DE4316376A1 - Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von wandlosen Suspensionszellen - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das in Patentanspruch 1 ange­ gebene Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von wandlosen Suspensions­ zellen in einem blasenbegasten Bioreaktor mit einer als Lamellenklärer ausgeführ­ ten Zellrückhalteeinheit. Die nachfolgenden Ansprüche nennen Ausgestaltungen des Verfahrens.

Mit der wachsenden Bedeutung biotechnologisch hergestellter Produkte aus Zellkulturen für medizinische und pharmazeutische Anwendungen steigt auch der Bedarf an geeigneten Verfahren zur kontinuierlichen Massenkultivier­ ung entsprechender Zellinien. Insbesondere die Kultivierung von Suspensionszel­ len (schwimmende Zellen) wird als schwierig angesehen, da diese verglichen mit adhärenten Zellen (haftende Zellen) im allgemeinen anfällig sind für mechanische Beanspruchungen.

Ein Verfahren ist dann geeignet, wenn es 1) dem vergleichsweise hohen Sauer­ stoffbedarf eukaryotischer Zellen bei gleichzeitig großer Empfindlichkeit dieser Zellen gegen mechanische Beanspruchung Rechnung trägt, 2) wenig anfällig für biologische und apparative Störungen ist und 3) den Umgang mit hohen Zell­ dichten gestattet. Der letzte Punkt bedingt, daß das Kultursystem über ein effizi­ entes Rückhaltesystem verfügt, welches die unter 1) und 2) gestellten Anforder­ ungen erfüllt. Nach dem gegenwärtigen Stand der Technik kommen dabei im wesentlichen Zentrifugen, Membranfilter (Hohlfasermodule oder Querstromfiltra­ tion) und auch Sedimenter zum Einsatz.

Wenngleich diese bekannten Verfahren zur Zellrückhaltung brauchbar sind und in der Praxis durchaus Verwendung finden, konnten einige apparate- und verfah­ rensspezifische Probleme bislang nicht zufriedenstellend bewältigt werden.

Zentrifugen können derzeit nicht kontinuierlich betrieben werden ohne einen er­ heblichen Mehraufwand an Technik und Investitionskosten, während der diskon­ tinuierliche Betrieb die Kontaminationsgefahr für das Kultursystem deutlich er­ höht. Je nach Empfindlichkeit der abzutrennenden Species besteht zudem die Möglichkeit der Zellschädigung sowie der Unterversorgung der aufkonzentrierten Zellen.

Bei der Zellrückhaltung mittels Membranen, z. B. in Hohlfasermodulen, führt der Einsatz von Pumpen zur Aufrechterhaltung der transmembranen Druckdifferenz zu Zellschädigungen. Darüberhinaus besitzen Membranen aufgrund von Verbloc­ kung nur begrenzte Standzeiten.

Von Hülscher et al. [Biotechnol. Bioeng., 39, 442-446 (1992)] wurde ein Ver­ fahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Hybridomazellen vorgestellt, dem ein Zellrückhaltesystem mit Sedimenter nach Bauart des Dortmund-Brunnens zu­ grunde liegt. Der Bioreaktor wurde dort als Airlift-Schlaufenreaktor ausgeführt.

Die den Reaktor verlassende Zellsuspension wird durch einen Intensivkühler auf ca. 20°C heruntergekühlt. Bei diesem Verfahren kann auf den Einsatz von Pum­ pen verzichtet werden, da durch den Temperaturunterschied zwischen Reaktor und Sedimenter ein Naturumlauf induziert wird, der auch die Funktion für den schonenden Rücktransport des Zellkonzentrats in den Reaktor übernimmt. Durch die Abkühlung im Sedimenter wird eine Schädigung der Zellen infolge Sauer­ stoffmangels verhindert. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, daß Zellfrag­ mente und tote Zellen das System mit dem Erntemedium als Klarlauf verlassen.

Da bei diesem Verfahren der Druckverlust in den Rohrleitungen allein durch den Naturumlauf überwunden wird, müssen die Transportwege zwischen Reaktor und Sedimenter möglichst kurz sein. Somit sind bei dieser Ausführung beide Ap­ parate unmittelbar nebeneinander anzuordnen. Daraus resultiert der Nachteil, daß bei höheren Durchsätzen mit entsprechend größerer Klärfläche die Sedimen­ terabmessungen und damit auch die Transportwege überproportional ansteigen. Daher eignet sich dieses Verfahren nicht zur Vergrößerung im industriellen Maß­ stab.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist nun die Bereitstellung eines kontinuierlichen Verfahrens zur Massenkultivierung von wandlosen Zellen, bei dem starke mechanische Beanspruchung der Zellen verhindert wird, hohe Zelldichten erreicht werden können und das aufgrund hoher Standzeiten und mit der Möglichkeit zum Scale-up für den Einsatz im industriellen Maßstab geeignet ist.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst wer­ den kann durch ein kontinuierliches Verfahren zur Kultivierung von wandlosen Suspensionszellen in einem blasenbegasten Bioreaktor, wobei man die am Reak­ torkopf austretende Zellsuspension mittels Naturumlauf in einen gekühlten La­ mellenklärer leitet, derart daß ein Teil dieses Volumenstroms darin in Zellkonzen­ trat und Erntemedium getrennt wird, während der überwiegende Teil als Trans­ portstrom das Zellkonzentrat dem Bioreaktor bodenseitig wieder zuführt.

Der Bioreaktor wird dabei als Blasensäule oder als Airlift-Schlaufenreaktor ausge­ führt. Der Lamellenklärer kann im Gegenstrom wie im Gleichstrom betrieben werden. Der Winkel zwischen den Lamellen und der Horizontalen beträgt 45 bis 65°, vorzugsweise 55°. Naturumlauf, Transportstrom und der zu klärende Strom werden je nach Betriebsweise des Lamellenklärers mittels Ventilsteuerung eingestellt.

Zur Vermeidung von Zellschädigungen im Bioreaktor werden dem Kulturmedium oberflächenaktive Polyether, vorzugsweise Polyethylenglykol oder ein Blockco­ polymer aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen. Der Vorteil gegenüber Serum oder Proteinen als Zusatz besteht in der deutlich geringeren Neigung zur Schaumbildung und in der einfacheren Aufbereitung des Erntemediums.

Zur Verbesserung der Sedimentation und des Zellaustrags gibt man suspendierte Feststoffpartikel in das System, welche den Bioreaktor und den Lamellenklärer im Kreislauf passieren. Die Feststoffpartikel bestehen vorzugsweise aus Poly­ acrylester.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. In Abb. 1 ist das Verfahren für den Gegenstrom dargestellt. Gegenstrom bezieht sich dabei auf die unterschiedliche Flußrichtung von zwischen den Lamellen aufsteigenden Klarlauf und den in Gegenrichtung von den Lamellen abrutschenden lebenden Zellen.

Der Bioreaktor a, hier als Airlift-Schlaufenreaktor mit Doppelmantel ausgeführt, wird über den Thermostaten b auf 37°C Betriebstemperatur gehalten. Die un­ terhalb des Flüssigkeitsspiegels aus dem Bioreaktor austretende Zellsuspension wird vor dem Eintritt in den Lamellenklärer c im Kühler d auf ca. 20°C abge­ kühlt. Die Abkühlung führt zu einer Dichtedifferenz zwischen der Zellsuspension im Biorektor und Lamellenklärer und damit zu einer Kurzschlußströmung durch den Lamellenklärer. Die statischen Mischer e im Eintritt des Klärers bewirken ein gleichmäßiges Strömungsprofil. Ein Teil des Kurzschlußstromes wird zwischen den Lamellen geklärt und über das Gefäß f mit freiem Überlauf abgezogen. Dieser Teilstrom entspricht genau dem Zulaufstrom des Mediums zum Reaktor. Die Geschwindigkeit des Teilstroms zwischen den Lamellen ist so gering, daß die Sedimentation der suspendierten Zellen auf den Lamellen gewährleistet ist. Der Winkel der Lamellen beträgt ca. 55° gegen die Horizontale. Dies führt zu einem Abgleiten der sedimentierten Zellen in den Kurzschlußstrom, der diese zu­ rück in den Reaktor transportiert.

In Abb. 2 ist das erfindungsgemäße Verfahren im Gleichstrombetrieb dar­ gestellt. Gleichstrom bezieht sich auf den gleichgerichteten Fluß von Klarlauf und sedimentierenden Zellen. Bei dieser Fahrweise wird der zu klärende Teil­ strom über einen zweiten Kühler d in den Lamellenklärer geführt und nach er­ folgter Abtrennung der Zellen durch Rohrleitungen, die über den Lamellen ange­ ordnet sind, in das Überlaufgefäß f geleitet. Die Aufteilung des Suspensionsstro­ mes in Transportstrom und Klärstrom erfolgt mittels geeigneter Ventilsteuerung am Reaktoraustritt. Der zu klärende Teilstrom wird auf eine geringere Tempera­ tur abgekühlt als der Transportstrom, derart daß eine abwärtsgerichtete Strö­ mung zwischen den Lamellen induziert wird. Diese Fahrweise kann auch zur pe­ riodischen Reinigung der Lamellen während des Gegenstrombetriebs eingesetzt werden, indem man die Betriebsweise kurzzeitig wechselt.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.

Beispiel

Verwendet wurde eine Maus × Maus-Hybridoma-Zellinie, die in einem Medium bestehend aus "Iscove′s Modifled Dulbeccos Medium" (IMDM) und "Ham′s F12" kultiviert wurde. Dem Medium wurden je 10 mg/l Insulin und Transferrin sowie 1 g/l eines Blockcopolymers aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Pluronic F68) zur Vermeidung von Zellschädigungen aufgrund von Blasenbega­ sung zugesetzt. Als Bioreaktor wurde ein aus Glas gefertigter Airlift-Schlaufenre­ aktor (Arbeitsvolumen: 5,4 l) eingesetzt, der zur Temperierung auf 37°C mit einem Doppelglasmantel versehen wurde. Bodenplatte und Begasereinrichtung (Lochplatte mit 7 Bohrungen á 0,2 mm in Dreiecksteilung) wurden aus rostfrei­ em Stahl gefertigt. Die Begasung erfolgte mit einem Gemisch aus 95% synthe­ tischer Luft und 5% CO₂ bei einer Gasleerrohrgeschwindigkeit von 0,1 cm/s. Bei höheren Zelldichten wurde Sauerstoff zudosiert. Über eine entsprechende CO₂-Dosierung wurde der pH-Wert von 7,4 eingestellt. Der Lamellenklärer wur­ de ebenfalls aus Glas gefertigt und bei einer Temperatur von ca. 20°C gekühlt im Gegenstrom (vgl. Abb. 1) betrieben. Er wurde mit 7 Lamellen ausgeführt, so daß sich eine Klärfläche von 450 cm² ergab. Der Winkel zwischen den Lamellen und der Horizontalen betrug 55°. Der Fermenter wurde durch Kopplung mit einem Spinnersystem steril beimpft, derart daß die Konzentration zu Beginn der Fermentation 5·10⁴ 1/ml betrug.

Das Kultursystem wurde über einen Zeitraum von 820 Stunden kontinuierlich betrieben, ohne daß biologische oder technische Störungen auftraten.

Bis zu einem Zeitpunkt von 65 Stunden wurde das Kultursystem diskonti­ nuierlich betrieben. Die Konzentration der lebenden Zellen betrug 6·10⁵ 1/ml. Dann wurde der kontinuierliche Betrieb aufgenommen, wobei die Perfusionsge­ schwindigkeit schrittweise von zunächst 0,11 l/h auf 0,17 l/h und nach 280 Stunden auf 0,22 l/h erhöht wurde. Nach 320 Stunden wurde eine stationäre Zellkonzentration von 3·10⁶ 1/ml erreicht. In einer anschließenden Versuchspha­ se erhöhte man die Perfusionsgeschwindigkeit weiter bis auf 0,9 l/h. Probenah­ men des Klarlaufs unmittelbar am Austritt des Lamellenklärers wurden zur Be­ stimmung des Rückhaltegrades von lebenden und toten Zellen ausgewertet.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die auf diese Weise ermittelten Rückhaltegrade zusammen mit weiteren Betriebsdaten des Lamellenklärers im Vergleich zum Dortmund-Brunnen.

Tabelle

Betriebsdaten von Lamellenklärer und Dortmund-Brunnen

Wie aus der Tabelle hervorgeht, konnte mit dem Lamellenklärer im Vergleich zum Dortmund-Brunnen bei einem deutlich geringeren Volumen eine Verringe­ rung der hydrodynamischen Verweilzeit um den Faktor 3 und eine Erhöhung der Perfusionsgeschwindigkeit um den Faktor 2,6 erzielt werden. Dies hat den Vor­ teil, daß sich die Zeitspanne, in welcher die Stoffwechseltätigkeit der Zellen durch Abkühlung im Sedimenter reduziert ist, deutlich verkürzt. Die von den La­ mellen selbsttätig abrutschenden Zellen wurden bestimmungsgemäß vom Trans­ portstrom in den Reaktor zurück befördert. Aufgrund der größeren Perfusionsge­ schwindigkeit werden tote Zellen besser ausgetragen. Besonders hervorzuheben ist aber die Tatsache, daß dieses System die Möglichkeit einer Maßstabsver­ größerung bietet. Dabei ist das Verhältnis von zu installierendem Sedimenter- zu Reaktorvolumen deutlich kleiner als beim Dortmund-Brunnen.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß das erfindungsgemäße Verfah­ ren die kontinuierliche Kultivierung wandloser Zellen in serum- und proteinfreiem Medium ermöglicht. Die erfindungsgemäße Verfahrensführung ist in besonderem Maße zellschonend. Da kein Umpumpen der Zellsuspension durch den Sedimen­ ter notwendig ist, wird die mechanische Zellschädigung im Gesamtsystem mini­ miert. Dieses Verfahren eignet sich auch für die Kultivierung von auf Trägern im­ mobilisierten Zellen. Dabei ist sogar eine Leistungssteigerung des Systems zu er­ warten, da die Sinkgeschwindigkeit der Träger um ein Vielfaches höher ist als die von suspendierten Zellen.

Claims (8)

1. Kontinuierliches Verfahren zur Kultivierung von wandlosen Suspensi­ onszellen in einem blasenbegasten Bioreaktor, dadurch gekennzeichnet, daß man die am Reaktorkopf austretende Zellsuspension mittels Naturumlauf in einen gekühlten Lamellenklärer leitet, derart, daß ein Teil dieses Volumenstroms darin in Zellkonzentrat und Erntemedium getrennt wird, während der überwie­ gende Teil als Transportstrom das Zellkonzentrat dem Bioreaktor bodenseitig wieder zuführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bioreak­ tor als Blasensäule oder als Airlift-Schlaufenreaktor ausgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Lamellenklärer im Gleich- oder Gegenstrom betrieben wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel zwischen den Lamellen und der Horizontalen 45° bis 65° beträgt, vorzugsweise 55°.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Naturum­ lauf, Klärstrom und Transportstrom mittels Ventilsteuerung regulierbar sind.

6. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man dem Kulturmedium zur Vermeidung von Zellschädigung ober­ flächenaktive Polyether, vorzugsweise Polyethylenglykol 6000 oder ein Blockco­ polymer aus Polyoxyethylen und Polyoxypropylen, zusetzt.

7. Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die Sedimentation der Zellen auf den Lamellen, sowie den Selbstaustrag der Zellen durch suspendierte Feststoffpartikel verbessert, die Bio­ reaktor und Lamellenklärer im Kreislauf passieren.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Fest­ stoffpartikel vorzugsweise aus Polyacrylester bestehen.