DE4311756A1

DE4311756A1 - Modifizierte Peptide, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE4311756A1
Application number: DE19934311756
Authority: DE
Inventors: Annette Dipl Ch Beck-Sickinger; Klaus Dipl Chem Dr Rudolf; Wolfgang Dipl Chem Dr Eberlein; Wolfhard Dipl Chem Dr Engel; Guenther Prof Dipl Chem D Jung; Klaus-Dieter Willim; Heike Andrea Wieland; Henry Dr Doods
Original assignee: Dr Karl Thomae GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1993-04-08
Publication date: 1994-10-13

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue modifizierte Peptide der allgemeinen Formel

NPY(1-16)-X¹-NPY(18-33)-X²-X³-Y-(CH₂)n-R (I),

und, für den Fall, daß X³ (R,S)-Arg bedeutet, deren Gemi sche zweier diastereomerer Epimeren, deren Salze, insbeson dere für die pharmazeutische Anwendung deren physiologisch verträgliche Salze mit anorganischen oder organischen Säuren oder Basen, welche wertvolle blutdrucksenkende Wirkstoffe darstellen, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, de ren Verwendung und Verfahren zu ihrer Herstellung.

In der obigen allgemeinen Formel I bedeuten

NPY(1-16) die Aminosäuresequenz 1-16 von Neuropeptid Y (NPY),
also
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp,
NPY(18-33) die Aminosäuresequenz 18-33 von Neuropeptid Y,
also
-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile- Thr-Arg-,
X¹ Met oder Leu,
X² Gln, (R)-Gln, Pro oder (R)-Pro,
X³ Arg, (R)-Arg oder (R,S)-Arg,
Y ein Sauerstoffatom oder eine NR¹-Gruppe, in der
R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe darstellt,
und R eine Phenyl- oder Naphthylgruppe, welche durch Fluor-, Chlor- oder Bromatome, Alkyl-, Phenyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Phenylalkoxy-, Alkylcarbonyl-, Amino-, Alkylamino-, Dialkyl amino-, Alkylsulfonylamino-, Alkylcarbonylamino-, Alkoxycar bonylamino-, Carboxy-, Alkoxycarbonyl-, Aminocarbonyl-, Al kylaminocarbonyl-, Dialkylaminocarbonyl-, Alkylcarbonyloxy-, Alkylsulfonyloxy-, Hydroxymethyl-, 1-Hydroxyethyl-, 2-Hy droxyethyl-, Aminosulfonyl-, Alkylaminosulfonyl-, Cyanamino-, Aminocarbonylamino-, Alkylaminocarbonyl-, Dialkylaminocar bonylamino- oder NH₂-C(=N-CN)-NH-Gruppen mono- oder di substituiert sein kann, wobei die Substituenten gleich oder verschieden sein können,
eine 5-gliedrige Heteroarylgruppe, die eine Iminogruppe, ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine Iminogruppe und ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom enthält, oder eine 6-gliedrige Heteroarylgruppe, die 1 oder 2 Stickstoff atome enthält, wobei die vorstehend erwähnten heteroaromati schen Ringe im Kohlenstoffgerüst durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch eine Phenylalkylgruppe substituiert und sowohl die 5-gliedrigen als auch die 6-gliedrigen heteroaromatischen Ringe jeweils benzokonden siert und zusätzlich durch ein Fluor-, Chlor- oder Bromatom, durch eine Alkyl-, Alkoxy-, Hydroxy-, Phenyl-, Nitro-, Amino-, Alkylamino-, Dialkylamino-, Alkanoylamino-, Cyano-, Carboxy-, Alkoxycarbonyl-, Aminocarbonyl-, Alkylaminocar bonyl-, Dialkylaminocarbonyl-, Fluormethyl-, Difluormethyl-, Trifluormethyl-, Alkanoyl-, Aminosulfonyl-, Alkylaminosulfo nyl- oder Dialkylaminosulfonylgruppe monosubstituiert oder durch Fluor-, Brom- oder Chloratome, durch Methyl-, Methoxy- oder Hydroxygruppen disubstituiert sein können, oder
eine Phenylgruppe, die durch einen [1,5-Dihydro-2,4(3H)- dioxo-imidazol-3-yl]alkyl- oder [Dihydro-3,5(4H)-dioxo-3H- 1,2,4-triazol-4-yl]alkyl-Rest substituiert ist, wobei der Imidazol- und Triazolteil zusätzlich durch 1 oder 2 Phenyl reste substituiert sind,
sowie die bei der Definition der vorstehenden Reste erwähn ten Alkyl- und Alkoxyteile jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthalten können.

Bevorzugt sind die folgenden Verbindungen der allgemeinen Formel I:

(1) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)
(2) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OC₂H₅
(3) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OCH₂C₆H₅
(4) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OCH₂CH₂C₆H₅
(5) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₅
(6) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NH-CH₂-3-[(1,2-diphenyl- 3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-4-yl)methyl]phenyl
(7) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂-(1,2-diphenyl- 3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-4-yl)
(8) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OH(m)
(9) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆ H₄OCH₃ (m)
(10) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OH(p)
(11) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂ C₆H₄NHC OCH₃(p)
(12) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OCH₃(p)
(13) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H ₄OCH₃(p)
(14) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₅
(15) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Pro-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)
(16) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-(R)-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)
und deren Salze.

Die oben angegebenen Verbindungen können nach allgemein be kannten Methoden der Peptidchemie, wie z. B. in Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 15/2, beschrieben, oder bevorzugt nach der Festphasenpeptidsynthese (z. B.: B. Barany, R.B. Merrifield in The Peptides, Analysis, Syn thesis, Biology, Vol. 2, 2-284 [1980], Academic Press, New York, oder R.C. Sheppard, Int. J. Pept. Prot. Res. 21, 118 [1983]) oder gleichwertigen bekannten Methoden hergestellt werden. Als Aminoschutzgruppen werden die in Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 15/1, beschriebenen verwendet, bevorzugt werden Urethanschutzgruppen wie z. B. die Fluorenylmethoxycarbonyl- oder die tert.-Butyloxycarbo nylschutzgruppe angewendet. Zur Verhinderung von Nebenreak tionen sind in der Regel eventuell vorhandene funktionelle Gruppen in den Seitenketten der Aminosäuren durch geeignete Schutzgruppen (siehe z. B.: G.B. Fields et al., Int. J. Pep tide Protein Res. 35, 161 (1990); T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis) zusätzlich geschützt. Bevorzugt verwendet werden dabei Arg(NO₂), Arg(Mtr), Arg(di-Z), Arg(Pmc), Tyr(t-Bu), Tyr(Bzl), Tyr(Br-Z), Ser(t-Bu), Ser(Bzl), Glu(t-Bu), Glu(Bzl), Lys(Boc), Lys(Z), His(Trt), His(Bum), His(Dnp), His(Z), Thr(t-Bu), Thr(Bzl), Cys(Acm), Cys(4-Me-Bzl), Cys(t-Bu), Asp(t-Bu), Asp(Bzl), Orn(Boc), Orn(Z), Cys(Trt), Asn(Trt), Asn(Tmob), Asn(Mbh), Gln(Trt), Gln(Tmob), Gln(Mbh) und Lys(Cl-Z).

Zur Synthese der Verbindungen der allgemeinen Formel I nach der Festphasensynthese sind als Ankergruppen alle diejenigen geeignet, die bei der Abspaltung des Peptids vom polymeren Träger voll geschützte Peptidsäuren liefern. In Kombination mit der Boc-Aminoschutzgruppe werden bevorzugt bromierte α-Methylphenacyl-Anker (a; S.-W. Wang, J. Org. Chem. 41, 3258 (1976)) oder [4-(2-Brompropionyl)-phenoxy)essigsäure- Anker (b; D. Bellof und M. Mutter, Chimia A3, 317 (1985)), verwendet.

In Kombination mit der Fmoc-Schutzgruppe sind verschiedene Ankergruppen anwendbar:
4-[(2, 4-Dimethoxyphenyl)-hydroxymethyl]phenoxy-Linker ("su perlabiler Rink-Linker"; c; H. Rink, Tetrahedron Lett. 28, 3787 (1987));
[4-(Hydroxymethyl)-3-methoxyphenoxy]butyryl-Linker (HMPB; d; A. Flörsheimer und B. Riniker, 21^st EPS, P 95 (1990));
4-(Hydroxymethyl)-3-methoxyphenoxy-Linker (SASRIN; e; M. Mergler et al., Tetrahedron Lett. 29, 4009 1988));
2-Chlortrityl-Linker (f; K. Barlos et al., Tetrahedron Lett. 30, 3943 (1989));
Allyl-Linker (g; H. Kunz und B. Dombo, Angew. Chem. 100, 732 (1988)).

Besonders der SASRIN-Linker bewährt sich. Man kuppelt bevor zugt die C-terminale Fmoc-geschützte Aminosäure nach Stan dardmethoden, z. B. mit Hilfe von DCCI oder DIC/HOBt bei Raumtemperatur über Nacht, oder verwendet das käufliche Derivat (Bachem, Bubendorf, Schweiz), das bereits mit der C-terminalen Aminosäure beladen ist.

Nach Abspaltung der Aminoschutzgruppe der an das Harz gekup pelten Aminosäure mit einem geeigneten Reagenz, z. B. mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan im Falle der Boc-Gruppe oder einer 20-50%igen Lösung von Piperidin in DMF im Falle der Fmoc-Gruppe, werden die geeignet geschützten Aminosäuren angekuppelt. Dieser Cyclus wird nacheinander so oft durch laufen bis das gewünschte harzgebundene Peptid entstanden ist.

Zur Kupplung können die in der Peptidchemie bekannten Metho den (s. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 15/2) angewendet werden. Bevorzugt verwendet werden Carbodi imide, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbo diimid oder Ethyl-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid oder O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluroniumhexa fluorophosphat (HBTU) oder -tetrafuoroborat (TBTU) oder 1H- Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexa fluorophosphat (BOP). Durch Zusatz von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) oder 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin (HOObt) kann gegebenenfalls die Racemisierung unterdrückt bzw. die Reaktionsgeschwindigkeit gesteigert werden. Die Kupplungen werden normalerweise mit einem 4- bis 10-fachen Überschuß an N-geschützter Aminosäure und Kupplungsreagenz in Lösungsmitteln wie Dichlormethan, Dimethylformamid (DMF), N-Methylpyrrolidon (NMP), Dimethylacetamid (DMA) oder Gemi schen aus diesen durchgeführt. Der Verlauf der Kupplungs reaktion wird durch den Kaiser-Test (E. Kaiser u. a., Anal. Biochem. 34, 595 [1970]) oder durch den TNBS-Test verfolgt. Falls eine unvollständige Acylierung festgestellt wird, wird die Kupplung bis zur Vollständigkeit wiederholt. Die Fest phasensynthese kann sowohl manuell als auch automatisch mit Hilfe eines Peptidsynthesizers erfolgen.

Bevorzugt werden Festphasensynthesen unter Verwendung des 4-(Hydroxymethyl)-3-methoxyphenoxy-Linkers, Fmoc-Aminoschutz gruppen und des automatischen Synthesizers von ABI (430A) oder des automatischen multiplen Synthesizers SMPS 350 (Zinsser Analytics, Frankfurt/M.). Es werden Einfachkupplun gen bei einer Aktivierung mit HOBt/TBTU/DIPEA (1 : 1 : 1,5) und 10-fachem Überschuß der N-geschützten Aminosäure oder Dop pelkupplungen mit DIC/HOBt-Aktivierung und 5- bis 10-fachem Überschuß an N-geschützter Aminosäure durchgeführt. Das Harz wird nach jedem Kupplungsschritt mit DMF und Isopropanol ge waschen.

Nach Aufbau des Peptids wird vom polymeren Träger abgespal ten. Bei Verwendung der oben angeführten Ankergruppen erhält man die vollgeschützten Peptidsäuren, sofern photolytisch (a,b), durch nucleophilen Angriff von Alkali- oder Benzyl trialkylammoniumhydroxid, z. B. Triton B (b), Pd°-kataly siert in Gegenwart von Morpholin (g) oder mit verdünnten Säuren (0,5 bis 1% Trifluoressigsäure in Dichlormethan (c, d, e); Eisessig/Dichlormethan 1/9 (c); Eisessig/TFE/DCM 1 : 1 : 8 bis 2 : 2 : 6 (f)) abgespalten wird. Mit diesen Reagenzien werden in der Regel und bei Verwendung der entsprechenden Seitenkettenschutzgruppen die während der Synthese geschütz ten funktionellen Gruppen des Peptids nicht freigesetzt.

Die voll geschützten Peptidsäuren werden anschließend in ge eigneten Lösemitteln, vorzugsweise in Dimethylformamid, Di chlormethan oder Gemischen davon, mit Aminen bzw. Alkoholen der allgemeinen Formel II

HY-(CH₂)_n-R (II),

in der
R, Y und n die eingangs angegebenen Bedeutungen haben, und unter Verwendung der oben beschriebenen Kupplungsreagenzien, vorzugsweise TBTU/HOBT/DIPEA oder DIC/HOBt, umgesetzt. Ab schließend werden die Seitenketten-Schutzgruppen mit geeig neten, im Prinzip literaturbekannten Reagenzien abgespalten, und zwar im Falle der nach der Boc-Strategie aufgebauten Pep tide beispielsweise mit flüssigen Fluorwasserstoff, im Falle der nach der Fmoc-Strategie erhaltenen Peptide beispielswei se mit Trifluoressigsäure.

Üblicherweise werden bei der Abspaltung der Seitenketten- Schutzgruppen als Kationenfänger Substanzen wie Phenol, Kre sol, Anisol, Thiokresol, Thioanisol, Indol, Dimethylsulfid oder Ethylmethylsulfid oder eine Mischung dieser Substanzen dem Fluorwasserstoff bzw. der Trifluoressigsäure zugesetzt.

Die Reinigung der erhaltenen Rohprodukte erfolgt mittels Gelchromatographie, z. B. an Sephadex G25 mit 1%iger oder 5%iger Essigsäure und/oder mittels präparativer RP-HPLC mit Methanol- oder Acetonitril-Wasser-Gradienten unter Zusatz von 1 bis 2% Trifluoressigsäure. Zur Reinigung können auch Kationenaustauscher auf Sephadex- oder Polystyrol-Basis an gewendet werden.

Die so erhaltenen neuen Peptide der allgemeinen Formel I lassen sich gewünschtenfalls anschließend in ihre Additions salze mit anorganischen oder organischen Säuren oder Basen, insbesondere für die pharmazeutische Anwendung in ihre phy siologisch verträglichen Salze, überführen. Beispielsweise kommen Natriumsalze, Kaliumsalze oder Salze mit Cyclohexyl amin, Äthanolamin, Diäthanolamin, Triäthanolamin, N-Methyl glucosamin, Arginin oder Lysin in Betracht. Als Säuren seien beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphor säure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Methansulfonsäure, Fu marsäure, Bernsteinsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Wein säure, Maleinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Essigsäure, Mandel säure und Äpfelsäure genannt.

Analytik

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können mittels RP-HPLC und/oder Kapillarzonenelektrophorese auf Reinheit geprüft werden. Es wird jeweils eine Aminosäureanalyse mit tels HPLC nach Gasphasenhydrolyse und PTH-Derivatisierung und/oder am Gaschromatographen an chiraler Säule zur zusätz lichen Racemisierungskontrolle durchgeführt. Darüber hinaus werden Elektrospray-Massenspektren (API III, Sciex) zur Cha rakterisierung aufgenommen.

Die Sequenzbestimmung erfolgt mittels Gasphasensequenzierung.

Die für die Aminosäuren verwendeten Abkürzungen entsprechen dem üblichen Dreibuchstabencode, wie er z. B. in Europ. J. Biochem. 138, 9 (1984) beschrieben ist. Die übrigen Abkür zungen werden nachfolgend erklärt.

Ac = Acetyl
Acm = Acetamidomethyl
Boc = tert.Butyloxycarbonyl
t-Bu = tert.Butyl
Bum = tert.Butyloxymethyl
Bzl = Benzyl
Cl-Z = 4-Chlorbenzyloxycarbonyl
DCC = Dicyclohexylcarbodiimid
DCM = Dichlormethan
DIC = Diisopropylcarbodiimid
DIPEA = Diisopropylethylamin
DMF = N,N-Dimethylformamid
Dnp = 2,4-Dinitrophenyl
Fmoc = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl
HOBt = 1-Hydroxybenzotriazol
4-Mebzl = 4-Methylbenzyl
Mtr = 4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenylsulfonyl
Mts = Mesitylen-2-sulfonyl
Pmc = 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
pNP = 4-Nitrophenyl
Trt = Trityl
Mbh = Methylbenzhydryl
Tmob = Trimethoxybenzyl

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen der Formel I lassen sich, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Wirk substanzen, zusammen mit einem oder mehreren inerten üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln, z. B. mit Mais stärke, Milchzucker, Rohrzucker, mikrokristalliner Zellulose, Magnesiumstearat, Polyvinylpyrrolidon, Zitronensäure, Wein säure, Wasser, Wasser/Äthanol, Wasser/Glycerin, Wasser/Sor bit, Wasser/Polyäthylenglykol, Propylenglykol, Stearylalko hol, Carboxymethylcellulose oder fetthaltigen Substanzen wie Hartfett oder mit geeigneten Gemischen davon, in übliche ga lenische Zubereitungen wie Tabletten, Drag´es, Kapseln, Pul ver, Suspensionen, Lösungen, Sprays oder Zäpfchen einarbei ten.

Die neuen Verbindungen und deren physiologisch verträgliche Salze besitzen NPY-antagonistische Eigenschaften und eignen sich somit zur Behandlung von cardiovasculären Erkrankungen, z. B. zur Behandlung des Bluthochdrucks, von coronaren Herz krankheiten sowie der Obesitas. Darüber hinaus können diese Verbindungen als wertvolle Hilfsmittel zur Erzeugung und Rei nigung (Affinitätschromatographie) von Antikörpern sowie, nach geeigneter radioaktiver Markierung, beispielsweise durch Umsetzung mit ¹²⁵I-Propionylchlorid oder durch direkte Mar kierung mit ¹²⁵I₂ oder ¹³¹I₂, in RIA- und ELISA-Assays An wendung finden und als diagnostische bzw. analytische Hilfs mittel in der Neutrotransmitter-Forschung eingesetzt werden.

Zum Nachweis der Affinität der Verbindungen der allgemeinen Formel I zu humanen NPY-Rezeptoren und ihrer antagonistischen Eigenschaften werden die folgenden Versuche durchgeführt:

A. Bindungsstudien mit (den humanen Y₁-Rezeptor exprimie renden) SK-N-MC-Zellen

Die Zellen werden durch ein Gemisch von 0,02% EDTA in PBS abgelöst und in 10 ml Inkubationsmedium (MEM/25 mM Hepes + 0,5% BSA, 50 µM PMSF, 0,1% Bacitracin, 3,75 mM CaCl₂) pro ca. 40 Mio. Zellen resuspendiert. Nach 5 min Zentrifuga tion (150×g) wird das Pellet im gleichen Volumen und nach einem weiteren Waschschritt in 10 ml Inkubationsmedium re suspendiert, ausgezählt und auf 1,25 Mio. Zellen/ml verdünnt. Dann werden 200 µl einer Suspension von 1,25 Mio. Zel len/ml 3 Stunden bei Zimmertemperatur mit 25 µl einer 300 pM Lösung von [¹²⁵I]-Bolton-Hunter-NPY und steigenden Konzentrationen (10^-11 bis 10^-6 M) der Testsubstanzen, unter Einhaltung eines Gesamtvolumens von jeweils 250 µl, inkubiert. Die Inkubation wird durch Zentrifugation (10 min bei 3000×g und 4°C) beendet. Nach einmaligem Waschen mit PBS wird die Radioaktivität des Pellets im Gamma-Counter ge messen. Die so erhaltene Radioaktivität repräsentiert die Summe von spezifischer und unspezifischer Bindung von [¹²⁵I]-Bolton-Hunter-NPY. Der Anteil der unspezifischen Bindung wird als jene Radioaktivität definiert, die in Anwe senheit von 1 µM NPY gebunden wird. Die IC₅₀-Werte der nichtmarkierten Testsubstanzen werden graphisch ermittelt. Sie repräsentieren jene Konzentration der jeweiligen Test substanz, bei der die spezifische Bindung von [¹²⁵I]-Bolton- Hunter-NPY an den NPY-Y₁-Rezeptor um 50% gehemmt wird.

B. Bindungsstudien mit (den humanen Y₂-Rezeptor exprimie renden) SMS-KAN-Zellen

Die Zellen werden in große Kulturflaschen ausgesät und bei 37°C und in einer 5% CO₂ enthaltenden Atmosphäre kultiviert, mit 0,02% EDTA enthaltendem PBS abgelöst, zentrifugiert und mit einer Spritze vereinzelt. Die weitere Versuchsdurchfüh rung entspricht den Angaben für die an SK-N-MC-Zellen durch geführten Bindungsstudien.

C. Calcium-Mobilisierungs-Assay

SK-N-MC-Zellen werden wie vorstehend beschrieben kultiviert, mit einem Kunststoffschaber geerntet und in 10 ml Beladungs puffer (PBS = phosphate buffered saline, in 1 ml jeweils 1 mg Glucose und 1 mg BSA enthaltend) pro ca. 40 Mio. Zellen sus pendiert. Nach 5 min Zentrifugation bei 150×g und bei Raum temperatur wird das erhaltene Pellet im gleichen Volumen Be ladungspuffer erneut aufgenommen, zentrifugiert, in 10 ml Beladungspuffer resuspendiert, ausgezählt und auf 3 Mio. Zellen/ml verdünnt. Die Zellen werden dann bei Raumtempera tur 1 Stunde lang im Dunkeln unter ständigem Schütteln mit 1 µM Fura-2/AM (Endkonzentration) beladen, nach einem Zen trifugationsschritt in Meßpuffer (PBS, enthaltend 1 mg Glu cose pro ml) resuspendiert, erneut bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert, zentrifugiert und in 10 ml Meßpuffer aufgenommen und auf 1 Mio. Zellen/ml eingestellt. In Abstän den von jeweils 30 s werden danach die jeweiligen Testsub stanzen und NPY in den gewählten Konzentrationen zugegeben. Die Berechnungen der cytoplasmatischen Ca²⁺-Konzentrationen werden gemäß Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260, 3440 (1985) durchgeführt.

Nach den vorstehenden Angaben wurden beispielsweise die fol genden Verbindungen untersucht:

A = NPY
B = [Leu 31, Pro 34] NPY
C = NPY(18-36)

und

D = NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)

Ergebnisse

Tabelle I

Aus der vorstehenden Tabelle I gehen klar die Y₁-antagoni stischen Eigenschaften der unter die allgemeine Formel I fal lenden neuen Verbindung D hervor.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher er läutern:

Allgemeine Vorschrift

Die Synthese der Peptide erfolgt in zwei Schritten:

1. Die Synthese der vollgeschützten Fragmente mit Hilfe der Standardmethode der Festphasenpeptidsynthese.
2. Die Umsetzung der vollgeschützten Fragmente mit einem Al kohol oder einem Amin in Lösung.

Festphasenpeptidsynthese

Die N-terminalen, vollgeschützten Fragmente des Neuropeptids Y wurden an einem vollautomatischen Gerät Modell 430 der Ap plied Biosystems (Weiterstadt) hergestellt. Folgende Synthe sezyklen für die Fmoc-Schutzgruppenstrategie wurden verwen det:

Abspaltung der Schutzgruppe:
2×5 min mit 25% Piperidin in DMF
Waschschritte:
2×3 min DMF
1×5 min Isopropanol
2×3 min DMF
Zugabe der voraktivierten Aminosäure (10 Äquivalente, akti viert mit TBTU, HOBt, DIPEA 1 : 1 : 1,5):
1×30 min
Waschschritte:
2×3 min DMF
2×5 min Isopropanol
2×3 DMF

0,2 g Sasrin-Harz (Bachem, Heidelberg), beladen mit 0,5 mmol/g der C-terminalen Aminosäure (0,1 mmol pro An satz), wurden mit je 1 mmol eingesetzter Aminosäure nach obigem Synthesezyklus umgesetzt, wobei folgende Derivate verwendet wurden:

Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(t-Bu)-OH,
Fmoc-Glu(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH,
Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH,
Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Arg(Pmc)-OH

Die N-terminale Aminosäure wurde als Nα-Boc-Derivat (Boc-Tyr(t-Bu)-OH) eingesetzt.

Nach Beendigung der Synthese wurde das polymergebundene, vollgeschützte Peptid 3 mal mit Diethylether gewaschen und getrocknet.

Die Abspaltung vom polymeren Träger erfolgte mit 0,5% Tri fluoressigsäure in Dichlormethan (10×2 ml, jeweils 15 min). Die vereinigten Filtrate wurden mit Pyridin neutralisiert, im Vakuum eingeengt und aus tert.Butanol lyophilisiert.

Umsetzung in Lösung

Die Umsetzung der vollgeschützten Fragmente erfolgte für Al kohole nach Variante (i), für Amine nach Variante (ii).

(i) Das vollgeschützte Peptidfragment (30 µmol) wurde in 5 ml Dichlormethan/DMF (1 : 2) gelöst, mit je 100 Äquivalenten Alkohol, DIC, HOBt und DIPEA versetzt und 4 Tage bei Raum temperatur gerührt.
(ii) Das vollgeschützte Peptidfragment (30 µmol) wurde in 5 ml Dichlormethan/DMF (1 : 2) gelöst, mit je 100 Äquivalenten Amin, TBTU, HOBt und 150 Äquivalenten DIPEA versetzt und 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt.

Nach Beendigung der Reaktion wurde das Lösemittel im Vakuum entfernt, der Rückstand in 5 ml Dichlormethan aufgenommen und die überschüssigen, hydrophilen Reaktanten durch Waschen mit 5%iger wäßriger KHSO₄-Lösung (3×), 5%iger wäßriger Na₂CO₃-Lösung (3×) und gesättigter wäßriger NaCl-Lösung (1×) abgetrennt. Die organische Phase wurde im Vakuum ein geengt. Zur Abspaltung der N-α-Boc-Gruppe sowie der Sei tenkettenschutzgruppen wurde das Peptid 4 h mit Trifluores sigsäure/Thioanisol/Thiokresol (90 : 5 : 5, 10 ml) gerührt, im Vakuum eingeengt und aus Diethylether/0,03% HCl gefällt. Nach zwei weiteren Waschschritten mit Diethylether im Ultra schallbad wurde das Peptid in Wasser gelöst und lyophili siert.

Die Reinigung erfolgte mittels Reversed Phase HPLC (Nucleo sil C-18, 10 µ, 100 Å) und einem Gradienten von 25% B auf 40% in 20 min (Säule: 20×250 mm, Fluß: 28 ml/min, A = 0,1%-ige wäßrige Trifluoressigsäure und B = 0,1% Tri fluoressigsäure in Acetonitril).

Beispiel 1 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)

Boc-Tyr(t-Bu)-Pro-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Pro-Asp(t-Bu)-Asn(Trt)- Pro-Gly-Glu(t-Bu)-Asp(t-Bu)-Ala-Pro-Ala-Glu(t-Bu)-Asp(t-Bu)- Leu-Ala-Arg(Pmc)-Tyr(t-Bu)-Tyr(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Ala-Leu- Arg(pmc)-His(Trt)-Tyr(t-Bu)-Ile-Asn(Trt)-Leu-Ile-Thr(t-Bu)- Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Arg(Mtr)-OH wurde nach der oben beschrie benen Strategie der Festphasenmethode dargestellt.

Die Umsetzung mit Tyramin erfolgte nach Variante (ii). Nach Abspaltung der N-α-Boc-Gruppe sowie der Seitenkettenschutz gruppen mit Trifluoressigsäure/Thioanisol/Thiokresol und Auf arbeitung erhielt man 25 mg (6 µM; 20% der Theorie) der Ti telverbindung.

Die Charakterisierung erfolgte mittels Aminosäureanalyse und Elektrospray-Massenspektrometrie (M_exp. 4207,2±1; M_theor. 4208). Die Retentionszeit im analytischen Lauf (Nucleosil C-18, 3 µ, 2×250 mm, Fluß 0,3 ml/min) bei einem linearen Gradienten von 30% auf 70% B in 25 min betrug 17,2 min. Das UV-Spektrum zeigte außer den charakteristi schen Banden eines tyrosinhaltigen Peptids bei 274 nm keine Absorption < 250 nm.

Beispiel 2 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OC₂H₅

Das entsprechend Beispiel 1 erhaltene vollgeschützte Peptid von NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OH wurde in Lösung nach Variante (i) mit Ethanol umgesetzt. Nach Abspaltung der Schutzgruppen und Aufarbeitung wie in Beispiel 1 erhielt man 22 mg (5,34 µM; 18% der Theorie) des obigen Peptidesters.
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4117. HPLC-Analyse (li nearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,3 min.

Beispiel 3 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OCH₂C₆H₅

Hergestellt analog Beispiel 2, jedoch unter Verwendung von Benzylalkohol an Stelle von Ethanol, in einer Ausbeute von 28 mg (6,7 µM; 22% der Theorie).
Elektrospray-Massenspek trum: M_exp. 4179. HPLC-Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,4 min.

Beispiel 4 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OCH₂CH₂C₆H₅

Hergestellt analog Beispiel 2, jedoch unter Verwendung von 2-Phenylethanol an Stelle von Ethanol, in einer Ausbeute von 16 mg (3,82 µM; 13% der Theorie).
Elektrospray-Massenspek trum: M_exp. 4193. HPLC-Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,8 min.

Beispiel 5 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₅

Hergestellt analog Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von 2-Phenylethanamin an Stelle von Tyramin, in einer Ausbeute von 24 mg (5,73 µM; 19% der Theorie).
Elektrospray-Massen spektrum: M_exp. 4192. HPLC-Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,8 min.

Beispiel 6 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NH-CH₂-3-[(1,2-diphenyl- 3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-4-yl)methyl]phenyl

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung von 3-[(1,2-Diphenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-4-yl)methyl]-benz enmethanamin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Aus beute von 20 mg (4,5 µM; 15% der Theorie).
Elektrospray- Massenspektrum: M_exp. 4443. HPLC-Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,4 min.

Beispiel 7 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂-(1,2-diphenyl- 3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-4-yl)

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung von 2-[(1,2-Diphenyl-3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-4-yl)ethanamin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Ausbeute von 26 mg (5,93 µM; 20% der Theorie).
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4485. HPLC-Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,5 min.

Beispiel 8 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OH(m)

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung von 3-Hydroxy-benzenmethanamin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Ausbeute von 36 mg (8,57 µM; 29% der Theorie).
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4199. HPLC-Analyse (li nearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,5 min.

Beispiel 9 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OCH₃(m)

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung von 3-Methoxy-benzenmethanamin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Ausbeute von 24 mg (5,7 µM; 19% der Theorie).
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4214. HPLC-Analyse (li nearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,7 min.

Beispiel 10 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OH(p)

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung von 4-Hydroxy-benzenmethanamin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Ausbeute von 30 mg (7,24 µM; 24% der Theorie).
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4199. HPLC-Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,5 min.

Beispiel 11 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄NHCOCH₃(p)

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung von 4-(Acetylamino)-benzenmethanamin an Stelle von 2-Phenylethan amin, in einer Ausbeute von 18 mg (4,24 µM; 14% der Theorie).
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4240. HPLC- Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,8 min.

Beispiel 12 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OCH₃(p)

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung von 4-Methoxy-benzenmethanamin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Ausbeute von 24 mg (5,7 µM; 19% der Theorie).
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4214. HPLC-Analyse (li nearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,9 min.

Beispiel 13 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H ₄OCH₃(p)

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung von 4-Methoxy-benzenethanamin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Ausbeute von 32 mg (7,58 µM 25% der Theorie).
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4223. HPLC-Analyse (li nearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 18,1 min.

Beispiel 14 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₅

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung von Benzylamin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Ausbeute von 28 mg (6,7 µM; 22% der Theorie).
Elektrospray-Massen spektrum: M_exp. 4178. HPLC-Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,8 min.

Beispiel 15 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Pro-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung der analog Beispiel 1 voll geschützten Peptidsäure von NPY(1-16)- Leu-NPY(18-33)-Pro-Arg-OH und von Tyramin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Ausbeute von 34 mg (8,13 µM; 27% der Theorie).
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4182. HPLC-Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 17,4 min.

Beispiel 16 NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-(R)-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)

Hergestellt analog Beispiel 5, jedoch unter Verwendung der analog Beispiel 1 voll geschützten Peptidsäure von NPY(1-16)- Leu-NPY(18-33)-Gln-D-Arg-OH und von Tyramin an Stelle von 2-Phenylethanamin, in einer Ausbeute von 22 mg (5,22 µM; 17% der Theorie).
Elektrospray-Massenspektrum: M_exp. 4213. HPLC-Analyse (linearer Gradient von 25 auf 75% B in 25 min): RT 18,0 min.

Claims

1. Modifizierte Peptide der allgemeinen Formel NPY(1-16)-X¹-NPY(18-33)-X²-X³-Y-(CH₂)_n-R (I),in der
NPY(1-16) die Aminosäuresequenz 1-16 von Neuropeptid Y (NPY), also
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu- Asp,
NPY(18-33) die Aminosäuresequenz 18-33 von Neuropeptid Y, also
-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile- Thr-Arg-,
X¹ Met oder Leu,
X² Gln, (R)-Gln, Pro oder (R)-Pro,
X³ Arg, (R)-Arg oder (R,S)-Arg,
Y ein Sauerstoffatom oder eine NR¹-Gruppe, in der R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe darstellt, und R eine Phenyl- oder Naphthylgruppe, welche durch Fluor-, Chlor- oder Bromatome, Alkyl-, Phenyl-, Hydroxy-, Alkoxy-, Phenylalkoxy-, Alkylcarbonyl-, Amino-, Alkylamino-, Dialkyl amino-, Alkylsulfonylamino-, Alkylcarbonylamino-, Alkoxycar bonylamino-, Carboxy-, Alkoxycarbonyl-, Aminocarbonyl-, Al kylaminocarbonyl-, Dialkylaminocarbonyl-, Alkylcarbonyloxy-, Alkylsulfonyloxy-, Hydroxymethyl-, 1-Hydroxyethyl-, 2-Hy droxyethyl-, Aminosulfonyl-, Alkylaminosulfonyl-, Cyanamino-, Aminocarbonylamino-, Alkylaminocarbonyl-, Dialkylaminocar bonylamino- oder NH₂-C(=N-CN)-NH-Gruppen mono- oder di substituiert sein kann, wobei die Substituenten gleich oder verschieden sein können,
eine 5-gliedrige Heteroarylgruppe, die eine Iminogruppe, ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine Iminogruppe und ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom enthält, oder eine 6-gliedrige Heteroarylgruppe, die 1 oder 2 Stickstoff atome enthält, wobei die vorstehend erwähnten heteroaromati schen Ringe im Kohlenstoffgerüst durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder durch eine Phenylalkylgruppe substituiert und sowohl die 5-gliedrigen als auch die 6-gliedrigen heteroaromatischen Ringe jeweils benzokonden siert und zusätzlich durch ein Fluor-, Chlor- oder Bromatom, durch eine Alkyl-, Alkoxy-, Hydroxy-, Phenyl-, Nitro-, Amino-, Alkylamino-, Dialkylamino-, Alkanoylamino-, Cyano-, Carboxy-, Alkoxycarbonyl-, Aminocarbonyl-, Alkylaminocar bonyl-, Dialkylaminocarbonyl-, Fluormethyl-, Difluormethyl-, Trifluormethyl-, Alkanoyl-, Aminosulfonyl-, Alkylaminosul fonyl- oder Dialkylaminosulfonylgruppe monosubstituiert oder durch Fluor-, Brom- oder Chloratome, durch Methyl-, Methoxy- oder Hydroxygruppen disubstituiert sein können, oder
eine Phenylgruppe, die durch einen [1,5-Dihydro-2,4(3H)- dioxo-imidazol-3-yl]alkyl- oder [Dihydro-3,5(4H)-dioxo-3H- 1,2,4-triazol-4-yl]alkyl-Rest substituiert ist, wobei der Imidazol- und Triazolteil zusätzlich durch 1 oder 2 Phenyl reste substituiert sind, bedeuten,
wobei die bei der Definition der vorstehenden Reste erwähn ten Alkyl- und Alkoxyteile jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthalten können,
deren Gemische zweier diastereomerer Epimeren, für den Fall, daß X³ (R,S)-Arg bedeutet, und deren Salze.

2. Als neue Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1:
(1) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)
(2) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OC₂H₅
(3) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OCH₂C₆H₅
(4) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-OCH₂CH₂C₆H₅
(5) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₅
(6) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NH-CH₂-3-[(1,2-diphenyl- 3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-4-yl)methyl]phenyl
(7) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂-(1,2-diphenyl- 3,5-dioxo-1,2,4-triazolidin-4-yl)
(8) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OH(m)
(9) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OCH₃(m)
(10) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OH(p)
(11) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄NHCOCH₃(p)
(12) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₄OCH₃(p)
(13) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OCH₃(p)
(14) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-Arg-NHCH₂C₆H₅
(15) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Pro-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)
(16) NPY(1-16)-Leu-NPY(18-33)-Gln-(R)-Arg-NHCH₂CH₂C₆H₄OH(p)
und deren Salze.

3. Physiologisch verträgliche Salze der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 mit anorganischen oder organischen Säuren oder Basen.

4. Arzneimittel, enthaltend als Wirkstoff eine Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 bis 2 oder dessen physiologisch ver trägliches Salz gemäß Anspruch 3 neben gegebenenfalls einem oder mehreren inerten Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmit teln.

5. Arzneimittel gemäß Anspruch 4, geeignet zur Behandlung des Bluthochdrucks, von coronaren Herzkrankheiten sowie der Obesitas.

6. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I ge mäß Anspruch 1 oder 2 als Hilfsmittel zur Erzeugung und Rei nigung von Antikörpern.

7. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel I ge mäß Anspruch 1 oder 2 zur radioaktiven Markierung zwecks Ver wendung in RIA- oder ELISA-Assays.

8. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels gemäß den Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß auf nicht chemischem Wege eine Verbindung gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 oder deren physiologisch verträgliches Additionssalz gemäß Anspruch 3 in ein oder in mehrere inerte übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel eingearbeitet wird.

9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß den An sprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst durch Festphasensynthese die vollgeschützte Peptidsäure herge stellt wird, wobei die gewünschte Aminosäuresequenz ausge hend von einer an einen polymeren Träger gebundenen Anker gruppe durch schrittweise Kupplung der entsprechenden ge schützten Aminosäuren aufgebaut wird, anschließend die nach Ablösung vom polymeren Träger erhaltene vollgeschützte Pep tidsäure in einem geeigneten Lösungsmittel mit einem Amin oder Alkohol der allgemeinen Formel II HY-(CH₂)_n-R (II),in der
R, Y und n die im Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen be sitzen, gegebenenfalls unter Verwendung eines Kupplungsrea genz, umgesetzt wird, abschließend die vorhandenen Seiten kettenschutzgruppen abgespalten werden und
gewünschtenfalls ein so erhaltenes Peptid der allgemeinen Formel I in ein Salz übergeführt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die während der einzelnen Umsetzungen verwendeten Schutz reste nach der Festphasensynthese wieder abgespalten werden.