DE4333674A1 - Nukleotidhaltiges Sorbens für die Affinitätschromatographie - Google Patents

Nukleotidhaltiges Sorbens für die Affinitätschromatographie

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DE4333674A1
DE4333674A1 DE4333674A DE4333674A DE4333674A1 DE 4333674 A1 DE4333674 A1 DE 4333674A1 DE 4333674 A DE4333674 A DE 4333674A DE 4333674 A DE4333674 A DE 4333674A DE 4333674 A1 DE4333674 A1 DE 4333674A1
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Description

Die Erfindung betrifft Sorbenzien für die Affinitätschromatographie, die Nucleotide als Affinitätsliganden enthalten, sowie phosphorsäurehaltige Zwischenverbindungen für ihre Herstellung und deren Verwendung.
Für biologische Wechselwirkungen, z. B. die Mechanismen der Zellerken­ nung, spielen Glycoproteine, die häufig Sialinsäure enthalten, eine wichtige Rolle. Deren Oligosaccharidbestandteile besitzen häufig komplexe Struk­ turen. Deswegen sind organisch-chemische in-vitro Synthesen solcher Oligosaccharide, beispielsweise wegen der Einführung und Abspaltung von Schutzgruppen, äußerst aufwendig. Ähnlich aufwendig ist normalerweise die Isolierung aus Naturstoffen. Deswegen werden bei in-vitro Synthesen organisch-chemische Syntheseschritte mit biochemischen Syntheseschritten kombiniert. Bei den biochemischen Syntheseschritten wird die Fähigkeit von Enzymen ausgenutzt, in spezifischer Weise bestimmte chemische Strukturen zu erzeugen, ohne daß Schutzgruppen eingeführt werden müssen. Für der­ artige Reaktionen werden verschiedene Enzyme aus der Gruppe der Glyko­ syltransferasen benötigt. Sialinsäurereste lassen sich beispielsweise durch Verwendung von Sialintransferasen an Mono- oder Oligosaccharide binden.
Die Isolierung der Glykosyltransferasen, z. B. Sialin-, Glucosyl-, Acetyl­ glucosamin-, Galactosyl-, Galactosamin-, Mannosyl- oder Fucosyltrans­ ferase, erfolgt am besten mit Hilfe der Affinitätschromatographie, wobei bevorzugt immobilisierte Nukleosiddiphosphate, Nukleoside, Mono- oder Oligonukleotide als Affinitätsligand dienen. Für die Sialintransferase wird Cytidindiphosphat (CDP) als Affinitätsligand bevorzugt.
Im Stand der Technik bekannte Sorbenzien für die Affinitätschromato­ graphie enthalten als Basisträger Polysaccharide, beispielsweise Agarose, an die CDP über einen Aminohexylrest als Spacer gebunden ist. Dieser Spacer ist für die Wechselwirkung zwischen Affinitätsligand und Enzym notwen­ dig. Wegen der Hydrophobizität des Spacers kommt es jedoch zu uner­ wünschten Wechselwirkungen, wodurch die Ausbeute an Enzym und seine Aktivität verringert werden.
Es besteht also die Aufgabe, verbesserte Affi­ nitätsträger für die Reinigung von Glykosyltransferasen bereitzustellen.
Aus der unveröffentlichten Anmeldung DE 43 10 964 sind oxiranhaltige aktivierte Trägermaterialien bekannt, bei denen Monomere der Formel I auf einen hydroxylgruppenhaltigen Basisträger aufgepfropft sind,
worin
R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl
und
n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
bedeuten. Es wurde gefunden, daß sich aus diesen aktivierten Trägermate­ rialien durch Kombination von an sich bekannten Einzelschritten Trenn­ materialien für die Affinitätschromatographie herstellen lassen. Die resultierenden Trennmaterialien weisen verbesserte Eigenschaften auf.
Gegenstand der Erfindung sind Trennmaterialien für die Affinitätschromato­ graphie auf der Grundlage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere kovalent gebunden sind, dadurch gekenn­ zeichnet, daß
  • a) der Basisträger aliphatische Hydroxylgruppen enthält,
  • b) die kovalentgebundenen Polymeren über eine endständige Monomer­ einheit an den Basisträger gebunden sind,
  • c) die linearen Polymeren Monomereinheiten der Formel II enthalten, worin
    R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
    R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl,
    n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
    und
    einer der Reste X OH und der andere Rest X einen Nukleosiddiphosphatrest, einen Mono- oder Oligonukleotidrest oder einen Nukleosidrest
    bedeuten.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung dieser erfindungsgemäßen Trennmaterialien für die Reinigung von Glykosyltransferasen.
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur Herstellung eines erfindungs­ gemäßen Sorbens, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
  • a) Pfropfpolymerisation von Monomeren der Formel I auf einen hydroxylgruppenhaltigen Basisträger unter Beteiligung von Cer-(IV), worin
    R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
    R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl
    und
    n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
    bedeuten.
  • b) Umsetzung des epoxidgruppenhaltigen Trägers aus Verfahrensschritt a) mit Phosphorsäure oder einem Alkalisalz der Phosphorsäure;
  • c) Überführung des Phosphorsäurederivates aus Verfahrensschritt b) in ein alkyliertes Ammoniumsalz durch Zugabe eines Überschusses eines tertiären Alkylamins oder von Pyridin;
  • d) Umsetzung des alkylierten Ammoniumsalzes aus Verfahrensschritt c) mit einem Nucleotid oder Oligonucleotid unter wasserabspaltenden Bedingungen.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Phosphorsäureesterderivate eines gepfropften Polymeren auf der Grundlage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere kovalent gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) der Basisträger aliphatische Hydroxylgruppen enthält,
  • b) die kovalentgebundenen Polymeren über eine endständige Monomer­ einheit an den Basisträger gebunden sind,
  • c) die linearen Polymeren Monomereinheiten der Formel III enthalten, worin
    R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
    R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl,
    n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
    und
    einer der Reste Y OH und der andere Rest Y PO₄H₂
    bedeuten.
Gegenstand der Erfindung ist schließlich die Verwendung eines erfindungs­ gemäßen Phosphorsäureesterderivates eines gepfropften Polymeren für die Herstellung eines erfindungsgemäßen Sorbens für die Affinitätschromato­ graphie und als Kationenaustauscher für die Flüssigkeitschromatographie.
In dem ersten Verfahrensschritt entsteht durch Reaktion von Phosphorsäure oder deren Salzen mit Epoxidgruppen der in DE 43 10 964 beschriebenen aktivierten Trägermaterialien Phosphorsäuremonoesterderivate dieser Trägermaterialien. Entsprechend dem Gehalt an Oxiranresten der aktivierten Trägermaterialien und durch Wahl der Reaktionsbedingungen (Menge an Phosphorsäure/Phosphat; Reaktionsdauer und -temperatur) läßt sich der Substitutionsgrad des Phosphorsäuremonoesterderivates des Trägermaterials einstellen. Eventuell vorhandene Überschüsse an Oxirangruppen werden nach üblichen Methoden, z. B. durch Reaktion mit Mercaptoglycerin oder durch Behandlung mit verdünnter Schwefelsäure entfernt.
Die derartig hergestellten Phosphorsäuremonoesterderivate des Träger­ materials können auch als Kationenaustauscher verwendet werden.
In der Biochemie werden unter dem Begriff Nukleoside N-Glycoside der Pyrimidinbasen Thymin, Uracil und Cytosin und der Purinbasen Guanin und Adenin mit Ribose oder 2-Desoxyribose verstanden. Nukleotide sind die Phosphorsäureester dieser Nukleoside. Nukleosiddiphosphate enthalten ein weiteren Phosphorsäurerest, der durch eine Pyrophosphatbindung an den ersten Phosphorsäurerest gebunden ist. Oligonukleotide enthalten mehrere Nukleotide, die gleich oder verschieden sein können, und die durch Phos­ phorsäurediesterbindungen verknüpft sind. Erfindungsgemäß werden unter den Begriffen Nukleosid, Nukleotid und Oligonukleotid außerdem Verbin­ dungen verstanden, bei denen statt der genannten Basen andere Purin- oder Pyrimidinbasen, wie z. B. Hypoxanthin, 5-Methylcytosin oder N-2-Methyl­ guanosin enthalten sind, oder die statt der Ribose oder 2-Desoxyribose einen anderen Zuckerrest enthalten. Derartige analoge Verbindungen sind dem Fachmann bekannt.
Esterbindungen entstehen aus einer Säure und einem Alkohol durch Wasser­ abspaltung; entsprechend entstehen Pyrophosphatbindungen aus zwei Phos­ phorsäureverbindungen. Zu den gebräuchlichen wasserabspaltenden Mitteln gehören beispielsweise die Carbodiimide, beispielsweise Dicyclohexyl­ carbodiimid. Bevorzugterweise wird 1,1′-Carbonyldiimidazol für diesen Zweck benutzt. Bei anderen Verfahren der Wasserabspaltung werden aktivierte Zwischenstufen, wie z. B. Säurehalogenide oder -anhydride, eingesetzt. Die Einzelheiten derartiger Verfahren und geeignete Verfahrens­ varianten sind dem Fachmann beispielsweise aus gängigen Handbüchern bekannt. Für die Bildung von Pyrophosphatverbindungen zwischen dem Phosphorsäureesterderivat, das Monomereinheiten nach Formel III enthält, und den Nukleotiden wird die Methode nach Michelson (1964) Biochim. Biophys. Acta 91, 1 ff, bevorzugt. Bei diesem Verfahren werden die Phos­ phorsäureester mit tertiären Aminen oder mit quaternären Ammonium­ hydroxid in die entsprechenden primären Salze umgesetzt. Bevorzugt ist dabei die Verwendung von Tri-n-butylamin oder Methyl-tri-n-octyl­ ammoniumhydroxid.
Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand näher erläutern; diese Beispiele stellen keine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes dar.
Beispiele Beispiel 1: Herstellung eines oxiran-aktivierten Trägers ausgehend von Fractogel®-TSK HW 65 (S)
Zu einer Suspension aus 50 ml sedimentiertem Fractogel®-TSK HW 65 (S) und 25 ml Wasser werden mit 2 g Ammoniumcer(IV)nitrat (gelöst in 25 ml 2 M HNO₃) bei RT unter starkem Rühren vermischt. Nach 1 Minute erfolgt die Zugabe einer Lösung von 3 g (2,3-Epoxypropyl)-methacrylat in 30 ml Dioxan. Es wird 3 Stunden weitergerührt. Anschließend wird die Reaktions­ suspension erst mit destilliertem Wasser und dann mit 0.05 M EDTA- Lösung gewaschen.
Beispiel 2: Synthese eines phosphatgruppenhaltigen Trägermaterials
5 g getrocknete Gel hergestellt nach Beispiel 1 werden in 20 ml Wasser suspendiert und mit 8 ml Phosphorsäure (85%) versetzt. Die Suspension wird unter Schütteln 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur weiter geschüttelt. Das Reaktionsprodukt wird mit einer Glasfritte (G3) abfiltriert und mit Wasser neutral gewaschen.
Anschließend wird das Reaktionsprodukt mit 1 ml Mercaptoglycerin in 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 unter Schütteln behandelt (3 Tage, Raumtemperatur), damit nicht umgesetzte Oxirangruppen entfernt werden.
Das phosphatgruppenhaltige Trägermaterial wird nochmals gründlich mit Wasser gewaschen. Es enthält 30 µmol Phosphat/g Trägermaterial.
Beispiel 3: Synthese eines phosphatgruppenhaltigen Trägermaterials mit höherer Phosphatbelegung
5 g getrocknete Gel hergestellt nach Beispiel 1 werden wie in Beispiel 2 beschrieben umgesetzt, jedoch erfolgt die Reaktion mit der Phosphorsäure 15 Stunden. Das resultierende phosphatgruppenhaltige Trägermaterial enthält 40 µmol Phosphat/g Trägermaterial.
Beispiel 4: Synthese eines mit Cytidin-5′-diphosphat (CDP) derivatisierten Trägermaterials Stufe 1: Tri-n-butylammoniumsalz des derivatisierten Trägermaterials
Das feuchte Reaktionsprodukt aus Beispiel 2 wird in 30 ml Wasser suspen­ diert, mit 0,5 ml Tri-n-butylamin versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wird über eine Glasfritte (G2) filtriert und dreimal mit 50 ml Aceton gewaschen. Das Filtrat wird in einem 250 ml Rundkolben bei 50°C über Nacht unter Vakuum (5-7 Torr) getrocknet.
Stufe 2: Methyl-tri-octylammoniumsalz des CMP
4,2 g Methyl-tri-octylammoniumchlorid werden in 100 ml Methanol gelöst und über eine Säule (DOWEX® 1X2, 200-400 mesh; OH-Form) in die quaternäre Base überführt. Mit dieser Lösung wird eine Suspension aus 3,23 g CMP in 250 ml Methanol versetzt. Das entstandene Methyl-tri-octyl­ ammoniumsalz des CMP wird eingeengt.
Stufe 3: Diphenylpyrophosphat-aktiviertes CMP
1 mMol des Methyl-tri-octylammoniumsalzes des CMP aus Stufe 2 werden in einer Mischung aus 7 ml Dioxan und 3 ml N,N-Dimethylformamid gelöst Unter Feuchtigkeitsausschluß werden zu der Lösung 0,3 ml Diphenylphos­ phorsäurechlorid und 0,45 ml Tri-n-butylamin zugegeben und 3 Stunden geschüttelt. Anschließend wird das Lösungsmittel in einem Rotations­ verdampfer unter Vakuum entfernt und der Rückstand mit 30 ml Diethyl­ ether behandelt. Die Suspension wird 1 Stunde auf 0°C gekühlt und die Etherphase abdekantiert und verworfen. Der Rückstand wird im Vakuum getrocknet und nochmals in 2 ml Dioxan gelöst und erneut im Vakuum getrocknet
Stufe 4: Pyrophosphatderivat von CMP und derivatisiertem Träger­ material
Das derivatisierte Trägermaterial aus Stufe 1 wird in 30 ml Pyridin suspen­ diert und mit einer Lösung von 0,5 mMol des Diphenylpyrophosphat-akti­ vierten CMP aus Stufe 3 in 10 ml Pyridin unter Feuchtigkeitsausschluß versetzt und bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Das Reaktions­ produkt wird mit einer Glasfritte (G2) abfiltriert und mit 250 ml Methanol, mit 100 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und mit 1000 ml Wasser gewaschen.
Das resultierende Material enthält 25 µMol Cytidin 1 g Feuchtgewicht (gemessen durch UV-Absorption bei 267 mn nach Hydrolyse (1 N HCl; 2 Stunden bei 110°C) und anschließender Neutralisation mit 1 N NaOH).
Beispiel 5: Synthese eines mit Guanosin-5′-diphosphat (GDP) derivatisierten Trägermaterials Stufe 1: Tri-n-butylammoniumsalz des derivatisierten Trägermaterials
Die Durchführung dieser Stufe ist identisch mit der Stufe 1 aus Beispiel 4.
Stufe 2: Tri-n-butylammoniumsalz des GMP
3 g GMP (freie Säure) und 1,1 g Tri-n-butylamin werden in 250 ml Metha­ nol erwärmt, bis die Lösung klar ist; anschließend wird die Lösung zur Trockene eingeengt.
Stufe 3: Diphenylpyrophosphat-aktiviertes GMP
1 mMol des Tri-n-butylammoniumsalz des GMP aus Stufe 2 werden in einer Mischung aus 7 ml Dioxan und 3 ml N,N-Dimethylformamid gelöst. Unter Feuchtigkeitsausschluß werden zu der Lösung 0,3 ml Diphenyl­ phosphorsäurechlorid und 0,45 ml Tri-n-butylamin zugegeben und 3 Stun­ den geschüttelt. Anschließend wird das Lösungsmittel in einem Rotations­ verdampfer unter Vakuum entfernt und der Rückstand mit 30 ml Diethyl­ ether behandelt. Die Suspension wird 1 Stunde auf 0°C gekühlt und die Etherphase abdekantiert und verworfen. Der Rückstand wird im Vakuum getrocknet und nochmals in 2 ml Dioxan gelöst und erneut im Vakuum getrocknet.
Stufe 4: Pyrophosphatderivat von GMP und derivatisiertem Träger­ material
Das derivatisierte Trägermaterial aus Stufe 1 wird in 30 ml Pyridin suspen­ diert und mit einer Lösung von 0,5 mMol des Diphenylpyrophosphat-akti­ vierten GMP aus Stufe 3 in 10 ml Pyridin unter Feuchtigkeitsausschluß versetzt und bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Das Reaktions­ produkt wird mit einer Glasfritte (G2) abfiltriert und mit 250 ml Methanol, mit 100 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und mit 1000 ml Wasser gewaschen.
Das resultierende Material enthält 30 µMol Guanosin 1 g Feuchtgewicht (gemessen durch UV-Absorption bei 270 nm nach Hydrolyse (1 N HCl; 2 Stunden bei 110°C) und anschließender Neutralisation mit 1 N NaOH).
Anwendungsbeispiel A: Trennung von Sialyltransferase aus Rinder­ colostrum
Eine Superformance® Säule (I.D. 1,6 cm) wird mit 10 g CDP-aktiviertem Trägermaterial nach Beispiel 4 gefüllt und mit 10 mM MES-Puffer pH 6.8, der 25% Glycerin enthält, equilibriert. Rindercolostrum vom 1. Tag nach der Geburt wird durch Zentrifugation entfettet und gegen denselben Puffer ausgiebig dialysiert. Ca. 1 l dialysiertes Colostrum wird mit einem Fluß von 1 ml/min aufgetragen. Elution erfolgt mit einem Stufengradienten von 1,0 M NaCl.
Die Aktivität der Sialyltransferase wird durch Übertragung von CMP-[14C]- Sialinsäure auf Lactose bestimmt. Dazu werden 50 µl Enzymprobe mit 30 µl MES-Puffer (Endkonzentration: 50 mM MES, 10 mM MnCl₂, pH 6,8), 10 µl 0,8 M Lactose und 10 µ CMP-[14C]-Sialinsäure (0,05 µCi) für 15 min bei 37°C inkubiert. Der Reaktionsansatz wird mit 1 ml eiskaltem 5 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 7,0 abgestoppt und über eine 1-ml-Säule mit Dowex 1X8-200 chromatographiert. CMP-[14C]-Sialinsäure wird unter diesen Bedingungen auf der Säule retardiert, während das Produkt [¹⁴C]-Sial-Lactose in der nicht-bindenden Fraktion isoliert werden kann.
1 Unit Sialyltransferase-Aktivität wird definiert als Übertragung von 1 µmol [¹⁴C]-Sialinsäure/min. Es werden 0,2 U Sialyltransferase pro g Träger­ material gebunden. Diese Bindungskapazität liegt um 50% über der eines Vergleichsmaterials (CDP gekoppelt an BrCN-Sepharose). Die gebundene Aktivität konnte mit einer Ausbeute von 75% mit 1,0 M NaCl eluiert werden, während das Vergleichsmaterial nur eine Wiederfindungsrate von maximal 8% aufwies (Elution mit 2,0 M NaCl).
Anwendungsbeispiel B: Trennung von 1-3/4-Fucosyltransferase aus Humanmilch
1000 ml Humanmilch werden durch Zentrifugation entfettet und ausgiebig bei 4°C gegen 10 mM Na-Cacodylat, 10 mM MgCl₂, 20% Glycerin pH 6,8 dialysiert. Die Vorreinigung der Transferase erfolgt nach einer beschrie­ benen Methode (Eppenberger-Castori et al., Glycoconjugate J., 6 p 101-114, 1990) durch Chromatographie an Fractogel® 503 (Fa. E. Merck).
Die Bestimmung-der Fucosyltransferase-Aktivität wird analog zum Beispiel 6 mit GDP-[¹⁴C]-Fucose als Substrat durchgeführt.
Aktive Fraktionen aus der SO₃ Chromatographie werden durch Dialyse entsalzt und affinitätschromatographisch an GDP-Trägermaterial nach Beispiel 5 gereinigt. Dazu wird eine Superformance® Säule (I.D. 1,0 cm) mit 2 ml Trägermaterial gefüllt und mit 10 mM Na-Cacodylat, 10 mM MgCl₂, 20% Glycerin pH 6,8 equilibriert (0,5 ml/min). Nach Probenauftrag wird ausgiebig mit Equilibrierungspuffer gewaschen und mit einem NaCl- Gradienten (0-1,5 M NaCl, 20 Säulenvolumina, 0,2 ml/min) eluiert.
Die Ausbeute beträgt ca. 83% bei einer ungefähr 450fachen Anreicherung. Die Fucosyltransferase ist als dominante Bande in der SDS-Gelelektro­ phorese zu sehen (MW 47 kD).

Claims (6)

1. Trennmaterialien für die Affinitätschromatographie auf der Grundlage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere kovalent gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) der Basisträger aliphatische Hydroxylgruppen enthält,
  • b) die kovalentgebundenen Polymeren über eine endständige Monomereinheit an den Basisträger gebunden sind,
  • c) die linearen Polymeren Monomereinheiten der Formel II enthalten, worin
    R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
    R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl,
    n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
    und
    einer der Reste X OH und der andere Rest X einen Nukleosid­ diphosphatrest, einen Mono- oder Oligonukleotidrest oder einen Nukleosidrest
    bedeuten.
2. Verwendung von Trennmaterialien mit den Merkmalen des Anspruches 1 für die Reinigung von Glykosyltransferasen.
3. Verfahren zur Herstellung eines Sorbens mit den Merkmalen des Anspruches 1, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:
  • a) Pfropfpolymerisation von Monomeren der Formel I auf einen hydroxylgruppenhaltigen Basisträger unter Beteiligung von Cer-(IV)-Ionen, worin
    R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
    R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl
    und
    n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
    bedeuten.
  • b) Umsetzung des epoxidgruppenhaltigen Trägers aus Verfahrens­ schritt a) mit Phosphorsäure oder einem Alkalisalz der Phosphor­ säure;
  • c) Überführung des Phosphorsäurederivates aus Verfahrensschritt b) in ein alkyliertes Ammoniumsalz durch Zugabe eines Überschusses eines tertiären Alkylamins oder von Pyridin;
  • d) Umsetzung des alkylierten Ammoniumsalzes aus Verfahrens­ schritt c) mit einem Nukleotid oder Oligonukleotid unter wasser­ abspaltenden Bedingungen.
4. Phosphorsäureesterderivat eines gepfropften Polymeren auf der Grund­ lage von hydroxylgruppenhaltigen Basisträgern, auf deren Oberflächen Polymere kovalent gebunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) der Basisträger aliphatische Hydroxylgruppen enthält,
  • b) die kovalentgebundenen Polymeren über eine endständige Monomereinheit an den Basisträger gebunden sind,
  • c) die linearen Polymeren Monomereinheiten der Formel III enthalten, worin
    R¹, R² und R³ unabhängig voneinander H oder CH₃,
    R⁴ H, C₁-C₅-Alkyl oder C₆-C₁₂-Aryl,
    n eine ganze Zahl zwischen 1 und 5
    und
    einer der Reste Y OH und der andere Rest Y PO₄H₂
    bedeuten.
5. Verwendung eines Phosphorsäureesterderivates nach Anspruch 4 für die Herstellung eines Sorbens nach Anspruch 1.
6. Verwendung eines Phosphorsäureesterderivates nach Anspruch 4 als Kationenaustauscher für die Flüssigkeitschromatographie.
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