuelle Sensoren und Computersysteme wird vorzugsweise eine Normierung der Fokus-Funktionsgleichung 1 mit den aktuellen Rechnergeschwindigkeiten in Erwägung gezogen, doch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt. Bei biologischen Präparierungen können Details isotrop über das Bild verteilt werden. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Filterfrequenzgang in einer Richtung für die Bestimmung der Brennebene verwendet. Weitere Rechenzeit kann durch Schätzen des Filterfrequenzgangs aus einem Bruchteil der Scanzeilen in dem Bild eingespart werden. Danach kann die Fokusfunktion angegeben werden durch
Beispielsweise kann jede sechste Zeile (L = 6) angewendet werden. Eine rekursive Implementierung der Gaußschen Ableitung wird verwendet, für welche die Rechenzeit unabhängig vom Wert von σ ist. Die Berechnungszeit könnte bei allen eingesetzten Computersystemen unter 40 ms gehalten werden, selbst wenn auf dem System gleichzeitig andere Prozesse gefahren werden. Der Vergleich zwischen der Fokuskurve in zwei Dimensionen für Gleichung 1 des Gesamtbildes und dem Frequenzgang von Gleichung 9 zeigt nur geringfügige Unterschiede bei allen Versuchen auf.
Zum Gewinnen mehrerer ausgerichteter Bilder aus großen, flachen Präparierungen wird die Abweichung in Bezug auf die Fokusposition als gering, bei starken Vergrößerungen jedoch als bemerkbar angenommen. Korrektes Gewinnen von benachbarten Bildern kann durch Fokussierung auf einige Felder erzielt werden. Innerhalb der Präparierung beginnt eine Prozedur in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit der Fokussierung des ersten Felds. Felder, die das fokussierte Feld umgeben, werden erfasst, bis dem nächsten zu erfassenden Bild eine Entfernung von dem ursprünglich fokussierten Feld zugewiesen wird. Eine Abweichung vom besten Fokus wird jetzt durch Fokussierung über ein kleines Intervall korrigiert. Die Präparierung wird abgetastet, wobei die Fokusposition in Feldern beobachtet wird, die weiter als eine bestimmte Entfernung vom nächstgelegenen aller vorher fokussierten Felder liegen. Die Schwellenwert-Entfernung, bei der keine Fokussierung erfolgt, hängt von der Flachheit der Präparierung und der Vergrößerung ab und muss hinsichtlich der Effizienz empirisch optimiert werden. Felder, die bei der Fokussierung übersprungen wurden, sind auf der Brennebene des nächstgelegenen fokussierten Felds positioniert. Kleine Abweichungen in der Fokusposition beim Scannen der Präparierung werden während der Bildgewinnung korrigiert.
Der Autofokus-Algorithmus in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde in den folgenden Anwendungen getestet: a) quantitative neuronale Morphologie, b) Time-Lapse- bzw. zeitaufgelöste Versuche zur Kardiomyozyt-Dedifferenzierung, c) immunhistochemische Markerdetektion in festem Gewebe, d) C. Elegans GFP-VM Screening und e) immunzytochemische Markerdetektion in Festzellen. Jede dieser Anwendungen wird im Folgenden beschrieben. Das Software-Paket SCIL-Image Version 1.4 (16) (TNO-TPD, Delft, Niederlande) wird zur Bildverarbeitung verwendet, erweitert um den Autofokus-Algorithmus und Funktionen zur automatischen Tischsteuerung und Bildaufnahme in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
Quantitative neuronale Morphologie im Hellfeld-Modus
Morphologische Veränderungen von Neuronen wurden automatisch quantifiziert, wie dies beschrieben wurde in "Sodium butyrate induces aberrant tau phosphorylation and programmed cell death in human neuroblastoma cells", Brain Res. 1995, 688, Seite 86–94. Kurz gesagt, PC12-Zellen wurden in mit Poly-L-Lysin (Sigma, St.Louis, MO) beschichteten 12-Mulden-Platten positioniert. In jeder Mulde wurden 5 × 10⁴ Zellen ausgesät. Nach 24 Stunden wurden die Zellen für die Dauer von 10 Minuten mit 1% Glutaraldehyd fixiert. Anschließend wurden die Zellen zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Platten wurden in einem Inkubator getrocknet.
Die Platten wurden mit dem Objektiv 5 × NA 0,15 Plan-Neofluar im Hellfeld-Beleuchtungsmodus auf einem Mikroskop Axiovert 10 (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) untersucht. Ein Scannertisch (Tisch und MAC4000-Steuereinrichtung, Märzhäuser, Wetzlar, Deutschland) wurde für die automatische Positionskontrolle verwendet. Beim Einschalten wurde der Tisch kalibriert und eine erste Brennebene manuell angegeben. Die verwendete Kamera war eine MX5 (Adaptec, Eindhoven, Niederlande) 780 × 576 Videobild-Übertragungs-CCD mit einer Pixelgröße von 8,2 × 16,07 μm², die bei Raumtemperatur mit abgeschalteter automatischer Verstärkung arbeitete. Benachbarte Bilder wurden mit einer Indy R4600 Workstation mit 132 MHz erfasst (Silicon Graphics, Mountain View, CA). Als Ergebnis wurde ein 8 × 8 Mosaikbild, das einen Bereich von 6,7 × 6,7 mm² abdeckte, für jede Mulde elektronisch auf einer Diskette gespeichert. Vor dem Erfassen der Mulde wurde eine Autofokussierung in der Mitte des Scanbereichs ausgeführt. Die kleinsten zu fokussierenden Details waren die Neuriten, die etwa 3 Pixel dick waren, was σ = 1,0 (Gleichung 2) ergab. Es stellte sich heraus, dass die Veränderlichkeit der z-Position der Mulden in einem Bereich von 500 μm lag, der als Fokusintervall verwendet wurde. Die Wellenlänge der Beleuchtung betrug 530 nm, was zu einer Feldtiefe von 23,6 μm führte (Gleichung 8). Daher wurde die Tischgeschwindigkeit während der Fokussierung auf 24,7 μm pro Videobild reduziert (10.000 Schritte pro Sekunde). Aufgrund der geringen Vergrößerung war eine Gegenbewegungskorrektor nicht notwendig.
Quantitative neuronale Morphologie – Ergebnisse
4A zeigt die Durchschnitts-Fokuskurve für 180 Mulden, die laut einem Versuchsbeobachter alle präzise fokussiert waren. Die gemessene Fokuskurve mit der niedrigsten Maximalauswertung (Spitze bei 0,004) befindet sich bei einem Feld, das nur einige tote Zellen enthält. Die Abweichung in der Fokusauswertung ist auf die unterschiedliche Anzahl von Zellen und deren Morphologie zurückzuführen. Der lokale maximale Unterfokus wird durch eine Phasendrehung um 180° in der Punktverbreiterungsfunktion bzw. Point Spread Function des optischen Systems verursacht.
Die für die Fokussierung benötigte Gesamtzeit betrug 1,7 Sekunden pro Feld, wobei 7,5% der Zeit zum Erfassen einer 12-Mulden-Platte (4,5 Minuten) verbraucht wurden. Für diese gründlich angefärbten Präparierungen konnte das Autofokusverfahren alle Felder fokussieren. Selbst bei Feldern, die nur einige tote Zellen enthielten, wurde die Brennebene exakt bestimmt.
Kardiomyozyt-Dedifferenzierung im Phasenkontrast-Modus Kardiomyozyten wurden aus adulten Rattenherzen (ca. 250 Gramm) durch Collagenase isoliert, wie dies beschrieben ist in Donck LV, Pauwels PJ, Vandeplassche G, Borgers M, "Isolated rat cardiac myocytes as an experimental model to study calcium overload: the effect of calcium-entry blockers", Life Sci 1986; 38: 765–772. Die Zellsuspension, die Kardiomyozyten und Fibroblaste enthielt, wurde in mit Laminin beschichtete Kunststoff-Petrischalen gesät, mit M199 ergänzt und für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden nicht anhaftende und/oder tote Zellen durch eine einmalige Spülung mit M199 gewaschen. Die Petrischalen wurden mit M199 + 20% fetalem Kälberserum gefüllt und bei 37°C inkubiert.
Die Petrischalen wurden mit dem Objektiv 32 × NA 0,4 Achrostigmat Phase 1 im Phasenkontrast-Modus auf einem Mikroskop Axiovert 35 (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) untersucht. Während des Experiments wurde die Umgebungstemperatur auf 37°C gehalten. Zeitaufgelöste Aufzeichnungen (15 Stunden) wurden in 6 manuell ausgewählten Feldern, eines in jeder der 6 Petrischalen, vorgenommen. Ein Scannertisch (Tisch und MAC4000-Steuervorrichtung, Märzhäuser, Wetzlar, Deutschland) fuhr die ausgewählten Felder in Intervallen von 120 Sekunden an. Die Felder wurden mit einer CCD-Kamera (TM-765E, Pulnix, Alzenau, Deutschland) erfasst. Sie wurden komprimierten JPEG-Digitalfilmen (Indy-Workstation mit Cosmo-Kompressorkarte, SGI, Mountain View, CA) hinzugefügt, jeweils einem für jedes gewählte Feld. Die Autofokussierung wurde einmal pro Zyklus angewendet, wodurch alle Felder in 6 Zyklen nacheinander erneut fokussiert wurden. Die kleinsten zu fokussierenden Details waren die Zellgrenzen, die weniger als 4 Pixel dick waren, was σ = 1,0 (Gleichung 2) ergibt. Die Veränderlichkeit in der z-Position zwischen Fokusereignissen wurde im Bereich von 100 μm erwartet, der als das Fokusintervall verwendet wurde. Die Wellenlänge der Beleuchtung betrug 530 nm, was zu einer Feldtiefe von 3,3 μm führte (Gleichung 8). Daher wurde die Tischgeschwindigkeit während der Fokussierung auf 2,5 μm pro Videobild (1.000 Schritte pro Sekunde) reduziert.
Kardiomyozyt-Dedifferenzierung – Ergebnisse
4B zeigt die durchschnittliche Fokuskurve (75 Ereignisse) für ein Feld der Zeitauflösung. Alle Felder waren gemäß Versuchsbeobachtern während der 15 Stunden der Aufzeichnung perfekt fokussiert. Die Abweichungen in der Fokusauswertung waren auf Änderungen des Bildin-halts zurückzuführen, die durch die Bewegung von Fibroblasten und die Dedifferenzierung der Myozyten verursacht wurden. Die axiale Verschiebung aus der ursprünglichen Brennebene während der Aufzeichnung der sechs Positionen schwankte um 3 μm bis zu 27 μm. Die für die Fokussierung benötigte Zeit betrug 2,8 Sekunden pro Feld.
Ratten-Kardiomyozyten sind dafür bekannt, sich in Kulturen spontan zu dedifferenzieren, d.h. sie breiten sich aus, verflachen und entwickeln Pseudopoden-ähnliche Prozesse. Trotz dieser Änderungen im Bildinhalt während des Experiments war nicht einer der Zeitauflösungsfilme zu irgendeinem Zeitpunkt defokussiert.
Immunhistochemische Markerdetektion im Hellfeld-Modus
Schnitte der Amygdala von Mäusen, in die eine toxische Verbindung injiziert wurde, wurden durch die Injektionsstelle in Schnitte von 15 μm Dicke geschnitten. Anschließend wurden sie hinsichtlich des Vorkommens des Antigens immunologisch angefärbt, wobei ein polyklonaler Antikörper (44-136, Quality Control Biochemicals Inc., Hopkinton, MA) verwendet wurde, und unter Verwendung des chromogenen DAB sichtbar gemacht.
Vier Mikroskop-Objektträger (40 Gehirnschnitte) wurden auf dem Tisch eines Axioskop-Mikroskops (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) befestigt und mit einem Objektiv 2,5 × NA 0,075 Plan-Neofluar im Hellfeld-Beleuchtungsmodus untersucht. Ein Scannertisch (Tisch und MC2000-Steuervorrichtung, Märzhäuser, Wetzlar, Deutschland) wurde für die automatische Positionskontrolle verwendet. Benachbarte Bilder wurden erfasst (Meteor/RGB Framegrabber, Matrox, Donval, Quebec, Kanada, in einem Optiplex GXi PC mit Pentium 200 MHz MMX, Dell, Round Rock, TX) unter Verwendung einer MX5 CCD-Kamera (Adaptec, Eindhoven, Niederlande).
Als Ergebnis wurden Mosaike von vollständigen Gehirnschnitten elektronisch auf Diskette gespeichert. Vor dem Erfassen wurde eine Autofokussierung in etwa der Mitte des Gehirnschnitts ausgeführt. Das kleinste zu fokussierende Detail war die Gewebestruktur, die etwa 3 Pixel dick war, was σ = 1,0 (Gleichung 2) ergibt. Die Veränderlichkeit in der z-Position zwischen den Glas-Objektträgern stellte sich als im Bereich von 1000 μm heraus, der als das Fokusintervall verwendet wurde. Die Wellenlänge des ausgestrahlten Lichts betrug 530 nm, was zu einer Feldtiefe von 94 μm führte (Gleichung 8). Daher wurde die Tischgeschwindigkeit während der Fokussierung auf 98,7 μm pro Videobild (40.000 Schritte pro Sekunde) reduziert. Aufgrund der geringen Vergrößerung war keine Gegenbewegungskorrektur notwendig.
Immunhistochemische Markerdetektion – Ergebnisse
4C zeigt die durchschnittliche Fokuskurve für Rattengehirn-Schnitte. Von den 100 untersuchten Feldern enthielten 2 Felder keinen für die Fokussierung ausreichenden Kontrast. Diese sind nicht in 4C aufgenommen. Die Abweichung in der Fokusauswertung wurde durch die Kontrastunterschiede zwischen den Schnitten verursacht.
Die für die Fokussierung benötigte Zeit betrug 1,5 Sekunden pro Feld, wobei 7% der Zeit zum Erfassen eines Glas-Objektträgers (3 Minuten) verbraucht wurden. Das Autofokusverfahren war in der Lage, 98% der Felder zu fokussieren. Der Kontrast in den restlichen Feldern war für eine präzise Fokussierung zu niedrig.
C. Elegans GFP-VM Screening im Fluoreszenz-Modus
Einzelne, zur GFP-Expression von Vulvamuskeln (GFP-VM) transgene C. Elegans Fadenwürmer wurden aus dem Bestand ausgewählt, und ein junger adulter Hermaphrodit (P₀) wurde in jede der 60 Mittenmulden einer 96-Mulden-Platte eingesetzt (Costar, Acton, MA), die mit einem natürlichen Wachstumsmedium gefüllt waren, und fünf Tage lang bei 25°C inkubiert, um den F1-Nachkommen das Erreichen der adulten Stufe zu ermöglichen.
Vor der Bildgewinnung wurden fluoreszierende Kügelchen (F-8839, Molecular Probes, Eugene, OR) zu den Mulden als Hintergrund-Marker für den Fokusalgorithmus hinzugefügt. Die Muldenplatte wurde mit einem Objektiv 40 × NA 0,6 Archoplan im Fluoreszenz-Modus auf einem Mikroskop Axiovert 135 (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) untersucht. Ein FITC-Filter (B, Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) wurde in Kombination mit einer 100 W starken Xenbophot-Lampe zum Erregen des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) verwendet. Bilder wurden erfasst (O2- Workstation R5000 180 MHz, Silicon Graphics, Mountain View, CA) unter Verwendung einer verstärkten CCD-Kamera (IC-200, PTI, Monmouth Junction, NJ). Der Scannertisch (Tisch und MC2000-Steuervorrichtung, Märzhäuser, Wetzlar, Deutschland) wurde zum Erfassen benachbarter Bilder kalibriert. Jede der ausgewählten Mulden wurde gescannt und die benachbarten Bilder, welche die Mulde vollständig bedeckten, wurden elektronisch auf einer Diskette gespeichert. Es stellte sich heraus, dass die Veränderlichkeit in der z-Position zwischen der Mitte der Mulden in einem Bereich von 250 μm lag, der als Fokusintervall verwendet wurde. Nach dem Autofokussieren auf die Muldenmitte wurde die Abweichung vom besten Fokus während des Scanvorgangs der Mulde korrigiert. Es stellte sich heraus, dass eine Autofokussierung bei Feldern, die mehr als 3 Felder von einem fokussierten Feld entfernt lagen, über ein Fünftel des Fokusintervalls (50 μm) ausreichend war. Die fluoreszierenden Kugeln wiesen einen Durchmesser von 30 Pixeln auf, was σ = 8,5 (Gleichung 2) ergab. Die Wellenlänge des ausgestrahlten Lichts betrug 530 nm, was zu einer Feldtiefe von 1,47 μm führte (Gleichung 8). Der Durchmesser der fluoreszierenden Kugeln betrug 15 μm, was wesentlich größer als z_d ist. Da die Kugeln homogen angefärbt waren, war das kleinste zu berücksichtigende Detail in der z-Richtung ein zylindrisch geformter Schnitt durch die Kugeln, wobei die Zylinderhöhe durch die horizontale Auflösung bestimmt wurde. Daher wurde die Tischgeschwindigkeit während der Fokussierung auf etwa ein Drittel des Kugeldurchmessers reduziert, was 4,94 μm pro Videobild (2.000 Schritte pro Sekunde) ergab. Der Versatz der Gegenbewegungskorrektur wurde mit 15 μm ermittelt.
C. Elegans GFP-VM Screening – Ergebnisse
4D zeigt die durchschnittliche Fokuskurve für 1786 Felder des C. Elegans Screening. Vierzehn der 1800 Felder enthielten keine fluoreszierenden Kugeln, infolgedessen war eine exakte Fokussierung nicht möglich. Sie sind in 4D nicht enthalten. Die restlichen Felder waren gemäß einem Versuchsbeobachter präzise fokussiert. Die Abweichung der Fokusauswertung wurde aufgrund der unterschiedlichen Anzahl von Kugeln und des Vorhandenseins von Würmern in den fokussierten Feldern verursacht. Die für die Fokussierung benötigte Zeit betrug 2,8 Sekunden für das erste Feld in einer Mulde und 1,1 Sekunden pro Feld zum Einhalten der Brennebene innerhalb der Mulde. Die Autofokussierung verbrauchte 12% der Zeit zum Aufnehmen einer 96-Mulden-Platte (4,5 Stunden für 28.000 Bilder), was hinsichtlich der für die Präparierung erforderlichen Zeit angemessen ist.
Die Bilder wurden durch das Vorhandensein von weißem Rauschen (SNR ≈ 10 dB) aufgrund von fluoreszierenden Bakterien und Strukturrauschen, das durch Masseschleifen in Kombination mit der extrem empfindlichen CCD-Kamera verursacht wurde, in hohem Maße verschlechtert. Der Fokusalgorithmus konnte die korrekte Fokusposition mit Ausnahme von 14 Feldern für alle der 1800 untersuchten Felder ermitteln. Die Störung wurde durch einen Mangel an relevantem Bildinformationsinhalt verursacht.
Immunzytochemische Markerdetektion im Fluoreszenz-Modus
Human-Fibroblaste wurden in einer 96-Mulden-Platte (Costar, Acton, MA) mit 7000 Zellen pro Mulde in 2% FBS/Optimum gesät. Die Zellen wurden durch Hinzufügen von 2% Paraformaldehyd und 0,5% Triton-X-100 (Sigma, St. Louis, MO) fixiert und permeabilisiert. Die Reaktion wurde nach 30 Minuten durch Waschen mit PBS, der Zugabe von 5% NGS für die Dauer von 60 Minuten und des Waschen mit 0,2% BSA/PBS für die Dauer von 5 Minuten gestoppt. Eine Verdünnung von 1/100 primärem Kaninchen Anti-Human Antikörper NF-_KB (p65) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) in 0,2% BSA/PBS wurde jeder Mulde für die Dauer von 2 Stunden bei 37°C hinzugefügt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS für die Dauer von 10 Minuten wurde eine Cy3-Verdünnung des Typs Schaf Anti-Kaninchen (Jackson, Uvert-Grove, PA) (112 Glycerin, 1/250 0,2% BSA/PBS) jeder Mulde für die Dauer von 60 Minuten bei 37°C hinzugefügt. Nach dem Waschen mit 0, 2% BSA/PBS für die Dauer von 15 Minuten und wiederholtem Waschen mit PBS und Gegenfärben des Zellkerns mit Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR) waren die Zellen für eine quantitative Auswertung bereit.
Die Mulden-Platten wurden mit einem Objektiv 40 × NA 0,6 Achroplan im Fluoreszenz-Modus auf einem Mikroskop Axiovert 135 (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) untersucht. Ein DAPI/FITC/TRITC-Filter (XF66, Omega Optical, Brattleboro, VT) wurde in Kombination mit einer 100 W starken Xenophot-Lampe zum Erregen der Zellen verwendet. Ein Scannertisch (Tisch und MC2000-Steuervorrichtung, Märzhäuser, Wetzlar, Deutschland) wurde für die automatische Positionskontrolle verwendet. Benachbarte Bilder wurden erfasst (O2-Workstation R5000 180 MHz, Silicon Graphics, Mountain View, CA) unter Verwendung einer verstärkten CCD-Kamera (IC-200, PTI, Monmouth Junction, NJ). Als Ergebnis wurden zwei 5 5 Mosaikbilder, eines für die Zellkerne und eines für das Immunsignal, für jede Mulde auf Diskette gespeichert. Der pro Mulde abgedeckte Bereich betrug 1,2 × 1,2 mm². Vor dem Aufnehmen jedes Mosaikbildes wurde die Autofokussierung in etwa der Mitte des Scan-Bereichs vorgenommen. Die kleinsten zu fokussierenden Teile waren die Nuklei, die mindestens 30 Pixel im Durchmesser aufwiesen, was σ = 8,5 (Gleichung 2) ergab. Es stellte sich heraus, dass die Veränderlichkeit in der z-Position der Mulden in einem Bereich von 250 μm lag, der als Fokusintervall verwendet wurde. Die Wellenlänge des ausgestrahlten Lichts betrug etwa 450 nm (Nuklei) und 600 nm (Immunsignal), was jeweils zu einer Feldtiefe von 1,25 μm und 1,67 μm führte (Gleichung 8). Die Zelldichte betrug etwa 5–15 μm, viel größer als z_d. Daher wurde die Tischgeschwindigkeit bei der Fokussierung auf 4,94 μm pro Videobild (2.000 Schritte pro Sekunde) reduziert. Der Versatz der Gegenbewegungskorrektur wurde mit 15 μm ermittelt.
Immunzytochemische Markerdetektion – Ergebnisse
4E zeigt die durchschnittliche Fokuskurve für, die Nuklei in der immunzytochemischen Markerdetektion. Alle 150 Felder wurden gemäß eines Versuchsbeobachters exakt fokussiert. Die Abweichung der Fokusauswertung war auf die unterschiedliche Anzahl von Zellen zurückzuführen, die in jedem Feld vorhanden waren. Die für das Immunsignal gemessene durchschnittliche Fokuskurve ist in 4F dargestellt. Von den 150 untersuchten Feldern waren 2 Felder vollständig gesättigt aufgrund von Präparierungs-Artefakten, wodurch ein Versagen des Fokus-Algorithmus verursacht wurde. Diese Felder sind nicht in 4F enthalten. Die restlichen Felder waren präzise fokussiert. Die für die Fokussierung benötigte Zeit betrug 2,8 Sekunden pro Feld, wobei 14% der Zeit zum Aufnehmen einer 96-Mulden-Platte (20 Minuten) verbraucht wurden.
Das Signal-Rausch-Verhältnis wurde auf etwa 10 dB für die Nuklei und 4 dB für das Immunsignal geschätzt. Trotz des Rauschens konnte das Autofokusverfahren mit Ausnahme von 2 Feldern alle 300 Felder fokussieren. Der Fehler wurde durch einen Mangel an relevantem Bildinformationsinhalt verursacht.
Leistungsvergleich mit kleinen Ableitungsfiltern
Zum Bewerten der Auswirkung der Skalierung σ in der Schätzung für die Fokusauswertung wurden Versuche mit einem festen (nicht-wählbarem σ = 0,5 durchgeführt.
Bei der quantitativen neuronalen Morphologie war eine präzise Fokussierung mit σ = 0,5 nicht möglich für 1 von 24 Feldern. In diesem Fall nahm der Algorithmus die Fokussierung auf dem Umkehrkontrastbild vor. Die Anwendung der niedrigen Skalierung beim Fokussieren der Kardiomyozyt-Dedifferenzierung schlug fehl, sobald eine Kontaminierung durch Pilze auf der Mediumoberfläche auftrat, die als die lokale Ebene verwendet wurde. Die Annahme von σ = 1,0 löste das Problem, d.h. durch anhaltende Fokussierung auf die Myozyten. Eine Fokussierung mit σ = 0,5 bei der immunhistochemischen Markerdetektion führte zur Fokussierung auf Staubpartikel auf der Glasfläche bei 5 von 24 Feldern.
Bei den Fluoreszenz-Anwendungen war eine präzise Fokussierung mit σ = 0,5 aufgrund des geringen Signal-Rausch-Verhältnisses nicht möglich. Versuche, die mit σ = 0,75 durchgeführt wurden, führten zu einer ungenauen Fokussierung bei 18 von 30 Feldern für das C. Elegans GFP-VM Screening. Des Weiteren konnte der Algorithmus keine präzise Fokussierung bei 13 von 30 Feldern für die Nuklei bei der immunzytochemischen Markerdetektion ausführen und war bei 17 von 30 Feldern für das Immunsignal nicht erfolgreich.
Die Auswirkung der Skalierung σ führt zu einer Unempfindlichkeit gegenüber Rauschen und Artefakten. Eine höhere Skalierung führt zu Unempfindlichkeit gegenüber Phasenumkehrung (quantitative neuronale Morphologie), Pilzkontaminierung auf der Mediumoberfläche (Kardiomyozyt-Dedifferenzierung), Staub auf der Glasoberfläche (immunhistochemische Markerdetektion) und Rauschen (Fluoreszenz-Anwendungen). Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass die Leistung von kleinen Differenzfiltern, wie sie üblicherweise verwendet werden, angesichts der Anzahl ungenau fokussierter Bilder für σ = 0,5 oder σ = 0,75 schlecht ist. Des Weiteren kann gefolgert werden, dass die Skalierung σ vorzugsweise mindestens 1 betragen sollte. Dies entspricht 3 Pixeln. Daher liegt ein bevorzugter Bereich der Skalierung σ in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zwischen mindestens 3 Pixeln bis zur Größe des Bildes selbst.
Für die unterschiedlichen Anwendungen wurde das gewählte Fokusintervall effektiv zu etwa 30% genutzt. Das Fokusintervall wird vorzugsweise nicht zu eng gewählt, um sicherzustellen, dass die Brennebene in dem Intervall liegt, ohne Berücksichtigung der manuellen Positionierung der Präparierungen.
Die für den Autofokus-Algorithmus erforderliche Zeit schwankte zwischen 1,5 bis 2,8 Sekunden für aktuelle Sensoren und Computersysteme, was im gleichen Zeitkbereich liegt wie geschulte Beobachter. Die Fokuszeit wird durch die Feldtiefe und die Videobild-Zeit bestimmt, die beide als vorgegebene Größen betrachtet werden können, und durch die Größe des Fokusintervalls. Eine weitere Reduzierung der Fokuszeit kann durch ein kleineres Fokusintervall erzielt werden unter der Bedingung, dass die Veränderlichkeit der Präparierungsposition begrenzt ist. Wenn die Positionsveränderlichkeit gering oder gut bekannt ist, kann das Fokusintervall Δz so reduziert werden, dass es genau der Veränderlichkeit entspricht. Bei den angegebenen Anwendungen kann die Fokuszeit auf diese Weise um bis zu einem Faktor 3 reduziert werden.
Ein Versagen des Autofokus-Algorithmus aufgrund eines Mangels an Bildinhalt ist gut prognostizierbar. Wenn die Brennebene innerhalb des Fokusintervalls liegt, muss in der Schätzung der Fokuskurve ein globaler Bestwert vorliegen. Ein Vergleich der höchsten Fokusauswertung s₀ mit den höchsten der Fokusauswertungen an den Enden des Fokusintervalls s_e = max(s(0), s(t_d)), die sicherlich nicht fokussiert sind, bestimmt den Signalinhalt hinsichtlich des Rauschens. Wenn die höchste Auswertung die Fokusauswertungen an den Enden des Intervalls nicht signifikant übertrifft, oder wenn (s₀ – s_e)/s_e < α, sollte die gefundene Fokusposition zurückgewiesen werden. In diesem Fall kann die Fokussierung besser auf der Basis eines Nachbarfelds ausgeführt werden. Bei den ausgewerteten Ergebnissen prognostiziert ein Schwellenwert von α = 10% sicher jedes Versagen. Dementsprechend kann ein Prüfobjekt in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung korrekt fokussiert werden, oder, wenn das Prüfobjekt nicht korrekt fokussiert werden kann, ist eine Ermittlung durch das System aus den Fokusauswertungen möglich und diese Probe und/oder ihr Bild können automatisch markiert/gekennzeichnet werden, dass die Fokussierung unzulänglich war. Dies stellt einen bedeutenden Vorteil bereit, da der Bediener diese Prüfobjekte dann identifizieren und andere Formen der Fokussierung nach Erfordernis ausführen kann, beispielsweise manuell, ohne die zeitintensive Notwendigkeit, jedes Bild zu überprüfen, um festzustellen, ob welche davon unscharf sind.

Claims

Autofokusverfahren für ein optisches Instrument zum Betrachten eines Gegenstands und mit einem Autofokussiermechanismus, umfassend folgende Schritte: Schritt 1: Gewinnen eines ersten digitalen Bildes von dem Gegenstand durch das optische Instrument, wobei das erste digitale Bild eine Vielzahl von Pixeln mit Pixelwerten umfasst; Schritt 2: Anwenden eines digitalen Gradientfilters auf wenigstens einige der Pixelwerte des ersten digitalen Bildes, um eine Fokusauswertung für das erste digitale Bild zu erhalten; wobei der digitale Filter durch eine mathematische Glättungsfunktion definiert ist, die einen negativen und positiven Zacken um ihren Ursprung aufweist, wobei die mathematische Glättungsfunktion nur einen Nulldurchgang aufweist und in einer einstellbaren räumlichen Ausdehnung dadurch begrenzt ist, dass sie sich über eine Strecke erstreckt, die kleiner oder gleich der Bildgröße ist und sich wenigstens über drei Pixel zu beiden Seiten eines Pixels erstreckt, dessen Wert gefiltert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die räumliche Ausdehnung der Glättungsfunktion manuell und/oder elektronisch eingestellt werden kann.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des Weiteren umfassend: Schritt 3: Bewegen des Gegenstands relativ zu dem optischen Instrument entlang von dessen optischer Achse und Gewinnen eines zweiten digitalen Bildes und einer zweiten Fokusauswertung dafür in Übereinstimmung mit den Verfahren von Schritt 1 und 2; Schritt 4: Fortsetzung des Bewegens des Gegenstands relativ zu dem optischen Instrument entlang von dessen optischer Achse in der gleichen Richtung in Übereinstimmung mit den Schritten 1 bis 3, um wenigstens drei digitale Bilder und erste bis dritte damit verbundene Fokusauswertungen zu gewinnen; und Schritt 5: Bestimmen einer Fokusposition für den Gegenstand aus den ersten bis dritten Fokusauswertungen und Bewegen des Gegenstands und/oder des optischen Instruments in diese Position.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, des Weiteren umfassend: Schritt 3: Bestimmen einer ersten Vielzahl von Fokusauswertungen für das erste digitale Bild, wobei ein digitaler Gradientfilter mit einer ersten Vielzahl von räumlichen Ausdehnungen verwendet wird, indem auf jede räumliche Ausdehnung die Verfahrensschritte 1 und 2 angewendet werden; Schritt 4: Bewegen des Gegenstands relativ zu dem optischen Instrument entlang von dessen optischer Achse und Gewinnen eines zweiten digitalen Bildes und einer zweiten Vielzahl von Fokusauswertungen dafür in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Schritt 3. Schritt 5: Fortsetzung des Bewegens des Gegenstands relativ zu dem optischen Instrument entlang von dessen optischer Achse in der gleichen Richtung in Übereinstimmung mit den Schritten 1 bis 3, um wenigstens drei digitale Bilder und eine erste bis dritte Vielzahl von damit verbundenen Fokusauswertungen zu gewinnen; und Schritt 6: Bestimmen einer Fokusposition für den Gegenstand aus der ersten bis dritten Vielzahl von Fokusauswertungen und Bewegen des Gegenstands und/oder des optischen Instruments in diese Position.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das optische Instrument ein Mikroskop ist.
Verfahren nach Anspruch 3, 4 oder 5, wobei der bestimmende Schritt das Aufnehmen der Fokusauswertungen in eine Polynomfunktion umfasst und das Bewegen des Gegenstands und/oder des optischen Instruments in eine Position, die zu einem Maximum der Polynomfunktion in Beziehung steht.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die digitale Filterfunktion eine ein- oder zweidimensionale Funktion ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die digitale Filterfunktion eine Gaußsche Funktion ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des Weiteren umfassend den Schritt zum Auswählen der räumlichen Ausdehnung der digitalen Filterfunktion.
Optisches Instrument zum Betrachten eines Gegenstands und mit einem Autofokussiermechanismus, wobei das optische Instrument eingerichtet ist, um ein erstes digitales Bild des Gegenstands durch das optische Instrument zu gewinnen, wobei das erste digitale Bild eine Vielzahl von Pixeln umfasst, die Pixelwerte besitzen; und der Autofokussiermechanismus einen digitalen Gradientfilter aufweist, um wenigstens einige der Pixelwerte des ersten digitalen Bildes zu filtern, um eine Fokusauswertung für das erste digitale Bild zu erhalten, wobei der digitale Filter durch eine mathematische Glättungsfunktion definiert ist, die einen negativen und positiven Zacken um ihren Ursprung aufweist, wobei die mathematische Glättungsfunktion nur einen Nulldurchgang aufweist und in einer einstellbaren räumlichen Ausdehnung dadurch begrenzt ist, dass sie sich über eine Strecke erstreckt, die kleiner oder gleich der Bildgröße ist und sich wenigstens über drei Pixel zu beiden Seiten eines Pixels erstreckt, dessen Wert gefiltert wird.
Optisches Instrument nach Anspruch 10, wobei die räumliche Ausdehnung der Glättungsfunktion manuell und/oder elektronisch einstellbar ist.
Optisches Instrument nach einem der Ansprüche 10 bis 12, des Weiteren umfassend: eine Antriebsvorrichtung zum Bewegen des Gegenstands relativ zu dem optischen Instrument entlang von dessen optischer Achse.
Optisches Instrument nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Instrument des Weiteren eingerichtet ist, um aus einer Vielzahl von Fokusauswertungen für eine Vielzahl von Bildern eine Fokusposition für den Gegenstand zu bestimmen.
Optisches Instrument nach Anspruch 13, des Weiteren eingerichtet, um die Vielzahl von Fokusauswertungen in eine Polynomfunktion aufzunehmen und die Fokusposition als eine Position zu bestimmen, die zu einem Maximum der Polynomfunktion in Beziehung steht.
Optisches Instrument nach Anspruch 14, wobei das Instrument eingerichtet ist, um für jedes Bild eine Vielzahl von Fokusauswertungen zu bestimmen, wobei eine Vielzahl von räumlichen Ausdehnungen für den digitalen Filter verwendet wird.
Optisches Instrument nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei die digitale Filterfunktion eine ein- oder zweidimensionale Funktion ist.
Optisches Instrument nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei die digitale Filterfunktion eine Gaußsche Funktion ist.
Optisches Instrument nach einem der Ansprüche 10 bis 17, wobei das optische Instrument ein Mikroskop ist.
Optisches Instrument nach einem der Ansprüche 10 bis 18, wobei die Ausdehnung der digitalen Filterfunktion manuell und/oder elektronisch einstellbar ist.
Autofokussiermechanismus für ein optisches Instrument, wobei das optische Instrument zum Betrachten eines Gegenstands vorgesehen ist und zum Gewinnen eines digitalen Bildes des Gegenstands, wobei das digitale Bild eine Vielzahl von Pixeln umfasst, die Pixelwerte besitzen; wobei der Mechanismus umfasst: einen digitalen Gradientfilter, um wenigstens einige der Pixelwerte des digitalen Bildes zu filtern, um eine Fokusauswertung für das digitale Bild zu erhalten, wobei der digitale Filter durch eine mathematische Glättungsfunktion definiert ist, die einen negativen und positiven Zacken um ihren Ursprung aufweist, wobei die mathematische Glättungsfunktion nur einen Nulldurchgang aufweist und in einer einstellbaren räumlichen Ausdehnung dadurch begrenzt ist, dass sie sich über eine Strecke erstreckt, die kleiner oder gleich der Bildgröße ist und sich wenigstens über drei Pixel zu beiden Seiten eines Pixels erstreckt, dessen Wert gefiltert wird.
Autofokussiermechanismus nach Anspruch 22, wobei die räumliche Ausdehnung der Glättungsfunktion manuell und/oder elektronisch einstellbar ist.
Mechanismus nach einem der Ansprüche 20 bis 21, wobei die digitale Filterfunktion eine ein- oder zweidimensionale Funktion ist.
Mechanismus nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei die digitale Filterfunktion eine Gaußsche Funktion ist.
Mechanismus nach einem der Ansprüche 20 bis 23, umfassend den Mechanismus, der eingerichtet ist, um aus einer Vielzahl von Fokusauswertungen für eine Vielzahl von Bildern eine Fokusposition für den Gegenstand zu bestimmen.
Mechanismus nach Anspruch 24, der des Weiteren eingerichtet ist, um die Vielzahl von Fokusauswertungen in eine Polynomfunktion aufzunehmen und die Fokusposition als eine Position zu bestimmen, die zu einem Maximum der Polynomfunktion in Beziehung steht.