DE4445500A1

DE4445500A1 - Verfahren zur Herstellung von [1,4]-Benzodiazepindionen, insbesondere Aza-cycloalkyl-[1,4]-benzodiazepin-dionen aus N·alpha·-(2-Aminoaroyl)-Peptiden und Verwendung der durch dieses Verfahren erhältlichen Verbindungen in Screening-Methoden nach therapeutisch verwendbaren Verbindungen

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Publication number: DE4445500A1
Application number: DE19944445500
Authority: DE
Original assignee: Individual
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Priority date: 1994-12-20
Filing date: 1994-12-20
Publication date: 1996-06-27

Description

Die Benzodiazepine repräsentieren eine der umfangreichsten Strukturklassen pharmakologischer Wirkstoffe. Zu den bekanntesten Vertretern zählen Verbindungen, die unter den Handelsnamen Valium, Librium oder Adumbran bekannt geworden sind. Diese Benzodiazepinstrukturen sind auch heute noch Ausgangspunkt bei der Suche nach neuen Wirkstoffen mit spezifischen Bindungseigenschaften an unterschiedliche Rezeptorsysteme. Zu den interessanten Rezeptoren zählen sowohl klassische β-Adrenorezeptoren wie auch die CCK A- bzw. B-Rezeptoren. Oft findet sich auch die Benzodiazepinstruktur in natürlich vorkommenden Verbindungen wie Asperlicin oder Anthramycin, und diese Strukturen können zur Entwicklung von Wirkstoffindungskonzepten für Therapeutika zur Tumorbehandlung, als Analgetika (Opioid Rezeptorantagonisten), zur Entzündungshemmung, zur Behandlung von HIV-Infektionen (als Inhibitoren der Reversen Transkriptase) und insbesondere als Psychopharmaka für Angstzustände und/oder Depressionen sowie Epilepsie (auch CCK-Antagonisten) verwendet werden.

Für die Identifizierung von neuen Wirkstoffen ist es wünschenswert, Methoden zur Verfügung zu haben, die es erlauben, "in einem Syntheseschritt" mehrere Wirkstoffkandidaten auf einmal bereitzustellen und diese Mischung der Wirkstoffkandidaten wird dann in den üblichen Modellversuchen eingesetzt, um herauszufinden, ob in der Gruppe der neu hergestellten Verbindungen eine (oder mehrere) vorhanden sind, die die erwünschte Wirkung zeigen. Sofern eine Gruppe von Verbindungen die entsprechende Wirkung zeigt, werden die darin enthaltenen Verbindungen aufgetrennt und jeweils einzeln auf Wirksamkeit untersucht. Derartige Versuchsaufbauten werden als Wirkstoffindung mittels kombinatorisch angelegten Bibliotheken bezeichnet, der englische Fachterminus lautet "Combinatorial Synthesis of Large Libraries".

Von Bunin und Ellman wurde im J.Am.Chem.Soc. 1992, Vol. 114, S. 10997-10998, eine Methode vorgestellt, die es erlaubt, neben der Synthese von Einzelstrukturkandidaten auch einen bibliothekarisch angelegten Synthesepool für das biologische Screenen von 1,4-Benzodiazepinen heranzuziehen. Ausgangspunkt sind in dieser Literaturstelle an einem Festkörper vorübergehend verankerte 2-Aminobenzophenone, die über eine Peptidbindung an der 2-Aminogruppe derivatisiert werden und anschließend zyklisiert bzw. weiterderivatisiert werden. Die Abspaltung vom Festkörper liefert Benzodiazepin-Verbindungen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von [1,4]-Benzodiazepin-dionen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine allgemeine Verbindung der Formel I

worin R₁ die Bedeutung Alkyl, Aryl, Arylalkyl, Halogen, Cyano, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy hat, wobei die Alkyl- oder Arylreste gegebenenfalls durch Halogenatome substituiert sein können, Thioalkyl, Thioaryl, Carboxyl, Carboxyalkyl, Carboxyaryl, NH₂, Mono- oder Dialkylamin, Acyl, Aroylamid, Heterocycloalkyl, Heteroaryl mit 1-3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe N, O oder S, hat, wobei Cycloalkyl ein Ringsystem mit 3-7 Kohlenstoffatomen ist und die Arylreste 5- 6 Kohlenstoffatome aufweisen und die Alkylreste 1-10 Kohlenstoffatome aufweisen,
R₂ ein Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- oder Dialkylaminoalkylrest oder Wasserstoff ist, wobei die Alkylreste jeweils 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen und linear oder verzweigtkettig sein können,
R₃ Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ein Rest ist, der einer Seitengruppe einer natürlich vorkommenden Aminosäure entspricht oder eine Struktur ist, die eine Seitengruppe einer natürlich vorkommenden Aminosäure nachahmt oder eine funktionalisierte Gruppe davon ist,
R₄ Wasserstoff oder eine C₁ bis C₆-Alkylgruppe ist,
R₅ ein Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy- oder Aryloxyrest sein kann, wobei die Arylreste 5 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen und die Alkylreste 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen oder die Bedeutung Hydroxy, Halogen, Cyano oder Amino hat, oder
wobei die beiden Reste R₃und R₄ zusammengenommen eine zyklische Kohlenwasserstoffverbrückung mit der Einheit

-(CH₂)_n-

darstellen,
n die Bedeutung 1-5 hat
und einzelne Methylengruppen bei n < 1 durch Heteroatome wie N, O oder S ersetzt und einzelne Wasserstoffatome der Methylengruppe durch Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Hydroxy-, Cyano- oder Aminogruppen oder Halogen substituiert sein können, wobei die Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy- und Aryloxyreste die oben angegebene Anzahl von Kohlenstoffatomen aufweisen,
X eine Aminosäure darstellt, die gegebenenfalls mit weiteren Aminosäuren peptidisch verknüpft sein kann mit der Maßgabe, daß die erste Aminosäure eine die Spaltung assistierende freie Carboxylfunktion aufweist,
mit Säuren oder Peptidasen und anschließender Säurebehandlung zur Reaktion bringt und dadurch die Zyklisierung zu den entsprechenden 1,4-Benzodiazepinen bewirkt.

Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren im pH-Bereich zwischen 1 und 6,9 mit schwachen Säuren oder mit Peptidasen und anschließender Säurebehandlung durchgeführt.

Der Substituent R₃ kann neben Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen die Bedeutung einer Seitengruppe einer natürlich vorkommenden Aminosäure aufweisen. Unter natürlich vorkommender Aminosäure im Sinne der vorliegenden Erfindung werden die Aminosäuren Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Methionin, Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Thyrosin, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin oder Histidin verstanden. Wenn man die Aminosäuren mit der Formel R-CH(NH₂)-COOH darstellt, dann bedeutet der im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff Seitengruppe den Rest R. Dieser Rest kann also bedeuten Wasserstoff (für Glycin), Methyl (für Alanin) usw. Darüber hinaus umfaßt die Bedeutung von R₃ auch solche Strukturen, die in funktioneller Hinsicht der Seitengruppe einer Aminosäure entsprechen. Beispiele hierfür wären Naphthalinmethyl, Chlorbenzyl, 2- Methyl-, 4-Methyl-piperidyl. Weiterhin umfaßt die Bedeutung von R₃auch funktionalisierte Derivate der erwähnten Seitengruppen. Beispiele hierfür sind Urethangruppen, Guanidingruppen, Morpholinostrukturen, Anilin, wobei diese funktionellen Gruppen auch durch Spacergruppen wie -(CH₂)_n- mit n = 1-6 verbunden sein können.

In einer bevorzugten Form wird das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I durchgeführt, worin R₁, R₄, R₅ und X wie oben definiert sind,
R₂ ein Alkyl oder Dialkylaminoalkylrest oder Wasserstoff ist, wobei die Alkylreste jeweils 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen und linear oder verzweigtkettig sein können,
R₃ein Rest ist, der einer Seitengruppe einer natürlich vorkommenden Aminosäure entspricht oder eine Struktur ist, die eine Seitengruppe einer natürlich vorkommenden Aminosäure nachahmt oder eine funktionalisierte Gruppe davon ist, oder
wobei die beiden Reste R₃und R₄ zusammengenommen die Bedeutung

haben, wobei die Substituenten R₆und R₇unabhängig voneinander ausgewählt sein können unter Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy- oder Aryloxyresten, die die oben angegebene Anzahl von Kohlenstoffatomen aufweisen oder die Bedeutung Hydroxy, Halogen, Cyano oder Amino haben können und
n die Bedeutung 1-3 hat.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist in bevorzugter Form ein Verfahren zur Herstellung von Benzodiazepinderivaten, die ein Ringsystem aufweisen das aus drei miteinander kondensierten Ringen besteht. Dabei ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Aza-cycloalkyl-[1,4]- benzodiazepin-dionen dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

worin die Substituenten R₁, R₂, R₅ und X die oben angegebene Bedeutung haben, einzelne Wasserstoffatome der Methylengruppen der -(CH₂)_n-Einheit durch die oben genannten Gruppen substituiert sein können, n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 ist und bei n < 1 einzelne Methylengruppen der -(CH₂)_n-Einheit durch Heteroatome wie N, O oder S ersetzt sein können, mit Säuren oder Peptidasen und anschließender Säurebehandlung zur Reaktion bringt und dadurch die Zyklisierung zu Aza-cycloalkyl-[1,4]-benzodiazepinen bewirkt.

Insbesondere wird ein Verfahren zur Herstellung von Aza cycloalkyl-[1,4]-benzodiazepin-dionen bevorzugt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel III

worin die Substituenten R₁ R₂, R₅, R₆ R₇ und X die oben angegebene Bedeutung haben und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 ist im pH-Bereich zwischen 1 und 6,9 mit schwachen Säuren oder mit Peptidasen und anschließender Säurebehandlung zur Reaktion bringt und dadurch die Zyklisierung zu den Aza cycloalkyl-[1,4]-benzodiazepinen bewirkt.

Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens ist beispielhaft in Abb. 1 dargestellt. Hierzu wird ein Peptid synthetisiert, das am Aminoterminus einen 2-Aminobenzoylrest (Abz) enthält. Dieser Aminobenzoylrest ist mit einem Prolinderivat verbunden, das auf der anderen Seite mit einer Aminosäure verbunden ist, die eine die Abspaltung assistierende Carboxylfunktion aufweist. Derartige Aminosäuren sind bevorzugt Asparaginsäure, Glutaminsäure und andere homologe oder verzweigtkettige Aminosäuren mit mindestens einer freien Carboxylfunktion in der Seitenkette. An diese Aminosäure mit der die Hydrolyse assistierenden Carboxylfunktion können sich weitere Aminosäuren anschließen.

Interessant an den erfindungsgemäß verwendeten Strukturen ist, daß unter üblichen Abspaltbedingungen bei nach Festträgermethoden hergestellten Abz-Peptiden (95%ige wäßrige Trifluoressigsäure) keine Hydrolyse der Peptidbindung zu dem Prolinderivat beobachtet werden kann. Daher können die Peptide nach der Synthese an die Festphase ohne Schwierigkeiten von dem Trägermaterial abgespalten werden.

Wenn aber anschließend die von Schutzgruppen befreiten, wie oben beschrieben aufgebauten Peptide einer sauren Behandlung, bevorzugt im schwach sauren Bereich (pH 1-6,9) mit schwachen Säuren, ausgesetzt werden, dann wird die Peptidbindung zwischen dem Prolinderivat und der benachbarten Aminosäure dann gespalten, wenn diese benachbarte Aminosäure eine die Hydrolyse unterstützende Carboxylfunktion aufweist. Diese Spaltung kann alternativ auch durch Enzyme, insbesondere Endo-Peptidasen, erzielt werden.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist essentiell, daß eine Ringbildung möglich ist. Hierzu muß der Rest X eine Aminosäure sein, die eine Carboxylgruppe aufweist. Eine derartige Carboxylgruppe liegt immer dann vor, wenn x die Bedeutung einer Aminosäure mit freier Carboxylgruppe hat. Hat X die Bedeutung einer Aminosäure, die mit wenigstens einer weiteren Aminosäure peptidisch verknüpft ist, dann muß dieser peptidisch an die Aminosäure X verknüpfte Peptidteil bis zur Aminosäure X abspaltbar sein (z. B. enzymatisch). Ohne diese vorhergehende Abspaltung zur freien Aminosäure X ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft durchführbar, wenn X eine Aminosäure ist, die eine zusätzliche freie Carboxylgruppe trägt, wie insbesonders Asparaginsäure oder Glutaminsäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Substituent X die Bedeutung einer freien α- oder β-Aminosäure, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren weiteren Aminosäuren zu einem Peptid verbunden ist.

Ganz besonders bevorzugt ist hierbei, wenn X die Bedeutung Asp-Yyy hat, wobei Asp Asparaginsäure ist und Yyy eine α- Aminosäure oder ein Peptid ist.

Die Zyklisierung wird unter geeigneten Voraussetzungen direkt im sauren wässrigen Medium, bevorzugt bei einem pH-Wert zwischen 2 und 5, durchgeführt. Besonders bevorzugt wird die Verbindung gemäß Formel I, II oder III zunächst enzymatisch behandelt, wodurch die Spaltung aus einem Peptid-Precursor zu einer erfindungsgemäß zur Zyklisierung befähigten Struktur erfolgt und diese Verbindung dann unter sauren, bis hin zu physiologischen pH-Bedingungen zyklisiert wird. Bevorzugt wird hierbei ein pH-Wert im Bereich zwischen 1 und 6,9, insbesondere 2-6.

Für die Herstellung von N₁₀-Alkyl-pyrrolo-[1,4]- benzodiazepin-dionen werden in bevorzugter Form 2-N- Alkylaminaroylverbindungen eingesetzt.

Verbindungen, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar sind, werden bevorzugt zum Screenen auf biologische Wirksamkeit dieser Verbindungen eingesetzt, wobei die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen mit einer oder mehreren Zielstrukturen, insbesondere Rezeptoren oder Enzymen, zusammengebracht werden, um die Affinität dieser Verbindungen zu der Zielstruktur zu ermitteln.

In bevorzugter Ausführungsform werden hierbei zunächst der Formel I, II bzw. III entsprechende Peptidsequenzen ausgehend vom C-Terminus an festen Trägersystemen aufgebaut und als X unterschiedliche Aminosäuren ansynthetisiert. Die so erhaltenen unterschiedlichen Wirkstoffvorläufer werden dann von dem Trägersystem abgespalten und anschließend durch Reaktion mit schwacher Säurebehandlung zyklisiert.

Als Säuren für die Zyklisierungsreaktion kommen nach Abspaltung der Schutzgruppen alle Säuren in geeigneten Konzentrationen und Medien oder Puffer-Systemen in Betracht, wie z. B. 0,01 bis 5% TFA oder 0,01 bis 1 molare Ammonacetat- Puffer. Überraschend ist bei dieser Reaktion, daß sie weder unter den stark sauren Bedingungen einer Schutzgruppenabspaltung während einer Solid-Phase-Peptid- Synthese (SPPS) noch unter den alkalischen Abspaltbedingungen einer SPPS nach der FMOC-Strategie erfolgt.

Als Enzyme kommen bei den bevorzugten Ausführungsformen (Formeln II und III) solche in Frage, die spezifisch Prolin- Yyy spalten oder für die Zzz-Prolin nicht angreifbar sind (Yyy = irgendeine L-Aminosäure oder eine damit verknüpfte Peptidkette; Zzz = Aroylverbindung). Beispiele hierfür sind carboxypeptidase P und Endopeptidase AspN. Die Enzym- Spaltungszyklisierung kann dabei auch nacheinander erfolgen, wobei das Enzymoptimum z. B. bei pH 8,0 liegen kann und die Zyklisierung durch pH-Einstellung in den sauren Bereich (bevorzugt pH 1-6,9) erfolgt.

Durch den C-terminalen Aufbau einer geeigneten Peptidkette in an sich bekannter Weise und abschließende Kupplung einer Aminosäure, die bevorzugt Prolin ist, und des 2-Aminoaroyl- Derivates oder 2-Aminoaroyl-prolin-Derivates lassen sich an Festkörpern Wirkstoff-Precurser-Libraries aufbauen und nach der erfindungsgemäßen Methode in die potentiellen Wirkstoffkandidaten überführen.

Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist, daß erfindungsgemäß geeignete lineare, peptidische 2-Aminoaroyl-Verbindungen als "Prodrug" verwendet werden können; diese haben interessante Effekte bezüglich Wirkungsselektivität, -eintritt, Bioverfügbarkeit und Nebenwirkungen im Vergleich zu den "unbiologischen" Wirkstoffen.

Die so erhaltenen Prodrug-Verbindungen sind geeignet, als "physiologische" Peptide vorteilhaft in modifizierter Form in das physiologische System eingeschleust zu werden und an den gewünschten Wirkungsort (Zelle, Rezeptor etc.) zu gelangen, um dort z. B. im Rezeptor-Verbund in der eigentlichen Wirkform in kontinuierlicher Zyklisierung (= "Dosierung") zur gewünschten Geltung zu kommen (Wirkstoff-Targeting). Auch die Überwindung bestimmter Organ- oder Zell-Barrieren (wie z. B. die Blut-Hirn-Schranke) läßt sich über derartige Modifizierungen von an sich physiologischen Prodrugs bewirken. Beispiele derartiger Modifikationen sind Glykosylierung, Laktosylierung oder die Einführung gezielter Oligosaccharid- oder Lipid-Strukturen.

Selbstverständlich können die so erhaltenen 1,4- Benzodiazepine in den bekannten Positionen nach üblichen Methoden weiter derivatisiert werden.

Besonders vorteilhaft bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, daß auf einfache Weise und in hoher Ausbeute die 1,4- Benzodiazepin-Strukturen synthetisiert werden können, wobei die Stereoselektivität des Syntheseverfahrens gegeben ist.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung im einzelnen:

Beispiel 1

10 g 2-Aminobenzoyl-Pro-Asp-Leu-Phe-Tyr(NO₂ )-Ser-Gly-OH wurden 50h mit 100 ml 0.1% TFA (pH=2) bei RT behandelt. Es resultierten in einer Ausbeute von 65% (+)-1,2,3,11a- Tetrahydro-5H-pyrrolo[2,1-c] [1,4]-benzodiazepin-5,11(10H) dion (I) und in 81% H-Asp-Leu-Phe-Tyr(NO₂)-Ser-GlyOH. I war mit den der Literatur entnommenen Daten identisch. Darüber hinaus wurde die Struktur zweifelsfrei durch FAB-MS und ¹H- NMR identifiziert.

Beispiel 2

10 g 2-Aminobenzoyl-Pro-Asp-OH wurden 40h mit 100 ml 1% TFA bei Raumtemperatur behandelt. Man erhielt 95% I und 85% Asparaginsäure. I war identisch mit der Struktur I gemäß Beispiel 1.

Vergleichsbeispiel 3

5 g Boc-2-Aminobenzoyl-Pro-Asp(OtBu)-OtBu werden mit 50 ml 100%iger Trifluoressigsäure (TFA) über 8h behandelt. Es entstand keinerlei Benzodiazepinstruktur.

Beispiel 4

20 g 2-Aminobenzoyl-Pro-β-Ala-OH wurden 30h mit 100 ml 1.5% TFA bei 40°C gerührt. Ausbeute an I: 92%; β-Ala wurde nicht aufgearbeitet. Daten für I identisch mit Beispiel 1.

Beispiel 5

Jeweils 1 g 2-Aminobenzoyl-Pro-Gly-OH wurden bei pH-Werten von 6, 4, 2 und 1,69 bei RT umgesetzt und die Spaltungs- bzw. Zyklisierungsgeschwindigkeit gemessen. Das Ergebnis gibt Abb. 2 wieder; bereits bei schwach sauren Bedingungen läuft die Reaktion ab und wird mit zunehmenden Säure-Graden schneller.

Vergleichsbeispiel 6

5 g Boc-2-Aminobenzoyl-Pro-Gly-OH werden mit 50 ml 95%iger TFA (CF₃COOH) 80 Stdn. bei 40°C behandelt (Spaltbedingungen für Peptide von Trägermaterialien). Benzodiazepine ließen sich allenfalls in Spuren nachweisen.

Beispiel 7

10 g 2-Aminobenzoyl-Pro-Glu-Leu-Ala-OH 48h bei RT in 100 ml 0.05 M Ammonacetat ergab 62% I und 85% des Tripeptids Glu- Leu-Ala-OH. Daten für I identisch mit I aus Beispiel 1.

Beispiel 8

2 g 2-Amino-5-Fluorbenzoyl-Pro-Asp-Ala-OH wurden 10h mit 50 ml 1% TFA bei 40°C behandelt. Aufarbeitung ergab 83% (+)-7-Fluor-1,2,3,11a-tetrahydro-5H-pyrrolo-[2,1- c] [1,4]-benzodiazepin-5,11(10H)-dion mit den in der Literatur beschriebenen Daten. Zusätzlich wurde die Struktur durch FAB- MS und NMR-Spektroskopie bestätigt.

Beispiel 9

2 g 2-Aminobenzoyl-cis-5-methyl-Pro-Asp-Ala-Leu-OH wurden 10h bei 40°C mit 50 ml 0.5% HBr Lsg. unter intensiver Rührung behandelt. Aufarbeitung mittels Toluolextraktion ergab cis- 1,2,3,11a-Tetrahydro-3-methyl-5H-pyrrolo[2,1-c] [1,4]- benzodiazepin-5,11(10H)-dion in einer Ausbeute von 62%; Schmp.: 168-171°C (Lit. 169-171°C).

Beispiel 10

5 g 2-Aminobenzoyl-Pro(4-OH)-Asp-Leu-Phe-OH wurden 30h mit 100 ml 0.1%iger TFA bei 30°C behandelt. Das Isolat aus der Toluolextraktion wurde mit 95% wäßriger TFA behandelt. Der Rückstand ergab nach TFA-Verdampfung R.R-1,2,3, 11a- Tetrahydro-4-Hydroxy-5H-pyrrolo[2,1-c] [1,4]-benzodiazepin- 5,11(10H)-dion nach Kristallisation aus Äthanol; Ausbeute 65%. Identifizierung der nicht beschriebenen Substanz erfolgte durch FAB-MS und ¹H-NMR.

Beispiel 11

5 g 2-Methylaminobenzoyl-cis-5-Methyl-Pro-Asp-Leu-Phe-OH wurden in 0.5%iger TFA-Lösung für 40h bei 40°C gerührt. Extraktive Aufarbeitung mit Toluol/Wasser ergab 75% cis- 1,2,3,11a-Tetrahydro-3,10-dimethyl-5H-pyrrolo[2,1-c] [1,4]- benzodiazepin-5,11(10H)-dion. Analytische Daten stimmen mit den in der Literatur genannten überein.

Beispiel 12

5 mg 2-Aminobenzoyl-Pro-Asp-Leu-Phe-OH wurden in 5 ml wäßriger Lösung 3.5h bei pH 8.0 mit 5 µg Endopeptidase-AspN 48h bei 37°C behandelt. Verbindung I wurde innerhalb von 2h bei pH 3,0 mit einer Ausbeute von 92% gebildet; sie war in ihren Kenndaten (HPLC) identisch mit Verbindung I aus Beispiel 1.

Beispiel 13

1 mg 2-Aminobenzoyl-Pro-Asp-Leu-Phe-OH wurde in 1 ml Phosphatpuffer bei pH 6.0 mit Carboxypeptidase P bei 37°C behandelt. Nach 24h hatten sich gemäß HPLC-Monitoring 50% 2- Aminobenzoyl-Prolin und 32% I gebildet; pH-Senkung auf 3 vollendete die Reaktion innerhalb von 2h bei 40°C.

Beispiel 14

An dem Festkörperträger TentaGel AC wird mit Fmoc-Strategie die Sequenz Asp-Leu-Phe-TG aufgebaut. Andererseits werden die Verbindungen 2-Amino-5-Fluor-, 2-Amino-5-Chlor- und 2-Amino- 5-Brombenzoyl-Pro synthetisiert. Nach der "tea-bag"-Methode von R.A. Houghten werden die unterschiedlichen Pro- Verbindungen mit den festkörpergebundenen Peptidsequenzen mittels der HBTU-Methode gekoppelt. Spaltung der "tea-bags" mit

A) Spalt-Säure (95%ige TFA)
B) Zyklisierungssäure (1%ige TFA)

ergibt die erwarteten drei unterschiedlich halogensubstituierten [1,4]-Benzodiazepine.

Die Strukturen wurden durch Substanzvergleich (siehe Beispiel 8) und durch FAB-MS sowie HPLC-Vergleich mit authentischen Substanzen bewiesen.

Beispiel 15

An dem Festkörperträger (Polyhipe "Nova Syn PA500") wurde mit Fmoc-Strategie die Sequenz Asp-Leu-Phe-PH aufgebaut. Das gleichmäßig beladene Harz wurde in "tea-bags" aufgeteilt und hälftig mit den Aminosäuren Prolin und cis-5-Methyl-Pro weitergekuppelt. Anschließend wurden diese abermals geteilt und jeweils mit 2-Fmoc-Amino-5-Fluor-, 2-Fmoc-Amino-5-Chlor- bzw. 2-Fmoc-methylamino-benzoesäure mit HBTU-Methode gekoppelt. Aufarbeitung gemäß Beispiel 14 ergab "aus einem Ansatz" die erwarteten 6 verschiedenen Benzodiazepinderivate.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von [1,4]-Benzodiazepin-dionen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I worin R₁ die Bedeutung Alkyl, Aryl, Arylalkyl, Halogen, Cyano, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy hat, wobei die Alkyl- oder Arylreste gegebenenfalls durch Halogenatome substituiert sein können, Thioalkyl, Thioaryl, Carboxyl, Carboxyalkyl, Carboxyaryl, NH₂, Mono- oder Dialkylamin, Acyl, Aroylamid, Heterocycloalkyl, Heteroaryl mit 1-3 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe N, O oder S, hat, wobei Cycloalkyl ein Ringsystem mit 3-7 Kohlenstoffatomen ist und die Arylreste 5- 6 Kohlenstoffatome aufweisen und die Alkylreste 1-10 Kohlenstoffatome aufweisen,
R₂ ein Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- oder Dialkylaminoalkylrest oder Wasserstoff ist, wobei die Alkylreste jeweils 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen und linear oder verzweigtkettig sein können,
R₃ Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder ein Rest ist, der einer Seitengruppe einer natürlich vorkommenden Aminosäure entspricht oder eine Struktur ist, die eine Seitengruppe einer natürlich vorkommenden Aminosäure nachahmt oder eine funktionalisierte Gruppe davon ist,
R₄ Wasserstoff oder eine C₁ bis C₆-Alkylgruppe ist,
R₅ ein Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy- oder Aryloxyrest sein kann, wobei die Arylreste 5 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen und die Alkylreste 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen oder die Bedeutung Hydroxy, Halogen, Cyano oder Amino hat, oder
wobei die beiden Reste R₃ und R₄ zusammengenommen eine zyklische Kohlenwasserstoffverbrückung mit der Einheit-(CH₂)_n-darstellen,
n die Bedeutung 1-5 hat
und einzelne Methylengruppen bei n < 1 durch Heteroatome wie N, O oder S ersetzt und einzelne Wasserstoffatome der Methylengruppen durch Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Hydroxy-, Cyano- oder Aminogruppen oder Halogen substituiert sein können, wobei die Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy- und Aryloxyreste die oben angegebene Anzahl von Kohlenstoffatomen aufweisen,
X eine Aminosäure darstellt, die gegebenenfalls mit weiteren Aminosäuren peptidisch verknüpft sein kann mit der Maßgabe, daß die erste Aminosäure eine die Spaltung assistierende freie Carboxylfunktion aufweist,
mit Säuren oder Peptidasen und anschließender Säurebehandlung zur Reaktion bringt und dadurch die Zyklisierung zu den entsprechenden 1,4-Benzodiazepinen bewirkt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von [1,4]- Benzodiazepin-dionen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I im pH-Bereich zwischen 1 und 6,9 mit schwachen Säuren oder mit Peptidasen und anschließender Säurebehandlung zur Reaktion bringt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von [1,4]-Benzodiazepin-dionen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I,
worin R₁, R₄, R₅ und X die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben,
R₂ ein Alkyl- oder Dialkylaminoalkylrest oder Wasserstoff ist, wobei die Alkylreste jeweils 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen und linear oder verzweigtkettig sein können,
R₃ ein Rest ist, der einer Seitengruppe einer natürlich vorkommenden Aminosäure entspricht oder eine Struktur ist, die eine Seitengruppe einer natürlich vorkommenden Aminosäure nachahmt oder eine funktionalisierte Gruppe davon ist, oder
wobei die beiden Reste R₃ und R₄ zusammengenommen die Bedeutung haben, wobei die Substituenten R₆ und R₇ unabhängig voneinander ausgewählt sein können unter Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkoxy- oder Aryloxyresten, die die in Anspruch 1 angegebene Anzahl von Kohlenstoffatomen aufweisen oder die Bedeutung Hydroxy, Halogen, Cyano oder Amino haben können und
n die Bedeutung 1-3 hat,
im pH-Bereich zwischen 1 und 6,9 mit schwachen Säuren oder mit Peptidasen und anschließender Säurebehandlung zur Reaktion bringt und dadurch die Zyklisierung zu den entsprechenden 1,4-Benzodiazepinen bewirkt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von Aza-cycloalkyl-[1,4]-benzodiazepin-dionen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II worin die Substituenten R₁, R₂, R₅ und X die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, einzelne Wasserstoffatome der Methylengruppen der -(CH₂)_n-Einheit durch die in Anspruch 1 genannten Gruppen substituiert sein können, n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5 ist und bei n < 1 einzelne Methylengruppen der -(CH₂)_n-Einheit durch Heteroatome wie N, O oder S ersetzt sein können, mit Säuren oder Peptidasen und anschließender Säurebehandlung zur Reaktion bringt und dadurch die Zyklisierung zu Aza-cycloalkyl-[1,4]-benzodiazepinen bewirkt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der allgemeinen Formel II im pH-Bereich zwischen 1 und 6,9 mit schwachen Säuren oder mit Peptidasen und anschließender Säurebehandlung zur Reaktion bringt.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung von Aza-cycloalkyl-[1,4]-benzodiazepin-dionen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel III worin die Substituenten R₁, R₂, R₅, R₆, R₇ und X die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 ist im pH-Bereich zwischen 1 und 6,9 mit schwachen Säuren oder mit Peptidasen und anschließender Säurebehandlung zur Reaktion bringt und dadurch die Zyklisierung zu den Aza-cycloalkyl-[1,4]-benzodiazepinen bewirkt.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß X eine freie α- oder β-Aminosäure ist, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren weiteren Aminosäuren zu einem Peptid verbunden ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß X die Bedeutung Asp-Yyy hat, wobei Asp Asparaginsäure ist und Yyy eine a-Aminosäure oder ein Peptid ist.

9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zyklisierung bei einem pH- Wert zwischen 2 und 5 durchgeführt wird.

10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung gemäß Formel I, II oder III zunächst enzymatisch behandelt wird, wodurch eine Abspaltung aus den Peptid-Precursern erzielt wird und die Verbindung im sauren Medium zyklisiert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das saure Medium einen pH-Wert im Bereich zwischen 1 und 6,9, bevorzugt 2-6, aufweist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 6 zur Herstellung von N₁₀- Alkyl-pyrrolo-[1,4]-benzodiazepin-dionen, dadurch gekennzeichnet, daß man 2-N-Alkylaminaroylverbindungen einsetzt.

13. Verwendung von Verbindungen, die gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 herstellbar sind, zum Screenen auf biologische Wirksamkeit dieser Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß die nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 herstellbaren Verbindungen mit einer oder mehreren Zielstrukturen, insbesondere Rezeptoren oder Enzymen, zusammengebracht werden, um die Affinität dieser Verbindungen zu der Zielstruktur zu ermitteln.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine der Formel I, II oder III entsprechende Peptidsequenz ausgehend vom C-Terminus an festen Trägersystemen aufbaut, ab dem Prolin-Derivat gleichzeitig unterschiedliche Aminosäuren ansynthetisiert, die so erhaltenen unterschiedlichen Wirkstoffvorläufer von dem Trägersystem abspaltet und anschließend durch Umsetzung bei einem pH-Wert zwischen 1 und 6,9 und/oder durch Behandlung mit Peptiden zyklisiert.

15. Verwendung von Verbindungen, die gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 herstellbar sind, als biologische Depot- oder Precursor-Wirkstoffe zur Bildung entsprechender Benzodiazepin-Wirkstoffe im Organismus.

16. Verwendung von Verbindungen, die gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 herstellbar sind, in Form modifizierter Precursor, wobei die Modifizierung durch Kombination mit Glyco-, Lacto-, Oligosaccharido- oder Lipidstrukturen erhältlich ist, mit vorteilhaften Targetingeigenschaften.