DE4305452A1 - Verwendung von Extrakten der Pflanze Vitex Agnus castus zur Behandlung des Parkinson-Syndroms - Google Patents

Description

Dem Parkinson-Syndrom liegt pathogenetisch eine Degeneration pigmentierter nigrostriärer Neuronen zugrunde. Neurochemi­ sche, pharmakologische sowie klinische Ergebnisse der letzten 20 Jahre haben die entscheidende Rolle von Neurotransmittern, insbesondere derjenigen von Acetylcholin und Dopamin, für die Pathophysiologie des Parkinson-Syndroms gezeigt. Für die spe­ zifische Symptomatik des Parkinson-Syndroms wird zum Teil ein Überwiegen des cholinergen gegenüber dem dopaminergen System verantwortlich gemacht. Aus diesem Ungleichgewicht beider Sy­ steme zu ungunsten von Dopamin resultieren nicht nur die Hauptsymptome des Parkinson-Syndroms, sondern im dopaminergen System wird die Aktivität und Reaktivität verbliebener dopa­ minerger Neuronen bzw. postsynaptischer Rezeptoren verändert. Aus diesen Kenntnissen resultieren verschiedene therapeuti­ sche Grundlagen wie z. B. eine Substitution mit Levodopa, der Vorstufe von Dopamin, oder dem direkten Einsatz von Dopami­ nagonisten.

Zum Verständnis der Wirkung von Dopamin-Rezeptoren stimulie­ renden Substanzen werden vorab die physiologischen und bio­ chemischen Verhältnisse im Corpus striatum erläutert. Im Cor­ pus striatum befindet sich eine hohe Anzahl cholinerger Neu­ ronen mit stark verzweigtem Dendritensystem. An den Dendriten befinden sich dornartige Fortsätze. Diese Neuronen besitzen Synapsen mit Nervenzellen, die sowohl im Striatum selbst lo­ kalisiert sind als auch mit afferenten Fasern aus dem Cortex, dem Thalamus sowie dem Hirnstamm. Allein hieraus werden inhi­ bitorische und exzitatorische Transmitterwirkungen gefolgert, wobei dem Corpus striatum eine integrierende Funktion zu­ kommt. Dopamin scheint dabei eine modulatorische Rolle zuzu­ kommen. Auch die dopaminergen Fasern weisen im Striatum starke Verzweigungen auf. Diese Verzweigungen besitzen eine hohe Anzahl von Verdickungen, an welchen der Transmitter-Re­ lease erfolgt. Nur ein Teil der Verdickungen bildet Synapsen. Dopamin wird somit auch extrasynaptisch ausgeschüttet. Diese Freisetzungsform übt eine tonische Wirkung auf die Aktivität der intrastriatalen Neuronen aus.

Das Corpus striatum weist zwei Dopamin-Rezeptortypen auf, die als D1- und D2-Rezeptoren bezeichnet werden. D1-Rezeptoren sind an das Enzym Adenylatcyklase gekoppelt , während die D2- Rezeptoren davon unabhängig sind. Im Striatum der Ratte sind D1-Rezeptoren postsynaptisch, D2-Rezeptoren sowohl prä- als auch postsynaptisch lokalisiert (P. Seemann: Brain dopamine receptors. Pharmacol. Rev. 32 (1980) 229-313).

Die menschlichen Stammganglien wie z. B. das Corpus striatum verfügen ebenfalls über D1- und D2-Rezeptoren. Der physiolo­ gische Neurotransmitter, Dopamin, wirkt über die postsynap­ tischen D1-Rezeptoren in tonisch stimulierender Weise und an den D2-Rezeptoren in Form von "Soforteffekten" zur Kontrolle der Motorik. Diese Kontrolle erfolgt nur in funktionell synergistischer Weise beider Rezeptortypen. Dieser Synergis­ mus ist bei hoher Rate degenerierter Neuronen beeinträchtigt. Bei ausreichenden Dopaminkonzentrationen, die via postsynap­ tischer D1-Rezeptoren für die notwendige tonische Stimulation zuständig sind, ist bei zusätzlichem Einsatz von D2-Rezeptor­ agonisten, welche die postsynaptischen Rezeptoren stimulie­ ren, eine optimale physiologische motorische Kontrolle, d. h. u. a. Gegensteuerung bei cholinerger Überaktivität und damit eine effektive Behandlung der Parkinson-Symptome gewährlei­ stet (R. Markstein and J.-M. Vigouret: Is D1-receptor stimu­ lation important for the anti-parkinson activity of dopamine agonists? In: Early Diagnosis and Preventive Therapy in Par­ kinson′s Disease. Editors: H. Przuntek and P. Riederer, Springer Verlag, Wien, New York (1989) 257-268).

In der Therapie des Morbus Parkinson werden bislang nur Dopa­ min-Agonisten vom D2-Rezeptortyp verwandt (s. o.: R. Markstein . . . ). Pharmakologische Erkenntnisse und klinische Studien legen es nahe, dabei mit Levodopa für eine tonische Stimulation zu kombinieren (s. o.: R. Markstein . . . ; P.-A. Fischer, H. Przuntek, M. Majer und D. Welzel: Kombinationsbe­ handlung früher Stadien des Parkinson-Syndroms mit Bromocrip­ tin und Levodopa. Dtsch. Med. Wschr. 109 (1984) 1279-1823; H. Przuntek, D. Welzel, E. Blümner, W. Danielcyk, H. Letzel, H.-J. Kaiser, P.H. Kraus, P. Riederer, D. Schwarzmann, H. Wolf, and K. Überla: Bromocriptine lessens the incidence of mortality in L-Dopa-treated parkinsonian patients: prado-study disconi­ nued. Eur. J. Clin. Pharmacol (publication in volume 43, 1992) und über die gleichzeitige Stimulation an den postsyn­ aptischen D2-Rezeptoren den Funktionszustand des Synergismus beider Rezeptortypen wiederherzustellen.

Die dopaminerge Wirkung von Dopaminagonisten läßt sich in verschiedenen in vivo oder in vitro-Tests demonstrieren. Einen z. B. häufig verwendeten Test stellt das sogenannte Ungerstedt-Modell dar (U. Ungerstedt: Striatal dopamine re­ lease after amphetamine or nerve degeneration revealed by ro­ tational behaviour. Acta Physiol Scand Supp. 367 (1971) 69). Hierbei wird bei Ratten durch unilaterale Zerstörung dopami­ nerger Neuronen im nigrostriatalen Nervenstrang eine Asyme­ trie zentraler Systeme erzeugt. Eine Applikation dopaminerg wirkender Substanzen induziert dann eine Drehung des Tieres zu der der Läsion kontralateralen Seite. Dieses Modell hat jedoch den Nachteil, daß es keine Auskunft über molekulare Wirkmechanismen oder hinsichtlich Rezeptor-Spezifität geben kann. Mittels biochemischer in vitro-Methoden ist es möglich, eine weitere Charakterisierung dieser Substanzen vorzunehmen. Substanzen, welche direkt auf Dopaminrezeptoren wirken, sind in der Lage, in spezifischer Weise Liganden zu verdrängen, die an Dopamin-Rezeptoren binden. Durch Verwendung von Ligan­ den, welche nur an ganz bestimmte Rezeptortypen binden, las­ sen sich viele Hinweise hinsichtlich der Spezifität einer Verbindung gewinnen. Den Liganden-Bindungsstudien haftet der Nachteil an, daß sich potentiell agonistische von antagoni­ stischen Effekten nicht immer trennen lassen. Daher sind auch funktionelle Tests notwendig. Als Test für eine D2-Re­ zeptorwirkung wird die Hemmung der stimulierten Acetylcholin- Freisetzung aus Striatumgewebeschnitten angesehen (J.C. Stoof, R.E. Thieme, M.C. Vrÿoed-de Vries, A.H. Mulder: In vitro Ace­ tylcholine Release from Rat Caudate Nucleus as a New Modell for Testing Drugs with Dopamine-receptor Activity. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 309 (1979) 119-124). Substanzen mit D2-Rezeptoraktivität hemmen darüber hinaus die Freiset­ zung von Dopamin aus Striatumschnitten (K. Starke, W. Reimann, A. Zumstein, G. Hertting: Effekts of dopamine receptor agonists and antagonists on release of dopamine in the rabbit caudate nucleus in vitro. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 305 (1978) 27-36).

Substanzen mit Rezeptoraktivität können im Tiermodell direkt in den Bereich der Stammganglien appliziert werden. Im Falle von D2-Rezeptoraktivität wird der Dopamin-Release suppri­ miert.

Eine der am häufigsten therapeutisch verwandten Substanzen ist Bromocriptin, ein selektiver D2-Rezeptoragonist. Für op­ timale therapeutische Effekte beim Parkinson-Syndrom ist die gleichzeitige Stimulation von D1- und D2-Rezeptoren erforder­ lich. Aus diesem Grund sollte im Falle eines selektiven D2- Rezeptoragonisten mit Levodopa kombiniert behandelt werden. Zur Regulation der Motorik besteht eine funktionelle synergi­ stische Interaktion beider Rezeptortypen (s. o.: R. Markstein . . . ). Trotz therapeutischer Erfolge sind die Neben­ wirkungen solcher D2-Rezeptoragonisten wie z. B. Übelkeit, Erbrechen, Schwindelgefühl, Blutdruckabfall, Halluzinationen etc. nicht unerheblich. Daher ist die Suche nach anderen wirksamen, jedoch weniger von Nebenwirkungen gekennzeichneten dopaminergen Substanzen angezeigt.

Bei derartiger Suche eines Arzneimittels mit stimulierenden Eigenschaften an postsynaptischen D2-Rezeptoren, möglicher­ weise auch an D1-Rezeptoren, ergibt sich, daß die erfin­ dungsgemäße Verwendung von Extrakten der Pflanze Vitex Agnus castus zur Stimulation von Dopamin-Rezeptoren in Hirnstamm­ ganglien und damit zur Behandlung des Parkinson-Syndroms voll der einer Erfindung zugrunde liegenden Zielsetzung ent­ spricht.

Vitex Agnus castus gehört zur Familie der Verbenaceae. Der Strauch ist im Mittelmeergebiet beheimatet. Die reifen, ge­ trockneten Früchte finden bei der Extraktherstellung Verwen­ dung (G. Hahn, A. Mayer und H. Soicke: Mönchspfeffer Teil 1. no­ tabene medici 4 (1986), 233-236. G. Hahn, A. Mayer und H. Soicke: Mönchspfeffer Teil 2. notabene medici 5 (1986), 297-301).

Zum Nachweis der Wirksamkeit von Vitex Agnus castus, und zwar in Form stimulierender Effekte an Dopaminrezeptoren in Stamm­ ganglien kommen verschiedene Verfahren der Extraktherstellung in Betracht.

Es werden beispielhaft folgende Herstellungsverfahren zur Ge­ winnung wirksamer Extrakte aufgeführt.

Beispiel 1: HAB 1

Verwendet werden die reifen, getrockneten und zerkleinerten Früchte von Vitex Agnus castus L. Ein Teil der nach Vor­ schrift zerkleinerten Droge wird mit 0,5 Teilen Ethanol 62% G/G gleichmäßig durchfeuchtet und bleibt mindestens zwei Stunden lang bedeckt stehen. Dann wird abgesiebt und die aus Droge und Alkohol bestehende Masse in einen Perkolator ge­ füllt und die Drogenoberfläche mit Filterpapier abgedeckt. Mit der erforderlichen Menge an Extraktionsflüssigkeit bis zu einem Verhältnis von einem Teil Droge zu 10 Teilen Ethanol wird der Perkolator danach aufgefüllt. Der Perkolator wird bedeckt und bleibt 24 Stunden stehen. Der Ablauf der Extrak­ tionsflüssigkeit wird so eingestellt, daß für 100 g Droge vier bis sechs Tropfen pro Minute abtropfen. Nach Beendigung des Abtropfens wird der Drogenrückstand ausgepreßt, die Flüs­ sigkeit mit dem Perkolat vereinigt und die Mischung fil­ triert.

Beispiel 2: DAB 10

Verwendet werden die reifen, getrockneten und zerkleinerten Früchte von Vitex Agnus castus L. Die Extraktion der Früchte erfolgt durch Perkolation im Verhältnis von einem Teil Droge zu 10 Teilen Extraktionsmittel 62% G/G Ethanol.

Die ausgenutzte Höhe (Länge des Drogendochtes des Perkola­ tors) beträgt mindestens das 5fache des mittleren Durchmes­ sers des Gefäßes.

Die vorschriftsmäßig zerkleinerte Droge wird mit der Menge der vorgeschriebenen Flüssigkeit, die 30% des Drogenge­ wichtes entspricht, gleichmäßig durchfeuchtet und bleibt min­ destens zwei Stunden lang bedeckt stehen. Dann wird abgesiebt (2800) und die Droge unter schwachem Druck bei geöffnetem Ab­ flußhahn in den unten mit einer Watteschicht verschlossenen Perkolator eingefüllt. Die Drogenoberfläche wird z. B. durch Filtrierpapier oder Glaskugeln so abgedeckt, daß beim Nach­ gießen der Flüssigkeit keine Drogenteile aufgewirbelt werden. Es wird langsam so viel Extraktionsflüssigkeit zugegeben, bis die Extraktlösung abzutropfen beginnt. Bei geschlossenem Hahn wird so viel nachgefüllt, daß die Oberfläche der Droge mit Flüssigkeit bedeckt ist. Der Perkolator wird bedeckt und bleibt 24 Stunden lang stehen. Danach läßt man die Flüssig­ keit derart abfließen, daß für je 100 g Droge 4 bis 6 Tropfen in der Minute abtropfen. Die Extraktionsflüssigkeit wird so nachgegossen, daß die Drogenoberfläche stets bedeckt bleibt. Ist nach Beendigung der Zugabe die im Perkolator noch vorhan­ dene Extraktionsflüssigkeit abgetropft, wird der Drogenrück­ stand ausgepreßt und die Mischung filtriert.

Beispiel 3 (wäßrige Lösung)

Ausgangsprodukt für die Herstellung einer Lösung der wasser­ löslichen Inhaltsstoffe von Agnus castus-Extrakt ist z. B. das unter Beispiel 1 genannte Herstellungsverfahren.

Die Extraktionsflüssigkeit wird mit einem Rotationsverdampfer bei 30°C unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Anschließend wird dieser Rückstand bezogen auf das eingesetzte Aus­ gangsvolumen der Extraktionsflüssigkeit in einem Volumen von 30% sterilem Aqua bidest. resuspendiert. Nach einer Zentri­ fugation (5000 RPM, 10 min.) wird der Überstand einer Sterilisation unterzogen (0,45 µm Filter, Sartorius AG Göttingen) und das Filtrat aufgefangen. Durch die Resuspen­ sion und Filtration reduziert sich der Trockenextrakt auf die wasserlöslichen Inhaltsstoffe, wobei diese ca. 50% der Aus­ gangsmasse betragen. Das Filtrat hat eine Konzentration von 20 mg/ml wasserlöslicher Inhaltsstoffe des Trockenextraktes aus der ursprünglichen Extraktionsflüssigkeit.

Beispiel 4 (Trockenextrakt)

Die nach den Verfahren Beispiel 1 und Beispiel 2 hergestell­ ten Extrakte werden mit und ohne Zuschlagsstoffe zu Trocken­ extrakten verarbeitet. Dabei kann die Trocknung mittels Sprüh- oder Vakuumtrocknung erfolgen.

Beispiel 5 (hinsichtlich dopaminerger Wirkprinzipien gerei­ nigte Extrakte)

Ausgangsprodukte für anschließende verschiedenartige Reini­ gungsschritte in Richtung dopaminerger Wirksubstanz(en) sind die unter den Beispielen 1 und 2 genannten Herstellungsver­ fahren.

Beispiel 6 (Reinsubstanzen)

Aus Agnus castus-Extrakt isolierte Reinsubstanzen mit stimu­ lierenden Effekten an D1- und D2-Rezeptoren.

Untersuchungen, anhand derer gezeigt wird, daß Extrakte von Vitex Agnus castus in Stammganglien an D1-Rezeptoren binden und D2-Rezeptoren in Stammganglien stimulieren und damit zur Behandlung des Parkinson-Syndroms geeignet sind
Um experimentell zu untersuchen, ob Extraktzubereitungen von Vitex Agnus castus dopaminerge Wirkung, d. h. stimulierende Eigenschaften an D1- und D2-Rezeptoren aufweisen, wurde ein Dopamin-Rezeptorassay angewendet.

Für den Nachweis der Bindung an einem oder beiden Rezeptorty­ pen (D1/D2) wird die Verdrängung selektiver Liganden analy­ siert. Die Dopamin-Rezeptorassays werden mit Membranpräpa­ rationen aus Corpus striatum-Gewebe von Ratten durchgeführt. Da die molekularen Eigenschaften der D2-Rezeptoren im Stria­ tum mit denjenigen an den laktotropen Zellen des Hypo­ physenvorderlappens identisch sind, eignet sich Gewebe aus dem Corpus striatum, um dopaminerge Substanzen zu charakteri­ sieren. Daneben kann an Hypophysenzellkulturen die Inhibition der Prolaktin-Sekretion gezeigt werden. Die Inhibition der Prolaktin-Sekretion wird über den in den Hypophysenzellen ausschließlich vorhandenen D2-Rezeptor vermittelt.

Neben der Durchführung von Dopamin-Rezeptorassays werden in diesen Untersuchungen die Agnus castus-Extraktzubereitungen auch auf ihre Fähigkeit untersucht, die Prolaktinsekretion von Ratten-Hypophysenzellen in vitro zu beeinflussen.

Material und Methoden 1. Agnus castus-Aufbereitung

15 g eines Lyophilisates einer Agnus castus (AG)-Urtinktur (vgl. HAB 1) wurden in 2 l H₂O suspendiert und für 30 min. bei Raumtemperatur gerührt. Nach einer Zentrifugation von 30 min. bei 20 000 _* g bei 4°C wurde der Überstand über eine Ul­ trafiltration (YM 5000-Membran, Amicon, Witten) bis auf 200 ml eingeengt. Der konzentrierte Extrakt (=R 5000) wurde ali­ quotiert und lyophilisiert.

Für einen methanolisch-wäßrigen Auszug von AG-Samen wurde die gemahlene Droge für 5 Tage im Verhältnis 1 : 5 Droge/50% Methanol mazeriert. 50 g des getrockneten Extraktes wurden in 100 ml MeOH resuspendiert und zentrifugiert (30 min., 20 000 _* g bei 4 °C). Der Überstand wurde über eine semipräparative Gelchromatographie an Sephadex LH 20 (Pharmacia, Freiburg) in Methanol (Säulendurchmesser 10 cm, Gelbetthöhe 65 cm) chroma­ tographiert. Während dieser Chromatographie wurden 6 Fraktio­ nen geschnitten und getrocknet. Aliquots dieser Fraktionen wurden entweder in BSA-Medium für die Hypophysenzellkultur oder in Assaypuffer für den Radiorezeptorassay gelöst.

2. Dopamin-Rezeptorassay

Erwachsene männliche Ratten (Durchschnittgewicht 250 g, bezo­ gen von dem Zentralinstitut für Tierzucht in Hannover) wurden mit CO₂ narkotisiert und dekapitiert. Die Gehirne wurden rasch aus dem Schädel präpariert und das Corpus striatum her­ ausgeschnitten. Die Gewebestücke wurden sofort auf Trockeneis tiefgefroren und bei -70°C bis zur Membranpräparation aufbe­ wahrt. Für die Darstellung des Dopamin-Rezeptors wurden die Gewebestücke mit flüssigem Stickstoff tiefgekühlt und mit ei­ nem Dismembrator (Braun, Melsungen) pulverisiert. Das erhal­ tene Gewebepulver wurde in Extraktionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4) suspendiert und für 10 sec. mit Ultraschall behan­ delt. Die Suspension wurde danach für 30 min. bei 20 000 _* g und 4°C in einem SS 34 Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Membranpellet in Extraktionspuffer resuspendiert und durch intensives Pipettieren homogenisiert. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt wurde das erhal­ tene Pellet in Assaypuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂ und 0,1% Ascorbat) re­ suspendiert. Ein Aliquot dieser Suspension wurde für die Pro­ teinbestimmung mittels des Bradford-Assays asserviert. Die Membranpräparationen wurden mit Assaypuffer auf einen Pro­ teingehalt von 0,7 mg/ml eingestellt. 100 µl der Membranprä­ paration, 100 µl der Testprobe und 100 µl Tracer [5000 cpm von entweder mit Tritium markierten D2-Liganden Spiperon (D2- Antagonist) oder D1-Liganden SCH-23 390 (D1-Antagonist)] wur­ den in Polypropylenröhrchen pipettiert. Die Inkubation er­ folgte für zwei Stunden bei 4°C. Die Proben wurden danach mit 2 ml eiskaltem Assaypuffer verdünnt. Die Trennung von rezep­ torgebundenem und freiem Tracer erfolgte durch rasche Filtra­ tion durch Whatman-G/B-Filter. Zur Minimierung der unspezifi­ schen Bindung wurden die Filter dreimal mit 2 ml eiskaltem Assaypuffer, supplementiert mit 0,1% bovinem Serumalbumin, gewaschen. Vor der Zugabe der Szintillationsflüssigkeit wur­ den die Filter bei 37°C über Nacht getrocknet. Dopamin wurde als Standardsubstanz verwendet und in Assaypuffer in den ge­ eigneten Konzentrationen für die Standardkurve im Bereich zwischen 10^-4 und 10^-9 M verdünnt. Der Trockenrückstand des Agnus castus Extraktes bzw. daraus erhaltene Fraktionen wur­ den in Assaypuffer gelöst. Besondere Sorgfalt wurde darauf gelegt, einen pH-Wert von 7,4 zu gewährleisten, indem jede einzelne Probe auf den pH-Wert geprüft und, wenn notwendig, mit NaOH eingestellt wurde.

3. Hypophysenzellkulturen

Hypophysen wurden von den gleichen Ratten, die als Spender für die Corpora striata dienten, gewonnen. Der Hypophysenvor­ derlappen wurde mit Skalpellen mechanisch und anschließend enzymatisch mit 0,2% und 0,001% DNAse 1 in SMEM (Gibco, Karlsruhe, FRG) in Einzelzellen dispergiert. Nach mehreren Waschschritten wurden die dispergierten Zellen in einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen/ml in 96 Well-Mikrotiterplatten ausgesät. Das Kulturmedium wurde aus DMEM, Penicillin, Strep­ tomycin, Pyruvat, Pferde- und fötalem Kälberserum angesetzt. Nach einer Kulturdauer von 4 Tagen bei 37°C in einer wasser­ gesättigten Atmosphäre von 90% Luft 10% CO₂ haben die Zel­ len einen adhärenten, konfluenten Zellrasen auf dem Boden des Kulturgefäßes ausgebildet. Der Kulturüberstand wurde verwor­ fen und die adhärenten Zellen dreimalmit BSA-Medium (DMEM supplementiert mit 1% bovinem Serumalbumin, 10 mM Hepes) ge­ waschen. Jede Kavität der Mikrotiterplatte wurde mit 270 µl BSA-Medium gefüllt. Die Testproben wurden in einer Konzentra­ tion von 10 mg/ml in BSA-Medium gelöst, der pH-Wert geprüft und, wenn notwendig, auf pH 7,4 eingestellt. Pro Kavität wur­ den 30 µl der Testlösung eingesetzt. Nach 3 Stunden Inkuba­ tion bei 37°C und 10% CO₂-Begasung wurde das Kulturmedium aspiriert, zentrifugiert und die Hormonkonzentration im Kul­ turüberstand mit einem Radioimmunoassay für Prolaktin analy­ siert.

Unterschiede in den mittleren Hormonkonzentrationen in den Zellkulturüberständen wurden mit Hilfe der Varianzanalyse, gefolgt von Bonferoni′s Multiple T-Test, analysiert. Die Berechnung der statistischen Werte erfolgte mit dem Instat- Programm (Sigma, Deisenhofen). Als Signifikanzniveau wurde p < 0,05 festgelegt.

Ergebnisse

Eine typische Standardkurve des Dopamin-Rezeptorassays mit Dopamin als Standardsubstanz und dem D2-Liganden [H³]-Spipe­ ron als Tracer ist in Abb. 1 dargestellt. Das Alkaloid Apomorphin verdrängt dosisabhängig den D2-Liganden Spiperon von den striatalen Dopamin-Rezeptoren. In Übereinstimmung mit Literaturdaten ist Apomorphin ein potenterer Kompetitor für D2-Bindungsstellen als Dopamin selbst.

Die Effekte eines Agnus castus-Extraktes (R5000) auf die in vitro Prolaktin-Freisetzung im Vergleich zu Kontrollinkuba­ tionen ist in Abb. 2 im unteren Abschnitt dargestellt. R5000 inhibiert signifikant die in vitro Prolaktinsekretion auf etwa 1/3 der Kontrollwerte. Die Konzentration von Agnus ca­ stus beträgt 3,3 mg/ml Kulturmedium. Inhaltsstoffe dieser Agnus castus-Extraktzubereitung sind in der Lage, den D2-Li­ ganden Spiperon von D2-Bindungsstellen zu verdrängen, wie im mittleren Teil der Abb. 2 dargestellt. Der Pfeil deutet auf die Verdrängung, die mit R5000 in einer Konzentration von 3,3 mg/ml Ansatz erreicht wird, hin. Die Kompetition, die mit diesem Extrakt erreicht wird, entspricht dem Verdrängungsver­ mögen von 4,5 × 10⁴ M Dopamin. Striatale Membranen enthalten ebenso den D1-Subtyp des Dopamin-Rezeptors (P. Sokoloff, M.P. Martres, J.C. Schwartz: Naunyn-Schmiedeberg′s Arch. Phar­ macol. 315 (1980) 89). Die Fähigkeit von R5000, den D1-Rezep­ torliganden [H³]-SCH-23 390 von D1-Bindungsstellen zu ver­ drängen, ist im oberen Teil der Abb. 2 dargestellt. Wiederum können Inhaltsstoffe von R5000 den radioaktiv markierten Li­ ganden von den D1-Bindungsstellen verdrängen und zeigen dabei eine equipotente Kompetition von etwa 10 µmol Dopamin.

Die Wirkung der Fraktionen I-VI, gewonnen durch Chromatogra­ phie eines 50%igen Methanolextraktes aus AG über Sephadex LH 20 in Methanol, in beiden Testsystemen ist in Abb. 3 dar­ gestellt. Im Dopamin-Rezeptorassay verdrängen die Fraktionen I und V equipotent den radioaktiv markierten Liganden Spipe­ ron vom D2-Rezeptor (oberer Teil der Graphik) und haben eine Kompetitionsfähigkeit von etwa ungefähr 200 µmol Dopamin. Alle anderen Fraktionen zeigen eine vernachlässigbare Aktivi­ tät im D2-Rezeptorassay. Die Ergebnisse der Hypophysen-Zellkultur sind im unteren Teil der Abb. 3 zusammengefaßt. Die Fraktion I inhibiert die Prolaktin-Sekretion signifikant auf etwa 15% der Kontrollinkubation. Die folgenden Fraktionen II, III und IV sind deutlich weniger inhibitorisch wirksam, zeigen aber immer noch eine signifikante Reduktion der Prolaktin-Sekre­ tion. Fraktion V hingegen inhibiert die Prolaktin-Sekretion wiederum sehr potent. Fraktion VI verändert die Prolaktin- Freisetzung nicht.

Diskussion

Die Ergebnisse zeigen eine inhibitorische Wirkung von Ex­ traktaufarbeitungen von Agnus castus auf die in vitro-Pro­ laktinfreisetzung von dispergierten Rattenhypophysenzellen. Zusätzlich ist ersichtlich, daß Inhaltsstoffe von Agnus ca­ stus-Extrakt an Dopamin-Rezeptoren des Corpus striatum binden können. Dieser Befund ist nicht nur wichtig für die Erklärung der Effekte von Agnus castus auf die Prolaktin-Sekretion, sondern zeigt, daß diese Extraktzubereitungen auch zentral­ nervöse Effekte in Stammganglien besitzen.

Der Meßparameter in den Untersuchungen mit den Hypophysen- Zellkulturen ist die Bestimmung der Prolaktinkonzentration im Kulturüberstand. Eine Inkubation von Hypophysenzellen mit R5000 (AG) bewirkt eine signifikante Verminderung der Prolak­ tin-Sekretion. Da eine Hemmung der Prolaktin-Sekretion aus­ schließlich über D2-Rezeptoren erfolgt, ist der Schluß ge­ rechtfertigt, daß Inhaltsstoffe von Agnus castus D2-Rezeptor­ stimulierende Prinzipien enthalten.

Für den direkten experimentellen Beweis, daß Agnus castus D2- Rezeptor-aktive Wirkung besitzt, wurde der Dopamin-Rezepto­ rassay verwendet. In diesem Assay wird die Kompetition do­ paminerger Substanzen mit einem radioaktiv markierten und für D2-Rezeptoren selektiven Liganden um Dopamin-Rezeptoren ge­ messen. Dabei wurden als Quelle für Dopamin-Rezeptoren Plas­ mazellmembranen von Corpora striata (Stammganglien) der Rat­ ten verwendet. Es ist eindeutig gezeigt, daß Substanzen aus Agnus castus-Extrakt Stoffe enthalten, welche mit [H³]-Spipe­ ron um den D2-Rezeptor konkurrieren.

Corpora striata enthalten beide Typen des Dopamin-Rezeptors, nämlich den D1- und den D2-Rezeptor. Daher stellt der Stria­ tum-Membranassay ein geeignetes Modell dar, um Substanzen zu charakterisieren, die möglicherweise an beide Rezeptortypen binden. Hierzu müssen für jeden Rezeptortyp absolut selektive Liganden verwendet werden. [H³]-Spiperon bindet aus­ schließlich an den D2-Rezeptor (P. Seemann: Brain dopamine re­ ceptors. Pharmacol. Rev. 32 (1980) 229-313) und läßt sich sowohl von Dopamin selbst als auch von R5000 (AG) aus der Rezeptorbindung verdrängen. Da aber auch der selektive D1- Rezeptorligand [H³]-SCH 23 390 (s. o.: R. Markstein . . .) durch R5000 vom D1-Rezeptor verdrängt wird, ist das oder sind die Dopamin-Rezeptor-Wirkprinzipien auch D1-rezeptoraktiv.

Apomorphin ist eine bekannte prolaktininhibierende Substanz, welche über den D2-Rezeptor an den laktotropen Zellen des Hy­ pophysenvorderlappens die Hormonsekretion reduziert. Im Dopa­ min-Rezeptorassay ist Apomorphin ein besserer Kompetitor als der endogene Ligand Dopamin selbst. (s. o.: P. Sokoloff . . . ). Dieser Befund wird in den vorliegenden Experimenten bestä­ tigt, was gleichzeitig auch die Validität des Assayprotokolls beweist. Apomorphin bindet aber auch an den D1-Rezeptor im Corpus striatum. Die beobachtete Kompetition von R5000 um den D1- und D2-Rezeptor läßt den Schluß zu, daß Agnus castus-Ex­ trakt eine dopaminerge Substanz enthält, die in der Lage ist, an beiden Typen von Dopamin-Rezeptoren zu wirken. In diesem Falle läge eine dopamin- oder apomorphinähnliche Eigenschaft vor. Die Kompetition mit dem D1- und dem D2-Liganden kann aber auch durch zwei unterschiedliche Substanzen in Agnus ca­ stus-Extrakten hervorgerufen werden, welche durchaus spezi­ fisch für den jeweiligen Rezeptor sein können.

In einem weiteren Reinigungsschritt wurde ein Agnus castus- Extrakt über eine LH20-Säule in Methanol chromatographiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden erneut sowohl im Zellkultur­ als auch im Radiorezeptorassay untersucht. Das Experiment wurde entworfen, um zu untersuchen, ob Agnus castus mehr als ein aktives Wirkprinzip enthält. Der Extrakt wurde chromato­ graphisch in sechs Fraktionen unterteilt. Zwei Fraktionen (I und V) inhibieren die Prolaktin-Freisetzung und verdrängen den D2-Liganden vom D2-Rezeptor. Damit ist bewiesen, daß Agnus castus-Extrakt mindestens zwei Wirkprinzipien enthält, die über eine Bindung an den D2-Rezeptor auch die Prolaktin- Sekretion inhibieren. Ob diese beiden Komponenten in einer Strukturrelation stehen, dergestalt, daß ein größeres Molekül (eluierend in Fraktion I in der Gelchromatographie) ein Oli­ gomer oder ein Präcursor eines kleineren molekularen Wirkprinzips (eluierend in Fraktion V) ist, oder ob beide ak­ tive Fraktionen zwei strukturell verschiedene Substanzen ent­ halten, muß noch untersucht werden.

In den vorliegenden Untersuchungen wurde die Fähigkeit von Agnus castus-Extrakten mit radioaktiv markierten Liganden um Bindungsstellen an Dopamin-Rezeptoren zu konkurrieren, in ei­ ner wirkungsgleichen Menge an Dopamin ausgedrückt. Dies ist notwendig, da über das Molekulargewicht der aktiven Wirk­ stoffe keine Informationen vorliegen, so daß es nicht möglich ist, die Bindungseigenschaften in einer molaren Konzentration wiederzugeben.

Besonderes Augenmerk wurde darauf gerichtet, den pH-Wert je­ der Agnus castus-Präparation oder daraus gewonnener Fraktio­ nen in einem Bereich um 7,4 zu halten, da in einigen Proben nach Rekonstitution des Trockenrückstandes der pH-Wert unter 5,0 lag. Deswegen wurde jede einzelne Probe zur Vermeidung von Artefakten in den beiden Assaysystemen individuell auf den pH-Wert geprüft und, wenn notwendig, auf einen pH von 7,4 eingestellt.

Aus den Ergebnissen läßt sich die Schlußfolgerung ziehen, daß Inhaltsstoffe von Agnus castus-Extrakt via D2-Rezeptoren in den Stammganglien stimulatorische Effekte wie Dopamin selber zu erzielen in der Lage sind. Daraus leitet sich der Anspruch zur Verwendung von Extrakten der Pflanze Vitex Agnus castus zur Behandlung des Parkinson-Syndroms her. Ob es sich bei der Bindung an D1-Rezeptoren ebenfalls um stimulatorische Effekte handelt, wird angenommen, muß aber noch zweifelsfrei bewiesen werden.

Für das Funktionieren der synergistischen Effekte zwischen den D1- und D2-Rezeptoren in den Stammganglien ist es für op­ timale Therapieeffekte unerläßlich, neben der selektiven Stimulation postsynaptischer D2-Rezeptoren z. B. durch In­ haltsstoffe von Vitex Agnus castus-Extrakten, gleichzeitig für eine ausreichende Stimulation der postsynaptischen D1-Re­ zeptoren zu sorgen. Hierzu bietet sich, wie in der Therapie des Morbus Parkinson bislang üblich, eine Kombination mit Le­ vodopa an. Der Vorteil einer Kombination beider Therapiefor­ men liegt vornehmlich in der Einsparung der Levodopadosis. Bei hoher Degenerationsrate dopaminerger Neuronen ist die physiologischerweise erfolgende vesikuläre Wiederaufnahme von Dopamin reduziert. Das Überangebot an nicht vesikulär wieder gespeichertem Dopamin führt dann zu verstärkter Metabolisie­ rung, wobei für die Neuronen schädigende Substanzen in Form von freien Radikalen anfallen. Die alleinige Behandlung mit Levodopa oder bei Kombination die Verabreichung in hoher Do­ sis kann im Zuge einer Langzeitbehandlung somit zur Progredi­ enz der Erkrankung per se noch beitragen (8, 9). Ob durch das Bindungsvermögen von Inhaltsstoffen aus Agnus castus auch an D1-Rezeptoren das Funktionieren der synergistischen Effekte zwischen beiden Rezeptortypen möglich und ausreichend ist, kann zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht beantwortet werden.

Abb. 1

Standardkurve des D2 Dopamin-Rezeptorassays mit Dopamin als Standardsubstanz und H³-Spiperon als radioaktiv markiertem Ligand. Dargestellt sind die Einzelwerte der Dreifachbestimmung für jeden Standardpunkt. Die Kompetitionsfähigkeit von der Standardsubstanz DA ist im Vergleich zu Apomorphin abgebildet. Dargestellt sind die Ergebnisse eines von drei Experimenten.

Abb. 2

Wirkung des Agnus castus-Extraktes R5000 auf die in vitro Prolaktin (PRL)-Sekretion (unterer Teil der Graphik) und die Kompetitionsfähigkeit im D1- (oberer Teil) und D2- (mittlerer Teil) Rezeptorassay. Der Trockenrückstand des Extraktes R5000 wurde in einer Konzentration von 3,3 mg/ml Kulturmedium bzw. Assaypuffer in die Testsysteme eingesetzt. Die in vitro Prl-Sekretion wird durch Agnus castus-Extrakt im Vergleich zu den Kontrollinkubationen (in der Abbildung mit M = Medium dargestellt) signifikant inhibiert. In diese Kulturen wurde kein Agnus castus-Extrakt eingebracht und die 30 µl Testlösung durch Medium ersetzt. Damit wird in diesen Kulturen also die unbeeinflußte, basale Prl-Sekretion gemessen. Die Kompetition, die durch R5000 im D1- bzw. D2- Rezeptorassay gemessen wird, ist im Vergleich zur Standardkurve des jeweiligen Assays aufgetragen. Der Pfeil und die schwarze Markierung ergeben die gemessenen cpm-Werte und geben die wirkungsgleiche Konzentration von DA in dieser Standardkurve wieder.

Abb. 3

Vergleich der Effekte der Fraktionen I-VI der LH 20-Gelchromatographie auf die in vitro Prl-Sekretion und die Kompetitionsfähigkeit der Substanzen im D2-Rezeptorassay. Im oberen Teil der Graphik ist die Verdrängungsfähigkeit der Fraktionen im D2- Rezeptorassay wiedergegeben. Medium ohne dopaminerge Substanzen (= Kontrolle) ergibt keinerlei Verdrängung des D2-Liganden von den Bindungsstellen, während Inhaltsstoffe der Fraktionen I und V eine hochpotente Verdrängung des D2-Liganden bewirken, die einer Konzentration von 200 µmol DA entsprechen.

Die Inhaltsstoffe der Fraktionen I und V bewirken eine signifikante Inhibition der Prl- Sekretion im Vergleich zu den Kontrollinkubationen (in der Abbildung mit M = Medium) dargestellt. Die Konzentrationen in beiden Assays betrugen 3,3 mg/ml.

Abb. 1

Standardkurven mit DA und Apomorphin

Abb. 2

Oberer und mittlerer Teil der Graphik

Abb. 2

Abb. 3 unterer Teil

Prl-Sekretion in vitro

Werte in pg/tube bei 25 µl Volumen des 1 : 10 verdünnten Kulturüberstandes

Claims (1)

1. Verwendung von Extrakten der Pflanze Vitex Agnus castus zur Stimulation von Dopamin-Rezeptoren in Stammganglien und damit zur Behandlung des Parkinson-Syndroms.