DE60004185T2

DE60004185T2 - Supar stimulierende aktivität auf die tcupa vermittelte fibrinolyse und verschiedene verwendungen davon

Info

Publication number: DE60004185T2
Application number: DE60004185T
Authority: DE
Inventors: Abd Al-Roof Higazi
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co
Priority date: 1999-04-05
Filing date: 2000-04-03
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2020-04-04
Also published as: ATE246001T1; EP1165121B1; AU3668500A; CA2368183A1; AU773562B2; WO2000059535A3; WO2000059535A2; US6861054B2; IL129332A0; US20020022025A1; DE60004185D1; JP2002541119A; EP1165121A2; IL129332A

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Komplex aus dem zweikettigen Urokinase-Plasminogen-Aktivator (tcuPA) und dem löslichen Urokinase-Plasminogen-Aktivator (suPAR) oder Fragmenten davon, pharmazeutische Zusammensetzungen, die den Komplex als Wirkstoff umfassen, und verschiedene Verwendungen der Zusammensetzungen zum Behandeln und/oder Verhindern von thrombotischen Ereignissen.
Stand der Technik
Der akute Myokardinfarkt, Schlaganfall, Emboli in der Lunge und andere thrombotische Ereignisse zählen in den hochentwickelten Ländern zu den häufigsten Todesursachen. Unter großem Arbeitsaufwand wurden Arzneistoffe entwickelt, mit denen akute thromboembolische Ereignisse verhindert oder gebessert werden können. Zu diesen Arzneistoffen zählen thrombolytische Mittel, die verbreitet eingesetzt werden, um die Patienten akut einzustellen. Jedoch ist der Nutzen der zurzeit verfügbaren Thrombolytika begrenzt, da ihre Verwendung mit einem hohen Risiko von Blutungen einhergeht. Diese Gefahr wird durch die hohen Dosen verursacht, die zum Auflösen von Gerinnseln erforderlich sind und die zur Folge haben, dass Plasmin im Kreislauf akkumuliert, wodurch es zu einer systemischen Fibrinolyse und Fibrinogenolyse kommt. Bei etwa 1% der Patienten, die Thrombolytika erhalten, tritt eine intrakranielle Blutung auf, und außerdem kommen mit einer vergleichbaren Inzidenz auch andere wichtige hämorrhagische Komplikationen vor. Aufgrund dieser Nebenwirkungen ist die Verwendung von Thrombolytika nur auf die Behandlung der schwersten Fälle von Ischämie beschränkt.
Andere Punkte, die die verfügbare thrombolytische Behandlung einschränken, umfassen die Zeitspanne, die erforderlich ist, um die Gerinnsel aufzulösen und die Funktionsfähigkeit der Blutgefäße wiederherzustellen. Außerdem unterscheiden die verfügbaren thrombolytischen Mittel nicht zwischen neu gebildeten Gerinnseln, die für das akute Ereignis verantwortlich sind, und „alten" Gerinnseln, die möglicherweise einen physiologischen Zweck erfüllen.
Aufgrund dieser Überlegungen wäre es vorteilhaft, ein thrombolytisches Mittel zu entwickeln, das nur in Gegenwart von Fibrin wirkt, das einen raschen Wirkungseintritt besitzt und das für neu gebildete Gerinnsel spezifisch ist. Diese Eigenschaften würden es möglich machen, die Gerinnsel schneller und mit niedrigeren Konzentrationen des Mittels aufzulösen, wodurch die Prävalenz einer systemischen Blutung reduziert werden könnte. Die Fähigkeit eines solchen Mittels, zwischen den neu gebildeten und den älteren Gerinnseln zu unterscheiden, würde die Wahrscheinlichkeit einer weiteren Blutung verringern.
Plasminogen-Aktivatoren werden in der Behandlung von thromboembolischen Erkrankungen verbreitet eingesetzt. Einer dieser Aktivatoren ist der Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA), von dem bekannt ist, dass er als ein Proenzym synthetisiert wird, das aus einem einzelkettigen Protein besteht (scuPA) [Pannell, R., und Gurewich, V., Blood 69: 22–28 (1987)], und dass er an verschiedenen wichtigen biologischen Prozessen beteiligt ist, umfassend Angiogenese, Wundheilung, Entzündung, Ovulation und Plazentaentwicklung, Atherosklerose, die Aneurysma- und Neointimabildung sowie das Entstehen von Tumormetastasen.
Die begrenzte Proteolyse von scuPA führt dazu, dass zwei Ketten gebildet werden (tcuPA), die als die aktive Form des Enzyms angesehen werden [Kasai, S., et al., J. Biol. Chem. 260: 12382–12389 (1985)]. Einer der wichtigsten Regulatoren von uPA ist der Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAl-1 ). Dieser Regulator interagiert in einer sehr schnellen zweistufigen Reaktion mit tcuPA, wodurch ein inaktiver SDS-stabiler 1/1-Komplex gebildet wird [Lindahl, T. L., et al., Biochem. J. 265: 109–113 (1990)]. Die Bindung von tcuPA an uPAR reduziert nur schwach die Empfänglichkeit von tcuPA gegenüber der Hemmwirkung von PAl-1 [Ellis, V., et al., J. Biol. Chem. 265: 9904–9908 (1990)].
In den letzten Jahren haben die Erfinder daran gearbeitet, neue Plasminogen-Aktivatoren zu entwickeln und zu charakterisieren, welche die vorstehend spezifizierten Kriterien erfüllen.
Nun wurde erstaunlicherweise gefunden, dass der lösliche menschliche Urokinase-Rezeptor (suPAR) unter spezifischen Bedingungen in vitro die Aktivität des üblicherweise eingesetzten thrombolytischen Mittels tcuPA stimuliert. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird, ist die Aktivität des tcuPA/suPAR-Komplexes, der aus diesen beiden Komponenten gebildet wird, Fibrin-abhängig und erfordert das Vorliegen einer spezifischen (spezifischer) Plasma- oder Serumkomponente(n).
Wie ferner in den folgenden Beispielen gezeigt wird, steigert suPAR unter in vivo-Bedingungen durch Komplexieren mit tcuPA signifikant die Lyse von Emboli in der Lunge im Vergleich zur Lyse durch tcuPA in Abwesenheit des Rezeptors.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Komplex aus tcuPA und suPAR oder einem Fragment bzw. Fragmenten des suPAR (wobei dieser Komplex hier auch als tcuPA/suPAR bezeichnet wird), worin der suPAR oder das Fragment bzw. die Fragmente davon die durch tcuPA vermittelte fibrinolytische Aktivität unter physiologischen Bedingungen stimuliert bzw. stimulieren. Das Molverhältnis von suPAR zu tcuPA ist in ihrem Komplex größer als 1, vorzugsweise beträgt es 10 : 1.
Der Komplex gemäß der Erfindung wirkt vorzugsweise auf frisch gebildete Gerinnsel und ist deshalb hierfür spezifisch.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine therapeutisch wirksame Menge des suPAR/tcuPA-Komplexes der Erfindung umfasst. Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können gegebenenfalls weiterhin pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und Konservierungsmittel umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung zum Behandeln und/oder Verhindern von thrombotischen Ereignissen gedacht, die mit der Bildung von Fibringerinnseln in Zusammenhang stehen.
Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung von suPAR als Stimulator der fibrinolytischen Aktivität von tcuPA, insbesondere zum Behandeln von thrombotischen Ereignissen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Wirkung von suPAR auf die durch tcuPA vermittelte Lyse von Gerinnseln Lyse von Gerinnseln, die aus menschlichem Plasma hergestellt wurden. Die Gerinnsel wurden hergestellt, indem Thrombin zugegeben wurde (in einer Endkonzentration von 0,4 NIH U/ml). TcuPA oder äquimolare Konzentrationen von suPAR und tcuPA (tcuPA/suPAR) wurden für zwei bis drei Stunden bei 37°C zugegeben. Die Bahnen 1 und 4 zeigen die fibrinolytische Aktivität, die durch tcuPA alleine vermittelt wird. Die Bahn 2 zeigt die fibrinolytische Aktivität, die durch tcuPA/suPAR in einem Konzentrationsverhältnis von 1 : 1 vermittelt wird. Die Bahn 3 zeigt die Aktivität, die durch tcu-PA/suPAR in einem Konzentrationsverhältnis von 1 : 10 vermittelt wird. Die Größen der durch tcuPA/suPAR erzeugten lytischen Bereiche werden festgestellt.
2: suPAR stimuliert die durch tcuPA vermittelte Fibrinolyse Plasmagerinnsel wurden mit ¹²⁵I-Fibrin angereichert und mit Plasminogen und tcuPA in Gegenwart der angegebenen Konzentrationen von suPAR inkubiert. Die freigesetzte Radioaktivität (RelRad) wurde nach einer Stunde bei 37°C bestimmt, wobei die in den Überstand freigesetzte Radioaktivität gemessen wurde. Der Mittelwert ± SEM von drei wiederholten Experimente ist angegeben. Die Konzentration von HMW- oder LMW-tcuPA betrug 25 nM. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte von drei Experimenten.
3: Die Wirkung von suPAR auf die durch HMW-tcuPA vermittelte Fibrinolyse HMW-tcuPA wurde mit frisch hergestellten Gerinnseln in Gegenwart und in Abwesenheit von suPAR inkubiert. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEM von drei wiederholten Experimenten. T gibt die Zeit an (in Minuten).
4: suPAR stimuliert die durch tcuPA vermittelte Fibrinolyse in vivo uPA^-\--Mäuse (von uPA befreite Mäuse) und ihre syngenen Wildtyp-Geschwister aus dem gleichen Wurf erhielten tcuPA, tcuPA/suPAR, suPAR oder PBS über eine kontinuierliche i. v.-Infusion. Eine Stunde nach der Injektion von ¹²⁵I-Mikroemboli wurde die Radioaktivität in den Lungen gemessen. Die Daten sind als der Unterschied zwischen der spontanen Lyse von Gerinnseln in Wildtyp-Mäusen und der Lyse angegeben, die in uPA^-\--Mäusen erhalten wurde, denen PBS, tcuPA, tcuPA/suPAR oder suPAR infundiert worden war. Der Mittelwert ± SEM von zwei Experimenten ist angegeben. ID bedeutet die injizierte Dosis. In den mit *** bezeichneten Fällen ist p < 0,001, im Vergleich zu uPA^-\--Mäusen, denen PBS infundiert worden war.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Komplex aus tcuPA und suPAR oder Fragmenten von suPAR, wobei angenommen wird, dass der Komplex direkt oder indirekt die Fibrinolyse von aus Plasma stammenden Gerinnseln induziert, indem eine su-PAR-Stimulation der durch tcuPA vermittelten fibrinolytischen Aktivität erfolgt. Insbesondere ist die fibrinolytische Aktivität, die dem suPAR/tcuPA zugeschrieben wird, im Wesentlichen spezifisch für frische Fibringerinnsel. In dem Komplex der Erfindung ist das Molverhältnis von suPAR zu tcuPA größer als 1, vorzugsweise beträgt das Verhältnis 10 : 1.
Es sollte klar sein, dass der Begriff suPAR sich auf den Rezeptor selbst oder auf funktionelle Fragmente oder Derivate davon bezieht. Mit dem Begriff funktionelles Fragment oder Derivat ist ein beliebiges Fragment oder Derivat von suPAR gemeint, das die biologische Aktivität von suPAR aufweist, insbesondere die Stimulation der durch tcuPA vermittelten fibrinolytischen Aktivität.
Die Begriffe „Fibringerinnsel" oder „aus Plasma stammende Gerinnsel" bedeuten Gerinnsel, die durch die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin gebildet werden, wodurch rote Blutkörperchen und andere gebildete Elemente innerhalb des koagulierten Plasmas eingeschlossen werden. Man weiß, dass es sich bei dem Enzym, welches diese Umwandlung katalysiert, um Thrombin handelt, das in vergossenem Blut gebildet wird und das Fibrinogen zu Fibrin umwandelt, wobei die Fibringerinnsel durch eine hydrolysierende Wirkung gebildet werden.
Die fibrinolytische Aktivität des scuPA/suPAR-Komplexes in vivo unter physiologischen Bedingungen wurde im Vergleich zur Aktivität von tcuPA alleine oder in Kombination mit suPAR in WO 98/25641 beschrieben. Die dort gezeigten Ergebnisse machen deutlich, dass der suPAR nur eine geringfügige Wirkung auf die durch tcuPA vermittelte Fibrinolyse hat, wenn er an einem Fibringerinnsel mit einer Stöchiometrie von 1 : 1 angewendet wird.
Jedoch haben die Erfinder nun gefunden, dass trotz der Übereinstimmung, dass pro-uPAs, z. B. scuPA oder tcuPA, an ihren Rezeptor uPAR in einem Verhältnis von 1 : 1 binden [A. Nykjaer et al., J. Biol. Chem. 269 (41): 25668–25676 (1994)], beim Verwenden einer überschüssigen Menge von suPAR (z. B. suPAR/tcuPA 10 : 1) der Rezeptor oder mindestens ein funktionelles Fragment davon eine unerwartete stimulatorische Wirkung auf die durch tcuPA vermittelte Fibrinolyse zeigt. Diese neue Entdeckung weist möglicherweise auf einen anderen und neuen Wirkmechanismus von tcuPA hin, der nur in Gegenwart einer überschüssigen Menge von suPAR aktiviert wird.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff eine therapeutisch wirksame Menge des tcuPA/suPAR-Komplexes der Erfindung umfasst.
Die „therapeutisch wirksame Menge" für die hier vorliegenden Zwecke kann durch Überlegungen bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Menge muss wirksam sein, so dass eine Besserung erreicht wird, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf eine verbesserte Überlebensrate, eine raschere Genesung oder ein Lindern oder Aufheben von Symptomen und anderen Indikatoren, die vom Fachmann als geeignete Bewertungssysteme ausgewählt werden. Die Dosen können Einzeldosen oder mehrere Dosen in einem Zeitraum von mehreren Tagen sein, wobei jedoch Einzeldosen bevorzugt sind.
Der tcuPA/suPAR-Komplex oder die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann über verschiedene Wege verabreicht werden und kann zusätzlich zu dem Wirkstoff noch pharmazeutisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien, Konservierungsmittel und Vehikel umfassen. Gemäß einer Ausführungsform liegt die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung in einer Dosiseinheitsform vor.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können subkutan oder parenteral verabreicht werden, umfassend eine intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre und intraperitoneale Verabreichung, außerdem intrathekale Techniken. Außerdem können Implantate der pharmazeutischen Präparate verwendet werden. Die pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und Vehikel und auch die Implantatträger beziehen sich im Allgemeinen auf inerte nicht-toxische feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder ein Material zum Einkapseln, das/die nicht mit den Wirkstoffen der Erfindung reagiert/reagieren.
Wenn der Komplex oder die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung parenteral verabreicht wird, wird er/sie im Allgemeinen in einer injizierbaren Einheitsdosisform formuliert (Lösung, Suspension, Emulsion). Die pharmazeutischen Formulierungen, die zur Injektion geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen und sterile Pulver zur Rekonstitution in sterile injizierbare Lösungen. Der Träger kann ein beliebiger physiologisch verträglicher, geeigneter Träger sein, z. B. Wasser oder wässrige Pufferlösungen.
Die richtige Fluidität kann aufrechterhalten werden, indem man z. B. eine Beschichtung verwendet, z. B. Lecithin, indem man im Fall einer Dispersion die erforderliche Partikelgröße beibehält und indem man oberflächenaktive Mittel einsetzt. Außerdem können auch nicht-wässrige Vehikel, wie Baumwollsamenöl, Sesamöl, Olivenöl, Sojaöl, Maisöl, Sonnenblumenöl oder Erdnussöl, und Ester, z. B. Isopropylmyristat, als Lösungsmittelsysteme für zusammengesetzte Präparate verwendet werden.
Außerdem können verschiedene Zusatzstoffe zugegeben werden, welche die Stabilität, Sterilität und das isotone Verhalten der Zusammensetzungen steigern, umfassend antimikrobielle Konservierungsmittel, Antioxidantien, chelatbildende Mittel und Puffer. Mit verschiedenen antibakteriellen Mittel und Anti-Pilz-Mittel kann sichergestellt werden, dass die Wirkung von Mikroorganismen verhindert wird, z. B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und dergleichen. In vielen Fällen kann es wünschenswert sein, isotonische Mittel zuzugeben, z. B. Zucker, Natriumchlorid und dergleichen. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form kann erreicht werden, indem Mittel eingesetzt werden, die die Absorption verzögern, z. B. Aluminiummonostearat und Gelatine. Gemäß der vorliegenden Erfindung muss ein beliebiger verwendeter Träger, Verdünnungsmittel oder Zusatzstoff mit den Zusammensetzungen kompatibel sein.
Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem die Zusammensetzungen, die zum Durchführen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mit der erforderlichen Menge des geeigneten Lösungsmittels zusammen mit verschiedenen der anderen Bestandteilen wie gewünscht gemischt werden.
Jedoch kann die hier ausführlich beschriebene Zusammensetzung an den Patienten auch oral verabreicht werden. Hierfür sind herkömmliche Formen geeignet, z. B. das Verabreichen der Zusammensetzung als Tabletten, Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Kapseln, Pulver, Sirups und dergleichen. Bekannte Verfahren sind bevorzugt, mit denen die Zusammensetzung oral oder intravenös freigesetzt wird und die biologische Aktivität erhalten bleibt.
Zum Abgeben innerhalb des ZNS eignet sich eine intrathekale Gabe, z. B. mit einem Ommaya-Reservoir. Das US Patent Nr. 5 455 044 stellt die Verwendung eines Dispersionssystems für die Verabreichung ins ZNS bereit, oder vgl. das US Patent Nr.
5 558 852, in dem eine Diskussion der ZNS-Verabreichung zu finden ist. Außerdem können pharmakologische Formulierungen verabreicht werden, welche die Blut-Hirn-Schranke durchdringen. Für solche Formulierungen können Verfahren eingesetzt werden, die nun verfügbar sind, wodurch Chimäre Strukturen gebildet werden, in denen der Komplex der Erfindung, alleine oder in Kombination mit menschlichem IgG oder dem/den von IgG hergeleiteten Peptid/en, an einen Gehirn-Transportvektor gekoppelt ist, wodurch der Transport durch die Schranke ermöglicht wird. Ferner kann in geeigneten Fällen ein Aufreißen der Blut-Hirn-Schranke eingesetzt werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung ist für die Behandlung thrombotischer Ereignisse gedacht, die mit der Bildung von Fibringerinnseln in Zusammenhang stehen. Der Begriff thrombotisches Ereignis ist dem Fachmann bekannt und kann u. a. einen akuten Myokardinfarkt, Schlaganfall, Emboli in der Lunge, zerebrovaskuläre Ereignisse, disseminierte intravasale Koagulation (DIC) oder tiefe Venenthrombose umfassen, sollte jedoch keinesfalls hierauf beschränkt sein.
Offensichtlich kann auch jede andere Störung, die mit der schädigenden Bildung von Fibringerinnseln in Zusammenhang steht, durch die Verwendung von suPAR oder des Komplexes der vorliegenden Erfindung behandelt oder verhindert werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von suPAR als stimulierendes Mittel für die fibrinolytische Aktivität von tcuPA, wobei suPAR in einem molaren Überschuss gegenüber dem tcuPA eingesetzt wird.
Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung eines Komplexes aus tcuPA und suPAR, in dem das Molverhältnis von suPAR zu tcuPA größer als 1 ist, zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei die Zusammensetzung insbesondere für die Behandlung von thrombotischen Ereignissen gedacht ist, die mit der Bildung von Fibringerinnseln in Zusammenhang stehen. Wie vorstehend angegeben können die thrombotischen Ereignisse, gegen die suPAR oder suPAR/tcuPA eingesetzt werden können, einen akuten Myokardinfarkt, Schlaganfall, Emboli in der Lunge, zerebrovaskuläre Ereignisse oder tiefe Venenthrombose umfassen.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele noch genauer beschrieben, die jedoch nur der Erläuterung dienen und in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken sollen, der durch die beiliegenden Patentansprüche definiert ist.
Beispiele
Material und Methoden
SuPAR war ein Geschenk von Dr. J. Henkin und Dr. A. Mazar, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL. Menschliches Fibrinogen und menschliches Thrombin wurden von Sigma, St. Louis, MO, bezogen. TcuPA wurde von American Diagnostics, Greenwich, CT, geliefert. Plasminogen wurde hergestellt, wie von Deutsch und Mertz beschrieben [Deutsch, D., und Mertz, E. T., Science 170: 1095–1096 (1970)]. Plasma wurde von der Blutbank des Hadassah Hospital erhalten. Das Blut, das zur Herstellung von Plasma verwendet wurde, wurde von gesunden Freiwilligen abgenommen. Das Blut (450 ml) wurde in von Travenol Laboratories, Ashdod, Israel, hergestellten Beuteln gesammelt, die 63 ml CPD-Lösung enthielten (enthaltend 1,66 g Natriumcitrat (wasserhaltig), 61 g Dextrose, 206 mg Zitronensäure und 140 mg basisches Natriumphosphat („moon basic sodium Phosphate")). Das Plasma wurde durch Zentrifugieren abgetrennt.
Radiomarkiertes Fibrinogen
Von Plasminogen befreites menschliches Fibrinogen (Fib 1–1340, American Diagnostics, Greenwich, CT) wurde mit ¹²⁵I radiomarkiert (NEN Life Sciences). Das ¹²⁵I-Fibrinogen (∼40 × 10⁶ cpm) wurde zu 1 ml unmarkiertem Fibrinogen (35 mg/ml) zugegeben, bevor die Mikroemboli hergestellt wurden.
Herstellen der Mikroemboli
Menschliches Blut von gesunden Freiwilligen wurde in Citrat (Endkonzentration 0,32 %) gesammelt. Sodann wurde das Plasma aus dem menschlichen Blut durch Zentrifugieren bei 1200 × g isoliert.
Gerinnsel wurden gebildet, indem zuerst 1 ml markiertes menschliches ¹²⁵I-Fibrinogen zu 2,5 ml Plasma zugegeben wurde. Danach wurden CaCl₂ und menschliches Thrombin (Sigma) in einer Endkonzentration von 20 mM bzw. 0,2 U/ml zugefügt, hierauf folgte eine Inkubation von einer Stunde bei Raumtemperatur und eine weitere Inkubation über Nacht bei 4°C. Von diesem Zeitpunkt ab wurden alle Schritte bei 4°C durchgeführt. Die Fibringerinnsel wurden auf die Deckel von Kulturschalen dekantiert und danach in kleine Stücke geschnitten und in 2 ml PBS-Puffer resuspendiert. Anschließend wurden die Mikroemboli in 13 ml PBS-Puffer suspendiert, der 3 mg/ml BSA enthielt. Unmittelbar vor der Injektion wurden die Präparate fünf Minuten sedimentiert, um alle größeren Aggregate zu entfernen, die möglicherweise gebildet wurden. Der Überstand wurde in 0,2-ml-Dosen für die Injektion aufgeteilt. Zufällige Aliquots von Mikroemboli wurden ausgewählt, an denen die Größenverteilung anhand eines Coulter-Zählers bestimmt wurde (vorher charakterisiert als 10 bis 100 μm).
Mäuse
Von uPA befreite Mäuse (uPA^-\--Mäuse) auf einem Hintergrund von 25% Swiss und 75% C57 Blank und Wurfgeschwister als Kontrollen wurden freundlicherweise von Dr. P. Carmeliet (Leuven, Belgien) zur Verfügung gestellt. Alle Mäuse wogen zum Zeitpunkt der Untersuchung 20 bis 30 g.
In vitro-Experimente
Feststellen der Fibrinolyse durch Reduktion der Gerinnselgröße
Menschliches Fibrinogen [Sigma, St. Louis, MO] wurde in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) oder in Plasma auf eine Konzentration von 9 mg/ml rekonstituiert, danach wurde menschliches Thrombin zugegeben (0,4 NIH U/ml), um Ge rinnsel zu bilden. Das Gemisch wurde auf Deckel von Kulturschalen dekantiert und 60 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem sich Gerinnsel gebildet hatten, wurden Aliquots einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, die tcuPA enthielt (10 pMol in 10 μl PBS), in Gegenwart oder in Abwesenheit von 0 bis 100 pMol suPAR jeweils zur Oberfläche des Gerinnsels zugegeben. Als Kontrolle dienten einige Deckel, die gebildete Gerinnsel enthielten und zu denen kein tcuPA zugegeben wurde. Danach wurden die Gerinnsel in Gegenwart oder in Abwesenheit von suPAR einen weiteren Zeitraum von zwei bis drei Stunden bei 37°C inkubiert, währenddessen wurde festgestellt, ob Lysebereiche entstanden. In diesem Stadium wurden die Gerinnsel mehrere Male mit PBS gewaschen und über Nacht mit 0,2% Trypanblau inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Gerinnsel viermal mit PBS gespült und photographiert. Die Größe der lytischen Zonen wurde durch das NIH-Bildprogramm berechnet (1).
Feststellen der Fibrinolyse durch Messen der freigesetzten Radioaktivität
Menschliches Fibrinogen (American Diagnostics USA) wurde mit ¹²⁵I radiomarkiert [Higazi, AA-R., et al., J. Biol. Chem. 270: 9472–9477 (1995)] und entweder in PBS-Lösung (pH 7,4) oder in Plasma bei einer Fibrinogenkonzentration von 3 mg/ml resuspendiert. Die endgültige Radioaktivität dieser Präparate betrug ∼30 000 cpm/ml. Gerinnsel wurden in 16-mm-Gewebekulturvertiefungen (Costar, Cambridge, MA) gebildet, indem zu jeder Vertiefung Thrombin (0,4 NIH U/ml) zugegeben wurde. Der Plasminogen-Aktivator (400 μl von HMW-tcuPA, 25 nM) wurde direkt in die Mitte jedes gebildeten Gerinnsels zugefügt, und nachdem eine Inkubation bestimmte Zeitspannen erfolgt war, wurden die Vertiefungen mit PBS gewaschen und die in die Waschlösung freigesetzte Radioaktivität durch einen Gammazähler bestimmt. 2 zeigt die Plasminogen-Aktivierung durch den Komplex suPAR/tcuPA nach einer Stunde Inkubation bei 37°C.
Die Fibrinolyse wurde auch wie früher beschrieben gemessen [Higazi, AA-R., et al., Biochem. J. 300: 251–255 (1994)], indem 0,4 ml Serum oder PBS, enthaltend den Plasminogen-Aktivator tcuPA (25 nM), in Gegenwart oder in Abwesenheit von suPAR (50 nM) zugegeben wurden. Die Platten wurden bei 37°C verschiedene Zeitspannen inkubiert, währenddessen wurden Aliquots zu 25 μl entnommen und die solubilisierte Markierung in einem Gammazähler gezählt. Die fibrinolytische Aktivität wurde bestimmt, indem die Freisetzung der markierten löslichen Abbauprodukte von Fibrin aus dem ¹²⁵Imarkierten Fibringerinnsel verfolgt wurde, und ist in 3 dargestellt.
Ergebnisse
Die Wirkung von suPAR auf die Aktivität von tcuPA wurde unter Verwendung der aus Plasma stammenden Gerinnsel untersucht. Die Aktivität von tcuPA wurde durch suPAR wesentlich stimuliert, wenn dieser in molaren Konzentrationen von größer als 1 : 1 vorlag (1 und 2). Diese Stimulation konnte durch ein aminoterminales Fragment von Urokinase (ATF) unterdrückt werden (das mit tcuPA um die Rezeptorbindung kompetiert). In Gegenwart von LMW-tcuPA, dem die Rezeptor-bindende Determinante fehlt, wurde keine Stimulation festgestellt (Werte nicht gezeigt). Wenn man die Wechselwirkung von tcuPA mit suPAR durch ein ATF blockierte, hatte dies zur Folge, dass der stimulatorische Effekt von suPAR auf die durch tcuPA vermittelte Fibrinolyse fast vollständig gehemmt wurde (1 und 2).
3 zeigt, dass die Rate der in Gegenwart von tcuPA/suPAR vermittelten Spaltung der Plasmagerinnsel größer war und dass diese Spaltung in einem größeren Ausmaß erfolgte als bei äquimolaren Konzentrationen von tcuPA.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass der stimulatorische Effekt von tcuPA auf einer Verunreinigung durch scuPA beruhte, wurde eine SDS-PAGE durchgeführt, die bestätigte, dass im Reaktionsgemisch kein scuPA vorlag (Ergebnisse nicht dargestellt).
Wenn Gerinnsel verwendet wurden, die aus gereinigtem Fibrinogen gebildet worden waren, konnte durch suPAR keine Stimulation der durch tcuPA vermittelten Fibrinolyse festgestellt werden.
Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass alle Komponenten, die erforderlich sind, dass suPAR die Aktivität von tcuPA stimulieren kann, in frisch isoliertem Serum vorliegen. Die Wirkung des Serums ging jedoch verloren, wenn es über Nacht bei 30°C gehalten wurde, während beim Plasma, das mehrere Tage unter den gleichen Bedingungen gehalten wurde, kein Verlust der stimulatorischen Aktivität festgestellt wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der (die) stimulatorische(n) Faktoren) im Serum während der Lagerung aktiviert wurde(n). Die Unterschiede zwischen Plasma und Serum weisen möglicherweise darauf hin, dass die Halbwertszeit des stimulatorischen Faktors nach Initiieren der Koagulation begrenzt ist. Weiterhin zeigen diese Ergebnisse, dass frisch gebildete Gerinnsel wirksamer lysiert werden als ältere Gerinnsel.
In vivo-Experimente
Wirkung von suPAR auf die Fähigkeit von tcuPA, Plasmagerinnsel in vivo zu spalten
Radiomarkierte Mikroemboli wurden in die Schwanzvene von Mäusen injiziert, und der Plasminogen-Aktivator wurde in die Drosselvene injiziert. Die fibrinolytische Aktivität der verschiedenen Mittel, d. h. tcuPA, tcuPA/suPAR oder suPAR alleine, wurde mit einer spontanen Lyse der Gerinnsel verglichen, die als Kontrolle diente, wobei die Rate gemessen wurde, mit der die Radioaktivität aus den Lungen der Mäuse entfernt wurde. Die in 4 dargestellten Ergebnisse zeigen deutlich, dass suPAR alleine zwar keine fibrinolytische Aktivität aufweist, dass jedoch in Gegenwart von tcuPA die fibrinolytische Wirkung, die durch die letztere Substanz vermittelt wird, wesentlich erhöht ist. Somit ist es offensichtlich, dass suPAR die durch tcuPA vermittelte Fibrinolyse stimuliert.
Verteilung von Mikroemboli
Frisch hergestellte Mikroemboli (15 bis 30 000 cpm/0,2 ml) wurden resuspendiert und in die Schwanzvene von Mäusen injiziert. Zehn Minuten, eine, drei und fünf Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse mit Metophan anästhesiert, anschließend wurde ihnen durch retroorbitale Punktion jeweils 0,1 ml Blut abgenommen und in ein heparinisiertes Kapillarröhrchen gefüllt. Danach wurden die Mäuse durch Ausrenken des Halses getötet und sofort ihre wichtigsten Organe entnommen, in Kochsalzlösung gespült, auf Filterpapier getrocknet und gewogen. Die Radioaktivität in jedem Gewebe wurde bestimmt, hieraus wurde die exakte Dosis (cpm) berechnet, die in jedes Tier injiziert worden war, wobei die in dem Röhrchen und in der Spritze verbliebene Radioaktivität von der ursprünglichen Menge abgezogen wurde.
Bei jeder Maus wurde die im Schwanz vorliegende Radioaktivität gemessen, um sicherzustellen, dass die Injektion in die Vene vollständig erfolgt ist. Pilotstudien zeigten anhand von Autoradiographie und Lichtmikroskopie, dass >50% der insgesamt injizierten Dosis von Mikroemboli in einem homologen Muster über die ganze Lunge verteilt waren. Im Gegensatz dazu wurden gefunden, dass weniger als 5% des ¹²⁵I-Fibrinogens in Verbindung mit den Lungen vorlagen.
Lyse von Lungen-Mikroemboli
uPA^-\--Mäuse und ihre syngenen Wildtyp-Geschwister aus dem gleichen Wurf wurden durch intraperitoneale Injektion von Nembutal anästhesiert. Anschließend wurde die Drosselvene unter Verwendung eines silikonisierten Polyethylenschlauchs kannüliert, sodann wurde PBS oder tcuPA (alleine, zusammen mit löslichem suPAR oder mit einer Kombination aus tcuPA/suPAR) über eine PHD 2000 Mehrspritzen-Pumpe mit einer Rate von 0,5 mg/kg/Std. oder 0,25 mg/kg/Std. 60 Minuten infundiert (i. v.-Infusion). Fünf Minuten nach Beginn der Infusion wurden ¹²⁵I-Mikroemboli in die Schwanzvene injiziert, währenddessen blieben die Mäuse anästhesiert. Am Ende der Infusion wurden die Mäuse getötet, die Gewebe entnommen und ihre Radioaktivität wie vorstehend beschrieben bestimmt.
Ergebnisse
4 zeigt, dass bei den uPA^-\--Mäusen, die im Vergleich zu den syngenen Wildtypmäusen eine schlechtere Lyse der Lungen-Mikroemboli aufweisen, die Lyse in Gegenwart von tcuPA gesteigert war und dass die Lyserate solcher Lungen-Mikroemboli in Gegenwart von tcuPA/suPAR wesentlich erhöht war. Dieses Ergebnis zeigt eindeutig den stimulatorischen Effekt von suPAR auf die thrombolytische Aktivität von tcuPA.

Claims

Komplex, umfassend tcuPA und suPAR, oder wenigstens ein funktionelles Fragment von suPAR, wobei das Molverhältnis von suPAR, oder dem funktionellen Fragment davon, zu tcuPA in dem Komplex größer als 1 ist, wobei der suPAR, oder das Fragment bzw. die Fragmente davon, die von tcuPA vermittelte fibrinolytische Aktivität unter physiologischen Bedingungen stimuliert.
Komplex nach Anspruch 1, wobei das Molverhältnis 10 : 1 ist.
Komplex nach Anspruch 1 oder 2, wobei die fibrinolytische Aktivität für im Wesentlichen frische Gerinnsel spezifisch ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als Wirkstoff eine therapeutisch wirksame Menge eines Komplexes, umfassend tcuPA und suPAR, wobei das Molverhältnis von suPAR zu tcuPA in dem Komplex größer als 1 ist, wobei der besagte suPAR die von tcuPA vermittelte fibrinolytische Aktivität stimuliert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Molverhältnis 10 : 1 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, außerdem umfassend pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel, Adjuvantien und Konservierungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, 5 oder 6 für die Behandlung von thrombotischen Ereignissen, die mit der Bildung von Fibringerinnseln in Zusammenhang stehen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die thrombotischen Ereignisse einen akuten Myokardinfarkt, Schlaganfall, Lungenemboli, cerebrovaskuläre Ereignisse, disseminierte intravasale Koagulation (DIC) oder tiefe Venenthrombose umfassen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 8 in einer Dosiseinheitsform.
Verwendung von einem tcuPA/suPAR-Komplex, wobei in diesem Komplex das Molverhältnis von suPAR zu tcuPA größer als 1 ist, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von thrombotischen Ereignissen, die mit der Bildung von Fibringerinnseln in Zusammenhang stehen.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Molverhältnis 10 : 1 ist.
Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, wobei die thrombotischen Ereignisse einen akuten Myokardinfarkt, Schlaganfall, Lungenemboli, cerebrovaskuläre Ereignisse, disseminierte intravasale Koagulation (DIC) oder tiefe Venenthrombose umfassen.