DE4401076A1 - Vorrichtung zur Injektion von Flüssigkeiten in biologische Zellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung der im Oberbegriff des An­ spruchs 1 genannten Art.

Für mikrobiologische Arbeiten an Zellen werden Vorrichtungen benötigt, bei denen mit einem Aufbau, wie er beispielsweise in der EP 0 332 864 B1 beschrieben ist, Kanülen in Zellen gestochen wer­ den, um Flüssigkeiten zu injizieren, die beispielsweise DNA ent­ halten.

Die Kanülen sind außerordentlich eng und die verwendeten Flüssig­ keiten relativ hochviskos, so daß Injektionsdrücke im Bereich 1 bar erforderlich sind.

Zum ordnungsgemäßen Betrieb der Kanüle sind in der Regel meh­ rere Drücke erforderlich. Ein Injektionsdruck, der über eine ge­ wisse Zeit einzustellen ist, sorgt für den Austritt von Flüssigkeit aus der Kanüle in die Zelle. Zwischen den Injektionen kann ein gerin­ gerer Ruhedruck erforderlich sein. Von Zeit zu Zeit kann ein we­ sentlich höherer Reinigungsdruck erforderlich sein, um Verstop­ fungen zu beseitigen.

In der DE 35 31 241 C2 ist ein Gasdruckerzeuger beschrieben, der mit einem Drucksensor den Druck im Schlauch überwacht und einen Kolben oder eine Membran in Regelung durch den Drucksen­ sor mit zur Erzeugung des jeweils gewünschten Druckes benötigter Kraft beaufschlagt. Mit dieser Konstruktion kann zwar jeder Druck und jeder Druckverlauf in gewünschter Weise eingestellt werden. Es ergeben sich bei dieser Konstruktion aber eine Reihe technologi­ scher Probleme, die schwer beherrschbar sind.

Eine gattungsgemäße Konstruktion ist in der DE 32 04 040 C2 be­ schrieben. In dieser Konstruktion ist der Schlauch über Schaltven­ tile an unterschiedliche Drücke P₁, P₂ und P₃, die den vorerwähn­ ten Zwecken dienen, anschließbar. Dafür sind drei separate Druck­ quellen vorgesehen, die jeweils über ein Schaltventil an den Schlauch anschließbar sind und die mit Druckregeleinrichtungen den jeweils gewünschten Druck vorhalten.

Bei dieser bekannten Konstruktion sind für jede der benötigten Druckquellen Druckregeleinrichtungen erforderlich, die zudem bei der gewählten Konstruktionsweise für ordnungsgemäßen Betrieb erhebliche Gasströme benötigen. Es sind daher Preßluftflaschen, ein Preßlufthausanschluß oder größere Kompressoren erforderlich, die schon aus Lärm- und Vibrationsgründen in der Nähe eines Mikroskopzellarbeitsplatzes nicht zugelassen werden können. Zu­ dem stehen die verbrauchten Gasmengen in kraßem Mißverhältnis zu den injizierten Flüssigkeitsvolumina, die im Femtoliterbereich liegen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Vor­ richtung der eingangs genannten Art zu schaffen, die bei einfache­ rem Aufbau störungsfrei in der Nähe des Arbeitsplatzes betreibbar ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den Merkmalen des Kennzeichnungsteils des Anspruches 1 gelöst.

Erfindungsgemäß ist der Schlauch mit einem Einlaßventil an eine Vordruckquelle und mit einem Auslaßventil an die Atmosphäre an­ geschlossen. Der Druck im Schlauch wird mit einem Drucksensor überwacht. Die Steuereinrichtung ist zur Erzeugung eines be­ stimmten Solldruckes im Schlauch auf diesen Solldruck eingestellt und vergleicht mit dem gemessenen Druck. Liegt der Druck zu hoch, so wird abgeblasen. Liegt der Druck zu niedrig, wird Druck­ gas von der Vordruckquelle zugelassen. Auf diese Weise werden aus dem Schlauch jeweils nur geringe Gasmengen abgelassen bzw. zur Druckerhöhung geringe Gasmengen dem Schlauch zugeführt, die ausreichen, um in dem relativ geringen Schlauchvolumen, das beispielsweise nur bei 1 ml liegt, die entsprechende Druckanpas­ sung vorzunehmen. Die Vordruckquelle muß daher nur äußerst ge­ ringe Gasmengen liefern, so daß zur Versorgung kleine Druck­ gaspatronen oder kleine sehr ruhig und leise arbeitende Druckpum­ pen ausreichen. Der Gaserzeuger kann daher sehr kostengünstig und äußerst ruhig und leise arbeitend ausgebildet werden.

Da das gesamte zwischen der Kanüle und den Ventilen liegende Volumen des Schlauches sehr klein ist, beispielsweise nur etwa 1 ml beträgt, wird beim Öffnen des jeweiligen Ventiles sehr schnell der jeweilige Enddruck, also der Druck der Vordruckquelle oder der Atmosphärendruck, erreicht. Die Ventile müssen daher sehr präzise und äußerst schnell gesteuert werden, um genau bei Errei­ chen des gewünschten Druckes wieder zu schließen. Mit den Merk­ malen des Anspruches 2 läßt sich dieses Problem vermeiden. Durch die Drosseln wird der bei geöffnetem Ventil in den Schlauch bzw. aus dem Schlauch strömende Gasstrom gedrosselt, so daß sich der Druck im Schlauch langsam ändert. Auch mit langsamer schal­ tenden, wesentlich billigeren Schaltventilen läßt sich der Ist-Druck präzise dem Soll-Druck anpassen.

Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 3 vorgesehen. Der Drosselwiderstand in der Einlaßleitung und der Drosselwiderstand in der Auslaßleitung bestimmen die Druckanstiegs- und die Druckabfallgeschwindigkeit im Schlauch. Wird jeweils zwischen­ durch zusätzlich geschaltet, also der Druck stufenweise erhöht bzw. abgesenkt, so können auch langsamere Anstiegs- und Abfallge­ schwindigkeiten erreicht werden. Die Drosselwiderstände bestim­ men jedoch die maximal erreichbaren Druckänderungsgeschwindig­ keiten, die jeweils bei ständig offengehaltenen Ventilen sich ein­ stellen. Diese können durch entsprechende Wahl der Strömungswi­ derstände der Drosseln in gewünschter Weise vorgegeben sein, um beispielsweise einerseits möglichst rasche Druckeinstellungen zu erlauben, andererseits aber Störungen zu vermeiden, beispielsweise Schwingungsbeeinträchtigungen des Manipulators durch Druck­ stöße.

Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 4 vorgesehen. Zwi­ schen den Drosseln und den zugehörigen Ventilen bildet das dazwi­ schen befindliche Leitungsstück ein Totvolumen, das jeweils nach Betätigung des Ventiles unerwünschte Druckschwankungen erzeu­ gen kann. Werden die Leitungsabstände zwischen den Drosseln und den Ventilen soweit wie möglich verringert, so verringern sich die durch die Totvolumina bedingten Störungen.

Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 5 vorgesehen. Auf diese Weise werden die erwähnten Totvolumina vollständig vermie­ den.

Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 6 vorgesehen. Auf diese Weise läßt sich die Vordruckquelle besonders einfach und ko­ stengünstig vorsehen. Der Vorratsbehälter kann in seinem Volumen sehr groß gewählt werden. Beispielsweise ergibt bereits ein Volu­ men des Vorratsbehälters von 100 ml einen sehr günstigen Faktor von 100 : 1 gegenüber dem typischen Volumen von 1 ml des Schlauches. Die erforderliche Druckpumpe zum Nachfüllen des Vorratsbehälters kann sehr einfach und diskontinuierlich arbeitend, beispielsweise als einfachst konstruierte Kolbenpumpe ausgebildet sein.

Vorteilhaft sind die Merkmale des Anspruches 7 vorgesehen. Durch das große Volumenverhältnis zwischen dem Volumen des Vorrats­ behälters und dem Volumen des Schlauches läßt sich eine solche Regeleinrichtung sehr einfach vorsehen, da die verbrauchsbedingten Druckschwankungen im Vorratsbehälter sehr gering sind. Ein kon­ stantgehaltener Druck im Vorratsbehälter ergibt den Vorteil, daß die Drossel in der Einlaßleitung mit konstantem Vordruck beauf­ schlagt wird, sich also stets dieselbe gewünschte Druckanstiegsge­ schwindigkeit ergibt.

In den Zeichnungen ist die Erfindung beispielsweise und schema­ tisch dargestellt. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 2 einen Schnitt durch eines der in Fig. 1 dargestellten Ventile und

Fig. 3 ein Druck/Zeitdiagramm mit Darstellung eines typi­ schen Druckverlaufes während einer Injektion.

Fig. 1 zeigt in zeichnerisch stark schematisiertem Überblick eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, bei der eine Kanüle 1 stark vergrößert im Schnitt dargestellt ist. Diese ist beispielsweise als Glasrohr ausgebildet, dessen als Stichspitze ausgebildeter End­ bereich auf einen Durchmesser von beispielsweise 1 µ ausgezogen ist mit einem inneren Rohrquerschnitt von beispielsweise 0,5 µ. Es ist eine Zelle 2 dargestellt, in die die Kanüle 1 mit ihrer Spitze ein­ gestochen ist. Die Zelle befindet sich auf einem Objektträger 3. Zu Einzelheiten des Aufbaus kann beispielsweise auf die EP 0 332 864 B1 verwiesen werden.

Die Kanüle 1 ist in einem Ring 4 gehalten, der an einem Arm 5 ei­ nes nicht dargestellten Mikromanipulators befestigt ist. Damit kann die Kanüle 1 unter Beobachtung durch ein Mikroskop bewegt wer­ den.

Am hinteren offenen Ende der Kanüle 1 ist abgedichtet ein Schlauch 6 angeschlossen, der in seinem kanülenseitigen Endbe­ reich in stark vergrößertem Schnitt, an seinem anderen Ende, wie alle übrigen Leitungen der Vorrichtung nur als Strich dargestellt ist.

Der Schlauch 6 ist über eine zu Auswechselzwecken vorgesehene trennbare Kupplung 7 bis zu einem Verteiler 8 im Gehäuse 9 eines Gasdruckerzeugers 10 geführt.

Eine geringe Menge einer zu injizierenden Flüssigkeit 11, die sich in der Kanüle 1 befindet, wird mit von dem Gasdruckerzeuger 10 im Schlauch 6 erzeugtem Gasdruck an ihrer Trennfläche 12 beauf­ schlagt und bei geeigneter Höhe des Druckes zum Austritt in die angestochene Zelle vorgeschoben. Die austretende Flüssigkeits­ menge ergibt sich aus der Viskosität der Flüssigkeit, den Abmes­ sungen der Kanüle 1, dem eingestellten Injektionsdruck und der Zeit, über die dieser anliegt.

Im Gasdruckerzeuger 10 ist an den Verteiler 8 ein Drucksensor 13 angeschlossen sowie ein Einlaßventil 14 und ein Auslaßventil 15. Das Auslaßventil 15 führt über eine Auslaßleitung 16b in die freie Atmosphäre. Das Einlaßventil 14 schließt über eine Einlaßleitung 17b an einen Vorratsbehälter 18 an.

Der Vorratsbehälter 18 wird über eine Leitung 19 von einer Pumpe 20 mit Gas, beispielsweise Luft, auf einem Druck von beispiels­ weise 7 bar gehalten. Ein Sensor 21 überwacht den Druck im Vor­ ratsbehälter 18 und steuert entsprechend über eine beispielsweise elektronische Regeleinrichtung 22 die Pumpe 20. Über die darge­ stellten gestrichelten Steuerleitungen 23 und 24 sind zu diesem Zweck der Sensor 21 und die Pumpe 20 an die Regeleinrichtung 22 angeschlossen.

Der an den Schlauch 6 angeschlossene Drucksensor 13, das Einlaß­ ventil 14 und das Auslaßventil 15 sind über Steuerleitungen 25, 26 und 27 (gestrichelt) an eine Steuereinrichtung 28 angeschlossen, die beispielsweise als Computersteuerung ausgebildet ist und die über weitere Steuerleitungen 29, 30 und 31 (gestrichelt) an zwei Dreh­ knopfeinsteller 32 und 33 sowie eine Druckknopftastatur (in der zeichnerischen Darstellung mit drei Druckknöpfen) 34 angeschlos­ sen ist.

Über die Drehknopfeinstellung 32 und 33 können beispielsweise Vorgabewerte für zwei unterschiedliche Drücke der Steuereinrich­ tung 28 vorgegeben werden. Über die Tastatur 34 können die vor­ eingestellten Drücke oder komplexe Steuerprogramme abgerufen werden. Wird einer der voreingestellten Soll-Drücke abgerufen, so vergleicht die Steuereinrichtung 28 den Soll-Druck mit dem von dem Drucksensor 13 gemessenen Ist-Druck im Schlauch 6. Ist der Ist-Druck zu hoch, so wird das Auslaßventil 15 geöffnet, bis der Soll-Druck erreicht wird. Ist der Ist-Druck zu niedrig, so wird das Einlaßventil 14 solange offengehalten, bis der Soll-Druck erreicht ist.

Das Volumen des Schlauches 6 zwischen der Trennfläche 12 in der Kanüle 1 und dem Gasdruckerzeuger, einschließlich der an den Verteiler 8 anschließenden Leitungsstücke zum Drucksensor 13 und zu den Ventilen 14 und 15, kann sehr klein gehalten werden und beispielsweise in der Größenordnung 1 ml liegen. Selbst bei Ver­ wendung kleiner Ventile 14 und 15 führt deren Öffnen zu extrem schnellen Druckänderungen im Schlauch 6, die das Einstellen eines gewünschten Druckes nur bei Verwendung von Hochgeschwindig­ keitsventilen ermöglichen würde. Außerdem könnten sich störende Druckstöße ergeben, die zu Schwingungen des Schlauches 16 füh­ ren, die die Arbeitsweise der Kanüle 1 beeinträchtigen.

Es sind daher Drosseln 35 und 36 in der Auslaßleitung 16 und der Einlaßleitung 17 vorgesehen, die den Luftstrom derart drosseln, daß sich niedrigere, von der Steuereinrichtung 28 und den Ventilen 14 und 15 beherrschbare Druckänderungsgeschwindigkeiten im Schlauch 6 ergeben. Außerdem werden dadurch Druckstöße ver­ mieden.

Ein größeres Totvolumen zwischen dem Einlaßventil 14 und der dazugehörigen Drossel 35 würde dazu führen, daß nach Öffnen des Einlaßventiles 14 zunächst nur das Totvolumen auf höheren Druck gebracht wird. Insbesondere aber würde nach Schließen des Einlaß­ ventiles 14 der noch bestehende höhere Druck im Totvolumen zu einem weiteren Anstieg des Druckes im Schlauch 6 führen.

Um dies zu vermeiden sind die Drosseln 35 und 36, wie in Fig. 1 dargestellt, mit kürzester Leitungsstrecke zwischen dem jeweiligen Ventil und der jeweiligen Drossel angeordnet.

In besonders bevorzugter Ausführungsform sind die Drosseln in die Ventilsitze integriert, wie Fig. 2 am Beispiel des Einlaßventiles 14 zeigt.

In einem Ventilgehäuse 37 ist eine Ventilstange 38 gelagert, die von einer nicht dargestellten Betätigungseinrichtung, beispielsweise ei­ nem Elektromagneten, angetrieben wird. Die Ventilstange 38 trägt im Inneren des Gehäuses 37 eine Ventilplatte 39 mit Dichtung 40, der gegenüber einem Ventilsitz 41 abdichtet. An eine Öffnung 42 des Gehäuses 37 ist das Zuleitungsstück 17a der Einlaßleitung 17 angeschlossen. Vom Ventilsitz 41 geht das zum Verteiler 8 füh­ rende Ableitungsstück 17b der Einlaßleitung 17 ab. Innerhalb des Ventilsitzes 41 in der zu der ableitenden Leitung 17b führenden Öffnung des Ventilsitzes 41 ist ein Drosseleinsatz 43 vorgesehen, der eine sehr enge Bohrung mit der gewünschten Drosselwirkung aufweist. Das Totvolumen zwischen dem Drosseleinsatz 43 und dem Ventil 40, 41 wird auf diese Weise auf null gebracht. Der Drosseleinsatz 43 kann gegen solche mit anderem Kaliber aus­ tauschbar oder integral mit dem Ventilsitz 41 ausgebildet sein.

Das Auslaßventil 15 mit der zugehörigen Drossel 36 kann entspre­ chend Fig. 2 ausgebildet sein.

Fig. 3 zeigt in einem Diagramm den im Schlauch 6 herrschenden Druck P, aufgetragen gegenüber der Zeit t. Es ist ein typischer Druckverlauf für einen Injektionsvorgang dargestellt.

Zunächst herrscht im Schlauch 6 ein Ruhedruck P_r, der beispiels­ weise 100 mbar beträgt. Der Ruhedruck P_r kann beispielsweise über den Drehknopfeinsteller 32 vorgegeben sein und wird von der Steuereinrichtung 28 konstant gehalten. Es wird zum Zeitpunkt t₁ ein Injektionsvorgang ausgelöst, und zwar beispielsweise durch Betätigen eines der Druckknöpfe auf der Tastatur 34 oder eines nicht dargestellten Fußschalters.

Die Steuereinrichtung 28 erhält nun einen Vorgabewert, der bei­ spielsweise mit dem Drehknopfeinsteller 33 vorgewählt ist und der beispielsweise 1 bar beträgt. Dies ist der gewünschte Injektions­ druck P_i. Die Steuereinrichtung 28 stellt fest, daß der noch auf P_r befindliche Druck im Schlauch 6 zu niedrig ist und öffnet das Ein­ laßventil 14. Es strömt aus dem Vorratsbehälter 18, der bei­ spielsweise auf einem Druck von 7 bar gehalten ist, Druckluft durch die Drossel 35. Durch deren Drosselwirkung ergibt sich eine Druckanstiegsgeschwindigkeit, die, wie in Fig. 3 dargestellt, bei­ spielsweise bei 5 bar/sec. liegt. Bei t₂ ist der vorgewählte Druck P_i erreicht. Die Steuereinrichtung 28 stellt Übereinstimmung von Soll- Druck und Ist-Druck fest und schließt das Einlaßventil 14. Bis zur Zeit t₃ wird der Injektionsdruck P_i konstant gehalten. Die Zeitdiffe­ renz t₃-t₂ bestimmt die Injektionszeit.

Das Injektionsende bei t₃ kann von Hand eingegeben werden oder automatisch eingestellt werden. Dann wird das Auslaßventil 15 ge­ öffnet und der Druck im Schlauch 6 über die Drossel 36 abgebla­ sen, bis wieder P_r erreicht ist, also bei t₄. Nun wird das Auslaß­ ventil 15 wieder geschlossen.

Je nach verwendeter Flüssigkeit, also je nach deren Viskosität so­ wie je nach den Abmessungen der Kanüle 1 können die erforderli­ chen Drücke für P_r und P_i unterschiedlich sein. Wie erwähnt, kann dies an den Drehknopfeinstellern 32 und 33 durch Verstellung der Sollwertvorgaben eingestellt werden. Es können auch noch weitere Drücke vorgegeben werden, beispielsweise ein dritter, wesentlich höherer Druck, der zur Reinigung der Kanüle 1, also zum Ausbla­ sen von Flüssigkeit unter hohem Druck, verwendet wird. Dafür kann allerdings auch der Druck des Vorratsbehälters 18 verwendet werden.

Es können auch völlig andere Druckprofile, als in Fig. 3 darge­ stellt, gefahren werden. Außerdem ergeben sich andere als die in Fig. 3 dargestellte Kurvendarstellung beispielsweise dann, wenn der Druck von P_r auf P_i wesentlich langsamer erhöht werden soll, als die Drossel 35 dies vorgibt. Dann kann das Einlaßventil 14 mehrfach zwischenzeitlich geschlossen werden, so daß sich ein stu­ fenförmiger Anstieg ergibt.

Ist der Schlauch undicht, beispielsweise an der Kupplung 7, so hält sich der Druck P_i im Schlauch 6 nicht von allein konstant, wenn die Ventile 14 und 15 geschlossen sind. Es ergibt sich ein leichter Druckabfall, der durch zwischenzeitliches Öffnen des Einlaßventiles 14 korrigiert werden kann. Ergeben sich, beispielsweise durch Temperaturerhöhung, ungewollte Druckerhö­ hungen im Schlauch 6, so können diese durch zwischenzeitliches kurzes Öffnen des Auslaßventiles 15 korrigiert werden.

Es kann unter Umständen auch für spezielle Anwendungen erfor­ derlich sein, den Schlauch 6 mit Vakuum zu beaufschlagen. Dazu kann über ein gesondertes, nicht dargestelltes Ventil, ähnlich den Ventilen 14 und 15, eine Vakuumquelle angeschlossen werden, bei­ spielsweise an den Verteiler 8. Mit dieser Vakuumquelle durch Schalten des das Vakuum steuernden Ventiles und abwechselndes Schalten des mit der Atmosphäre verbindenden Ventiles 15 kann Vakuum gewünschten Unterdruckes im Schlauch 6 eingestellt wer­ den, beispielsweise an Stelle des Ruhedruckes P_r oder auch zu an­ deren erforderlichen Zwecken. Die Höhe des Vakuumunterdruckes kann in der geschilderten Weise mittels des Drucksensors 13 und der Steuereinrichtung 28 geregelt werden unter Voreinstellung über einen Drehknopfeinsteller, ähnlich den Drehknopfeinstellern 32 und 33.

Claims (7)

1. Vorrichtung zur Injektion von Flüssigkeiten in biologische Zellen (2) mit einer von einem Manipulator (5) gehaltenen, die zu injizierende Flüssigkeit (11) aufnehmenden Kanüle (1), deren rückwärtiges Ende über einen flexiblen, gasge­ füllten Schlauch (6) an einen Gasdruckerzeuger (10) ange­ schlossen ist, in welchem der Schlauch (6) über wahlweise betätigbare Schaltventile (14, 15) an auf unterschiedlichem Druck befindliche Druckquellen (18, 16b) anschließbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Gasdruckerzeuger (10) ein Einlaßventil (14) zur Verbindung des Schlauches (6) mit einer wenigstens den maximal im Schlauch benötigten Druck (P_i) vorhaltenden Vordruckquelle (18), ein den Schlauch (6) mit der Atmosphäre (16b) verbindendes Auslaßventil (15) sowie einen mit dem Schlauch (6) verbundenen Drucksensor (13) aufweist, wobei der Drucksensor (13) sowie die Ventile (14, 15) an eine Steuereinrichtung (28) angeschlossen sind, welche durch Vergleich des vom Drucksensor (13) ermittel­ ten Ist-Druckes mit Soll-Druckvorgaben Druckabweichungen im Schlauch ermittelt und entsprechend die Ventile zur Druckanpassung steuert.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in den von den Ventilen (14, 15) beherrschten Leitungen (17, 16) Drosseln (35, 36) vorgesehen sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Widerstände der Drosseln (35, 36) zur Einhaltung gewünschter maximaler Druckänderungsgeschwindigkeiten im Schlauch (6) gewählt sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Drosseln (35, 36) in geringst möglichem Leitungsab­ stand zu den Ventilen (14, 15) angeordnet sind.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Drosseln (Drosseleinsatz 43) in die Ventilsitze (41) integriert sind.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vordruckquelle einen von einer Druckpumpe (20) gespeisten Vorratsbehälter (18) aufweist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine den Druck im Vorratsbehälter (18) durch Steuerung der Pumpe (20) konstant haltende Regeleinrichtung (22) vor­ gesehen ist.