DE4201988C2

DE4201988C2 - DNA-Sonde zur Identifizierung von Staphylococcus haemolyticus

Info

Publication number: DE4201988C2
Application number: DE4201988A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Prof Dr Dr Pulverer; Francoise Schumacher-Perdreau; Elena Akatova
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-01-25
Filing date: 1992-01-25
Publication date: 1994-03-03
Anticipated expiration: 2012-01-26
Also published as: DE4201988A1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die in den Ansprüchen 1 bis 6 angegebene DNA-Sonde zur Identifizierung von Staphylococcus haemolyticus, ein Verfahren zur Bestimmung von S. haemolyticus nach den Ansprüchen 7 bis 10 sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung von S. haemolyticus nach Anspruch 11.

Coagulase-negative Staphylokokken (CNS) gehören zu den am häufigsten vom klinischen Material isolierten Mikro organismen. Sie gehören zur normalen Flora der Haut und Schleimhäute und stellen eine der häufigsten allgemein verbreiteten Kontaminationen dar. In den letzten Jahren haben sich CNS als Primärpathogene herausgestellt, die für verschiedene Infektionen ursächlich sind (Archer, G.L. (1990) Staphylococcus epidermidis and other coagulase negative staphylococci (In: Principles and practice of infectious diseases, pp. 511 bis 1518 Mandell G.L., Douglas, R.G., Bennet J.E. (edts.), New York, Churchill Livingstone; Pulverer, G., Peters, G. and Schumacher- Perdreau, F.(1987) Coagulase-negative Staphylococci. Zbl. Bakt. Hyg. A, 264: 1 bis 28)). Darunter sind zu nennen Infektionen durch Implantate, Endophthalmitis nach Augen operationen, Endokarditis, Infektionen des Harntraktes und Bakterämien bei immungeschwächten Patienten. Dabei spielt die Species Staphylococcus haemolyticus in den CNS-Isolaten eine große Rolle, da diese Bakterienart etwa 10% des Anteils der CNS-Isolate ausmacht.

Die Bestimmung von Staphylococcus-Arten basierend auf biochemischen Untersuchungsmethoden wurde unter anderem von Kloos, W.E. und Schleifer, K.H. (1986) In: P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe and J.G. Holt (eds.), Bergey′s manual of systematic bacteriology, vol. 2, pp. 1013 bis 1035, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, beschrieben. Zur automatisierten Identifizierung in kli nischen Laboratorien sind weitreichende Identifikations systeme entwickelt worden. Jedoch ist die Identifizierung nah verwandter Stämme wie S. haemolyticus und S. hominis nicht sicher zu bewerkstelligen. Dies gilt auch für Tre halose-negative Isolate von S. haemolyticus, die als Phosphatase-negative S. epidermidi-Stämme in falscher Weise eingeordnet worden sind bei Verwendung des recht einfachen Schemas gemäß Kloos und Schleifer.

Eine sichere Bestimmung des kontaminierenden Bakteriums ist die genetische Chromosomen-Analyse (DNA/DNA- und DNA/RNA-Hybridisierung) wie auch die Analyse der Zell wandzusammensetzung. Diese Methoden sind jedoch sehr ar beitsaufwendig und für Routineverfahren kaum geeignet.

Das technische Problem der vorliegenden Erfindung besteht mithin darin, ein Instrumentarium zu schaffen, mit dem die Spezies S. haemolyticus sicher identifiziert werden kann und auch von nahe verwandten Bakterienstämmen unter schieden werden kann.

Erreicht wird dieses Ziel durch eine DNA-Sonde zur Iden tifizierung von Staphylococcus haemolyticus erhältlich durch Behandlung von chromosomaler DNA aus S. haemolyti cus mit Endonuklease Pst I.

Die DNA-Sonde besteht aus 900 bis 1500 Nukleotiden. Die mit Endonuklease Pst I gefundene DNA-Sonde besteht aus DNA mit einer Länge von ca. 1300 Nukleotiden. Die erfin dungsgemäße DNA-Sonde wird vorzugsweise nicht radioaktiv markiert, kann aber auch mit radioaktiven Isotopen wie ³²P markiert werden. Sofern die Sensitivität es erlaubt, können auch andere radioaktive Isotope oder auch Fluo reszenz-Marker verwendet werden. Es hat sich auch be währt, die DNA-Probe mit Digoxigenin-dUTP zu markieren, wobei AMPPD® als Chemilumineszenzsubstrat für das Anti digoxigenin-Alkalische Phosphatase-Konjugat verwendet wurde.

Die erfindungsgemäße DNA-Sonde kann nach der Gewinnung aus dem DNA-Extrakt von S. haemolyticus und Behandlung mit Endonuklease Pst I in entsprechende Vektoren einge baut werden zwecks Vervielfältigung. Als besonders ge eignet hat sich der Vektor pBR 322 erwiesen.

Das Verfahren zur Bestimmung von S. haemolyticus mittels der erfindungsgemäßen DNA-Sonde besteht darin, daß bakte rielle DNA aus der zu bestimmenden Probe isoliert wird. Dies kann eine Probe unterschiedlichster Provenienz sein. Die Bakterien werden vorzugsweise durch Behandlung mit einem Lysierungspuffer enthaltenden Detergenz wie SDS, Lysostaphin und eine Protease wie Proteinase K aufge schlossen. Gewünschtenfalls kann die Qualität und Konzen tration der DNA elektrophoretisch in einem Agarosegel untersucht werden. Die aus der zu untersuchenden Probe isolierte DNA kann gegebenenfalls auch mittels bekannter Methoden wie der Polymerase Chain Reaction (PCR) ampli fiziert werden, um genügend Material für Hybridisierungs experimente zu erhalten.

Die isolierte DNA wird dann mit der DNA-Sonde gemäß der Erfindung unter Hybridisierungsbedingungen behandelt. Vorzugsweise wird die isolierte DNA auf eine Nitrocellu lose-Membran überführt. Danach wird die Nitrocellulose schrittweise mit einem alkalischen Kochsalzpuffer, einem leicht alkalischen Trispuffer und danach einem Citrat puffer behandelt. Die Membran wird getrocknet und UV- Licht von 254 nm für eine bestimmte Zeit ausgesetzt. Da nach werden die Membranen vorhybridisiert in einem Ci tratpuffer und im gleichen Puffer für eine längere Zeit hybridisiert. Die Membranen werden gewaschen und dann untersucht. Falls die DNA-Sonde mit radioaktiven Isotopen markiert war, empfiehlt sich als Detektionssystem vor zugsweise die Autoradiographie.

Die erfindungsgemäße DNA-Sonde eignet sich in besonders einfacher Weise für die Routine-Analytik in mikrobiolo gischen Labors. Vorzugsweise wird die DNA-Sonde bereits in entsprechenden Kits, die neben der DNA-Sonde in mar kierter Form bereits Puffer für die entsprechenden Hybri disierungsbedingungen und Nitrocellulose-Membranen etc. enthalten können, angeboten.

Die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen DNA-Sonde und des erfindungsgemäßen Verfahrens wird verdeutlicht durch die Tatsache, daß 163 Stämme verschiedener Staphy lococcus-Arten mit der erfindungsgemäßen DNA-Sonde unter sucht wurden, wobei 26 dieser untersuchten Bakterien stämme durch Spezies-Referenz-Stämme charakterisiert waren. 42 Stämme von S. haemolyticus ergaben positive Signale mit der erfindungsgemäßen DNA-Sonde, während 121 der untersuchten Stämme, die zu anderen Staphylococcen- Arten gehörten, negativ ausfielen. Die DNA-Sonde zeigte 100% Spezifität und 100%ige Empfindlichkeit (im Vergleich zum ATB 32-Test).

Dabei stellte sich heraus, daß einer der Stämme, der zu nächst als Phosphatase negativer Staphylococcus epider midis Stamm identifiziert worden war (gemäß dem Bestim mungsschema von Kloos und Schleifer (Kloos, W.E. und Schleifer, K.H. (1975) Simplified scheme for routine identification of human species, J. Clin. Microbiol. 1: 82-88)), ebenfalls ein positives Signal ergab. Dieser Stamm wurde dann als Staphylococcus haemolyticus (ATB 32 Profil (26603461)) identifiziert.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:

26 Staphylococcen-Arten werden repräsentiert durch die folgenden Stämme:

S. haemolyticus DSM 20263; S. hominis DSM 20328; S. warneri DSM 20316; S. capitis DSM 20326; S. simulans DSM 20322; S. epidermidis DSM 20044; S. arlettae DSM 20672; S. cohnii DSM 20260; S. caprae DSM 20608; S. saprophyti cus DSM 20229; S. lentus DSM 20352, S. kloosii DSM 20676; S. schleiferi ATCC 43809; S. lugdunensis ATCC 43808; S. carnosus DSM 20501; S. caseolyticus DSM 20597; S. saccha rolyticus DSM 20359; S. equorum DSM 20674; S. auricularis DSM 20609; S. gallinarum DSM 20610; S. sciuri DSM 20345; S. xylosus DSM 20266; S. aureus DSM 20231; S. hyicus ssp. chromogenes DSM 20454; S. hyicus ssp. hyicus DSM 20459; S. intermedius DSM 20373 sowie zwei Sammlungsstämme S. haemolyticus DSM 20264 und 20265. 135 klinische Isolate waren repräsentiert durch S. haemolyticus (39), S. epi dermidis (35), S. hominis (21), S. warneri (16), S. capi tis (11), S. simulans (8), S. saprophyticus (1), S.aureus (4). Klinische Isolate wurden angezüchtet von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen: Infektion des Harntrakts, Sepsis aufgrund von Katheterinfektionen, Septikämie, Sepsis bei immungeschwächten Patienten. Die Stamm-Identi fikation wurde gemäß Kloos und Schleifer sowie dem ATB- 32-Testsystem durchgeführt. E. coli HB 101 kompetente Zellen wurden in den Klonierungsinstrumenten verwendet.

Beispiel 1 Präparationen der DNA zur Klonierung

Chromosomale DNA von S. haemolyticus DSM 20264 wurde ge reinigt. Der Stamm wurde in 100 ml BM-Nährmedium mit 0,3% Glycin gezüchtet. Die Zellen wurden in TES-Puffer gewaschen (10 mM Tris pH 8,0, l mM EDTA, 100 mM NaCl) und resuspendiert in 10 ml TE-Puffer (10 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA). Danach wurden 50 µl Lysostaphin (10 mg/ml) zugegeben. Die Suspension wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Das Lysat wurde dann mit 0,5% (w/v) SDS (Natriumdodecylsulfat) und 100 µg/ml Proteinase K für eine Stunde bei 65°C behandelt. Die Proteine wurden denaturiert und durch schrittweise Extraktion mit glei chen Volumina Phenol (zweimal), Phenol/Chloroform/Iso amylalkohol (25:24: lv/v/v) und Chloroform/Isoamylalkohol (24:lv/v) extrahiert. Die DNA wurde mit RNA-se bei einer Konzentration von 100 µg/ml bei 37°C für eine Zeit von 30 Minuten behandelt. Die Präparation wurde weiterhin gereinigt mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:lv/v) und über Nacht gegen 2 l TE-Puffer dialysiert. Die DNA wurde mit 0,54 Vol 2-Propanol präzipitiert und des weiteren mit 2 Volumina Ethanol repräzipitiert, in 70%ige (v/v) Ethanol gewaschen, getrocknet und in destilliertem Wasser gelöst.

Beispiel 2 Präparation der DNA für dot blot Hybridisierung

Die Stämme wurden auf Blutagarplatten gezüchtet. Bakte rienmaterial wurde in 300 µl eines Lysierungspuffers, enthaltend 200 µg/ml Lysostaphin, suspendiert. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurden 16 µl auf einer 20%igen SDS und 8 µl einer 10 mg/ml Proteinase K enthaltenden Lösung hinzugefügt und das Lysat für eine Zeitdauer von einer Stunde bei 65°C inkubiert. Die DNA wurde gereinigt mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:lv/v), präzipitiert mit dem gleichen Volumen 2-Pro panol und in 30 µl TE-Puffer gelöst. Die Qualität und Konzentration der DNA wurde in 0,6% Agarosegel über prüft.

Beispiel 3 Klonierung der DNA Probe

Chromosomale DNA von S. haemolyticus DSM 20264 wurden mit Endonuklease Pst I verdaut und ligiert mit dem Pst I geschnittenen und Phosphatase-behandeltem Vektor pBR322. Kompetente Zellen des E. coli HB 101 wurden mit der legierten Mischung transformiert und auf LB-Agar platten (mit 15 µg/ml Tetracyclin) plattiert. Die re kombinanten Plasmide wurden aus den transformierten Zellen isoliert mit Pst I verdaut und in 0,6%igem Agarosegel überprüft. Für weitere Untersuchungen wurde ein DNA-Fragment in einer molekularen Länge von 1,3 kb verwendet. Dieses DNA-Fragment wurde untersucht gemäß der Methode von Arrand, J. E. (1985) In: Nucleic acid hybri dization: a practical approach, pp. 24 bis 26, IRL Press Ltd. Oxford. Dieses Fragment wies keine repetitiven Se quenzen auf, die unspezifisch mit zu untersuchender DNA kreuz-hybridisieren könnten.

Beispiel 4 Präparation der klonierten DNA-Sonde

Das für S. haemolyticus spezifische DNA-Fragment von 1,3 kb Länge, das durch Pst I-Behandlung des rekombi nanten Plasmids gemäß Beispiel 3 erzeugt worden war, wurde vom Vektor-Fragment abgetrennt durch Elektrophorese in 0,7%igem Agarosegel und durch Elektroelution und Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt. Die DNA-Sonde wurde mit Digoxigenin-dUTP mar kiert.

Beispiel 5 Dot blot Hybridisierung

Annähernd 2,0 µg der jeweiligen zu untersuchenden DNA- Probe wurde auf eine Nitrocellulose-Membran gebracht. Die Nitrocellulose-Membran wurde dann behandelt nacheinander mit: 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl (5 min); 0,5 M Tris pH 7,5, 1,5 M NaCl (5 min); 6×SSC (1×SSC:0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) für 5 min, getrocknet und UV-Licht mit einer Wellenlänge von 254 nm für eine Zeitdauer von 5 min ausgesetzt. Die Membranen wurden vorhybridisiert für eine Zeit von 2 Stunden bei 42°C und für weitere 18 Stunden bei der gleichen Tempe ratur hybridisiert. Die Hybridisierung wurde in der glei chen Lösung, enthaltend 5×SSC, 50% Formamid, 0,1% N-Laurylsarkosin, 0,02% SDS, 5% Blockierungsreagenzien, durchgeführt. Die Membranen wurden anschließend zweimal für 10 min in SSC, 0,1% SDS-Puffer gewaschen bei Raum temperatur und zweimal für eine Zeitdauer von 10 min in 0,1×SSC, 0,1% SDS bei 65°C. Die Membranen wurden wei terhin gemäß der Spezifikationen des Herstellers behandelt. Digoxigening-markierte DNA-Probe wurde mit AMPPD® als Chemilumineszenzsubstrat für das Anti-Digoxigenin-Alka lische Phosphatase-Konjugat gekoppelt. Die Hybridisierung der Sonde mit der zu untersuchenden DNA wurde mittels Autoradiographie geprüft. Als positives Resultat wurde jedes Signal gewertet, das nach 3- bis 4stündiger Be lichtungszeit des Films eine entwickelbare Schwärzung hervorrief.

Claims

1. DNA-Sonde zur Identifizierung von Staphylococcus haemolyticus erhältlich durch Behandlung von chromo somaler DNA aus S. haemolyticus mit Endonuklease Pst I.

2. DNA-Sonde nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde aus DNA mit einer Länge von 900 bis 1500 Nukleotiden besteht.

3. DNA-Sonde nach Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß die DNA eine Länge von ca. 1300 Nukleotiden aufweist.

4. DNA-Sonde nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz mit üblichen Tracern wie Digoxigenin oder radioaktiven Isotopen markiert ist.

5. DNA-Sonde nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sonde in einem Vektor eingebaut ist.

6. DNA-Sonde nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sonde in den Vektor pBR 322 eingebaut ist.

7. Verfahren zur Bestimmung von S. haemolyticus mittels einer DNA-Sonde gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei zunächst bakterielle DNA aus der zu bestimmenden Probe isoliert wird, die DNA-Sonde nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 mit der zu untersuchenden Probe inkubiert und danach mit Puffer lösungen gewaschen wird und das Hybridisierungsergeb nis festgestellt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung im dot-blot-Verfahren an Nitrocellulose-Membranen durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekenn zeichnet, daß die Identifizierung mittels Autoradio graphie erfolgt.

10. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die bakterielle DNA durch Aufschluß der aus der Probe stammenden Bakte rien oder durch eventuelle Amplifizierung der DNA hergestellt wird.

11. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach minde stens einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß das Mittel eine Zusammenstellung von Puffern, Hilfsmitteln und der Sonde nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.