DE4140003A1

DE4140003A1 - Gentechnisch hergestellte glutaminase und ihre verwendung bei der antiviralen und anti-krebstherapie

Info

Publication number: DE4140003A1
Application number: DE4140003A
Authority: DE
Inventors: Joseph Prof. Dr. Columbia S.C. Us Roberts
Original assignee: Joseph Prof. Dr. Columbia S.C. Us Roberts
Current assignee: ROBERTS, JOSEPH, PROF. DR., COLUMBIA, S.C., US ME
Priority date: 1991-12-04
Filing date: 1991-12-04
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2011-12-05
Also published as: DE4140003C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA mit einer Basensequenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutami nase, ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase be sitzt, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung bei der antiviralen und Anti-Krebstherapie.

Die Verwendung von Glutaminase, um Glutamin in Tumor-tra genden Wirten zu entleeren, stellt ein attraktives Grund prinzip zur Bekämpfung von Krebszellen dar. Glutamin nimmt eine wichtige Rolle in der Biosynthese einer großen Anzahl zellulärer Metaboliten ein. Es wurde gezeigt, daß im Ver gleich mit normalen Geweben einige Neoplasmen mit einer maximalen Konzentration an Glutaminverfügbarkeit leben, weil die Synthese herabgesetzt und der Verbrauch erhöht ist (Levintow L. (1954): J. Natl. Cancer Inst. 15: 347-352; Roberts E. und Simonsen D.G. (1960): Amino Acids, Proteins and Cancer Biochemistry (J.T. Edsall, Herausg.), Academic Press, New York, N.Y., S. 121-145; Weber G. (1983): Cancer Res. 43: 3466-3492; Sebolt J.S. und Weber G. (1984): Life Sci. 34: 301-306). Versuche zeigten eine negative Korrela tion zwischen dem Glutamingehalt und der Wachstumsrate von transplantierten Rattenhepatomen. Die in-vivo-Konzentration an Glutamin im Hepatom 3924A erwies sich als 9fach niedri ger (0,5 mM) als in Leber (4,5 mM) und niedriger als in irgendeinem anderen Gewebe der Ratte (2 bis 5 mM) (Weber G. (1983): Cancer Res. 43: 3466-3492). In den vergangenen Jah ren häuften sich Daten, die anzeigten, daß Glutamin eine wichtige Energiequelle für die zelluläre Energie bei einer Vielzahl von Neoplasmen einschließlich hämatopoetischen Tumoren, Hepatomen, Ehrlich-Karzinom und HeLa-Zellen ist (Abou-Khalil W.F., Yunis A.A. und Abou Khalil S. (1983): Cancer Res. 43: 1990-1993; Kovacevic Z. und Morris H.P. (1972): J. Biol. Chem. 33: 326-333; Kovacevic Z. (1971): Biochem. J. 125: 757-763; Reitzer L.J., Wice B.M., Kennell D. (1979): J. Biol. Chem. 254: 2669-2676).

L-Asparaginase, das erste Enzym, das intensiver als Anti- Tumormittel bei Menschen untersucht wurde, ist hochwirksam bei der Behandlung der akuten lymphoplastischen Leukämie. Dieses Enzym besitzt jedoch geringe oder keine Aktivität gegen irgendwelche anderen Neoplasmen beim Menschen. Das Enzym Glutaminase scheint eine viel breitere potentielle Nützlichkeit bei der Krebstherapie als Asparaginase zu be sitzen.

Verschiedene Glutaminase- und Glutaminase-Asparaginase- Enzyme von Säugern und Mikroorganismen wurden gereinigt und charakterisiert. Davon scheint Pseudomonas 7A-Glutaminase- Asparaginase wegen ihres niedrigen K_m-Werts für Glutamin (Mikromolar-Bereich), ihrer guten Stabilität und Aktivität in physiologischem Milieu und einer langen Halbwertszeit in Plasma bei Tumor-tragenden Wirten für die therapeutische Verwendung am besten geeignet zu sein (Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 2119-2123; und Roberts J., Schmid F.A. und Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054).

Die bekannten Glutaminaseenzyme von Säugern sind für die Verwendung als therapeutische Mittel wegen ihrer hohen K_m- Werte (Millimolar-Bereich) und ihres Erfordernisses nach Phosphatestern oder Malat zur Aktivierung als therapeuti sche Mittel nicht geeignet. Die E. coli-Glutaminasen (A und B) sind ebenfalls wegen ihrer hohen K_m-Werte (Millimolar- Bereich), niedrigen Aktivität bei physiologischem pH (Glutaminase A) oder des Erfordernisses nach speziellen aktivierenden Substanzen (Glutaminase B) für therapeutische Zwecke nicht geeignet.

Pseudomonas 7A-Glutaminase-Asparaginase setzt sich aus vier identischen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von etwa 35 000 zusammen. Sedimentationsstudien mit dem aktiven Enzym zeigten, daß die katalytische Aktivität im Tetramer liegt; keine kleineren aktiven Spezies wurden beobachtet (Holcenberg J.S., Teller D.C. und Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 5375-5380). Das gereinigte Enzym besitzt ein Verhältnis von Glutaminase- zu Asparaginaseaktivität von etwa 2:1. Bindungsstudien mit C¹⁴-markierten Glutamin- Analoga (6-Diazo-5-oxo-L-norleucin; DON) und Asparagin (6-Diazo-5-oxo-L-norvalin; DONV) legten nahe, daß die bei den Analoga bevorzugt mit Hydroxylgruppen an verschiedenen Stellen des Proteins reagieren und daß die beiden Bindungs stellen kooperativ als Teil des aktiven Zentrums wirken (Holcenberg J.S., Ericsson L. und Roberts J. (1978): Bio chemistry 17: 411-417). Es wurde gezeigt, daß Pseudomonas 7A-Glutaminase-Asparaginase eine beträchtliche antineopla stische Aktivität gegen eine Vielzahl von Leukämien bei Nagern (L1210, C1498, EARAD/1), Ascites-Tumoren (Taper- Leber, Ehrlich-Karzinom, Meth-A-Sarcom, S 180) und bestimm te feste Tumore (Carinosarcom Walker 256, B16-Melanom) be sitzt. Zusätzlich wurde gefunden, daß der Antagonismus von Glutamin durch Glutamin-Analoga und Glutaminase stark inhi bierend auf menschliche Kolon-, Brust- und Lungenkarzinome, die in athymischen Mäusen wachsen, wirkt (McGregor W. und Roberts J. (1989): Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 30, 578; Robert J., Schmid F.A. und Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054; Ovejera A.A., Houchens D.P., Catane R., Sheridan M.A. und Muggia F.M. (1979): Cancer Res. 39: 3220-3224; Houchens D.P., Ovejera A.A., Sheridan M.A., Johnson R.K., Bogden A.E. und Neil G.L. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 473-476; Duvall L.R. (1960): Cancer Chemother. Rep. 7: 86-98).

Ein wichtiges Charakteristikum der Glutaminasetherapie ist die Tatsache, daß sich nach wiederholten Behandlungen mit diesem Enzym keine resistenten Stämme entwickeln (Roberts J., Schmid F.A. und Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054). Es wurde ebenfalls gezeigt, daß die Be handlung mit Glutaminase die Resistenzbildung gegen Metho trexat (Roberts J., Schmid F.A. und Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054) verzögert.

Es wurde gezeigt, daß eine bioaktive Glutaminase-Asparagi nase retrovirale Erkrankungen bei Mäusen inhibiert. Die Glutaminentleerung inhibiert stark die Replikation des Rauscher-Mäuseleukämie-Retrovirus (RLV) in vitro. Pseudomo nas 7A-Glutaminase-Asparaginase (PGA), die in der Lage ist, Glutamin und Asparagin für längere Zeitspannen zu entlee ren, wurde verwendet, um die therpeutische Wirksamkeit der Glutaminentleerung bei mit RLV oder dem Friend-Virus infi zierten Mäusen zu bestimmen. Während der PGA-Behandlung von virämischen Tieren fiel die Aktivität der reversen Trans kriptase im Serum auf Kontrollspiegel, und die infizierten Tiere entwickelten keine Splenomegalie. Die therapeutischen Ergebnisse, die mit PGA erhalten wurden, zeigten einen gün stigen Vergleich mit den Ergebnissen, die mit intraperito neal in einer Dosierung von 30 mg/kg/Tag verabreichtem Azi dothymidin erhalten wurden (Robert J. und McGregor W. (1991): Journal of General Virology, 72, 299-305).

Gegenwärtig sind keine therapeutisch nützlichen Glutamina sen verfügbar, die billig und mit geringer oder keiner Kontamination durch andere Substanzen, beispielsweise durch Endotoxine eines Wirts-Mikroorganismus, erzeugt werden kön nen. Ferner sind keine therpeutisch nützlichen Glutaminasen verfügbar, denen die Asparaginaseaktivität fehlt und die ein niedrigeres Molekulargewicht als das native Enzym be sitzen und die somit in den behandelten Tieren oder Men schen weiter verteilt werden können und mit geringeren immunogenen Problemen verbunden sind. Ferner steht ein geeignetes Enzym in Mengen, die groß genug für eine weit angelegte klinische Erprobung sind, nicht zur Verfügung.

Folglich ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die obigen Nachteile zu überwinden und die Gentechnik zu ver wenden, um eine therapeutisch geeignete Glutaminase mit verbesserter und vergrößerter therapeutischer Wirksamkeit bereitzustellen. Weiterhin soll erfindungsgemäß eine thera peutisch geeignete Glutaminase bereitgestellt werden, die klein genug ist, um eine verbesserte Durchdringbarkeit von Tumoren und Virus-infizierten Geweben, die im extravaskulä ren Bereich liegen, zu ermöglichen. Weiterhin soll erfin dungsgemäß eine therapeutisch geeignete Glutaminase zur Verfügung gestellt werden, die keine Asparaginaseaktivität besitzt. Weiterhin soll erfindungsgemäß eine therapeutisch nützliche Glutaminase bereitgestellt werden, die die wirk same Behandlung viraler Infektionen ermöglicht und die von Verunreinigungen frei ist.

Erfindungsgemäß wird somit eine DNA mit einer Basensequenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert, sowie ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase be sitzt, bereitgestellt. Zusätzlich wird ein Expressionsvek tor, der eine Basensequenz, die für eine therapeutisch ge eignete Glutaminase codiert, umfaßt, bereitgestellt.

Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung einer DNA mit einer Basensequenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert, bereitgestellt, das dadurch gekenn zeichnet ist, daß man (a) chromosomale DNA, die aus mikro biellen, tierischen oder pflanzlichen Zellen mit Sau3A oder einem anderen geeigneten Restriktionsenzym isoliert worden ist, teilabbaut; (b) eine genomische Bank aus der Fraktion gemäß (a) herstellt; (c) die genomische Bank mit bekannten Oligonucleotid-Sonden, deren Sequenzen entweder dem Amino- Terminus oder dem Carboxyl-Terminus oder dem Mittelteil einer bekannten Glutaminase entsprechen, absucht; (d) ein Plasmid gewinnt, das gleichzeitig mit der Oligonucleotid- Sonde des Amino-Terminus, des Mittelteils und des Carboxyl- Terminus der Glutaminase hybridisiert; (e) das rekombinante Plasmid in einen Expressionsvektor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors inseriert; und (f) den rekom binanten Vektor in einen Wirt zu dessen Transformation ein führt. Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase besitzt, bereit gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) chro mosomale DNA, die aus mikrobiellen, tierischen oder pflanz lichen Zellen mit Sau3A oder einem anderen geeigneten Restriktionsenzym isoliert worden ist, teilabbaut; (b) eine genomische Bank aus der Fraktion gemäß (a) herstellt; (c) die genomische Bank mit bekannten Oligonucleotid-Sonden, deren Sequenzen entweder dem Amino-Terminus oder dem Carb oxyl-Terminus oder dem Mittelteil einer bekannten Glutami nase entsprechen, absucht; (d) ein Plasmid gewinnt, das gleichzeitig mit der Oligonucleotid-Sonde des Amino-Termi nus, des Mittelteils und des Carboxyl-Terminus der Glutami nase hybridisiert; (e) das rekombinante Plasmid in einen Expressionsvektor unter der Kontrolle eines geeigneten Pro motors inseriert; (f) den rekombinanten Vektor in einen Wirt zu dessen Transformation einführt; (g) den Transfor manten kultiviert; und (h) das entstandene Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die die Aktivität einer therapeu tisch geeigneten Glutaminase besitzt, gewinnt.

Die Klonierung und Expression des Gens, das für Pseudomonas 7A-Glutaminase-Asparaginase in E. coli codiert, erhöht den Gehalt an Glutaminase in der Zelle um mindestens das 10fache und die bakterielle Masse/l-Kultur um das 3- bis 5fache. Dies reduziert deutlich die Produktionskosten von Glutaminase und ermöglicht eine größer angelegte klinische Erprobung. Zusätzlich kann durch Erzeugung der Glutaminase in E. coli die Kontamination des Anti-Tumor-Arzneimittels durch das hochtoxische Pseudomonas-Endotoxin vermieden wer den. Ferner gestattet die Reduktion der Größe der aktiven Glutaminase eine weitere Verteilung des Enzyms in dem extravaskulären Raum und führt so zu einer größeren thera peutischen Wirksamkeit gegen feste Tumore.

Die vorliegende Erfindung eröffnet die Möglichkeit, eine Asparaginase-freie Glutaminase zu erhalten, die therapeuti sche Vorteile gegenüber Glutaminase-Asparaginase-Enzymprä paraten haben kann, da L-Asparaginase als kompetitiver Inhibitor des Glutaminabbaus dient. Die Eliminierung der Asparaginaseaktivität von diesem Enzym verringert auch die Toxizität für den Wirt. Es gibt gegenwärtig keine therapeu tisch nützlichen Glutaminasen, denen die Asparaginaseakti vität fehlt.

Ferner zeigt die vorliegende Erfindung, daß die Wirksamkeit von Glutaminase gegen eine Neoplasie erhöht werden kann, wenn Glutaminase an einen monoklonalen Antikörper, der für die zu behandelnde Neoplasie spezifisch ist, geheftet wird. Ferner kann ein Glutaminase-Antimetabolit mit Vorteil mit der erfindungsgemäßen Glutaminase bei der Behandlung von Krebs verwendet werden. Zusätzlich wurde die Wirksamkeit von Glutaminase gegen das Human Immunodeficiency Virus nachgewiesen.

Ferner wird erfindungsgemäß zum ersten Mal die DNA-Sequenz einer therapeutisch nützlichen Glutaminase bereitgestellt.

Schließlich ermöglicht die Sequenzierung des Gens der bak teriellen Glutaminase die Isolierung weiterer therapeutisch nützlicher Glutaminasen aus menschlichen Geweben oder Kör perflüssigkeiten.

Im folgenden wird das modifizierte Glutaminase-Asparagi nase-Enzym mit Asparaginaseaktivität oder mit verminderter oder fehlender Asparaginaseaktivität als Glutaminase be zeichnet.

Der Ausdruck "therapeutisch geeignet" im Zusammenhang mit den Enzymen zur spezifischen Entleerung einer Aminosäure bezeichnet Enzyme mit den folgenden Eigenschaften:

1. Hohe Aktivität und Stabilität bei physiologischem pH- Wert.
2. Beibehaltung der hohen Aktivität und Stabilität in Seren und Blut von Tieren und Menschen.
3. Langsame Clearance aus dem Kreislauf bei Injektion in die Tiere oder Menschen.
4. Keine Inhibierung durch ihre Produkte oder andere Bestandteile, die normalerweise in Körperflüssigkeiten vorkommen.
5. Kein Erfordernis nach Cofaktoren oder prosthetischen Gruppen, die leicht vom Enzym abdissoziieren können.
6. Niedriger K_m-Wert (im Bereich von 10^-6 bis 10^-4 M) und enge Substratspezifität.
7. Effektive Irreversibilität der enzymatischen Reaktion unter physiologischen Bedingungen.
8. Verfügbarkeit aus einem Organismus, der niedrige Gehalte an Endotoxin besitzt.
9. Niedrige Immunogenizität.

Eine Anzahl von Aminosäure-abbauenden Enzymen, die keine Anti-Tumoraktivität zeigen, sind ebenfalls nicht in der Lage, irgendeines der obigen Kriterien zu erfüllen. Bei spielsweise besitzt E. coli-Glutaminase ein pH-Optimum von 5 und im wesentlichen keine Aktivität bei physiologischem pH. Eine ineffektive Form der E. coli-Asparaginase besitzt einen K_m über 1 mM. Asparaginaseenzyme aus Hefe, Bacillus coagulans und Fusarium tricinctum besitzen alle sehr hohe Clearanceraten bei Mäusen.

Mittels Oligonucleotid- und Deletionsmutagenese wird ein Enzym erhalten, das ausschließlich Glutaminase ist und das so klein ist, daß eine verbesserte Durchdringbarkeit von Tumoren und Virus-infiziertem Gewebe im extravaskulären Raum erhalten wird. Dabei kann die DNA gemäß Beispiel 1 verwendet werden. Mittels Analyse der Aminosäuresequenz (abgeleitet von der Nucleotidsequenz) und aus röntgenkri stallographischen Daten wurden Regionen des Glutaminasepro teins identifiziert, die für die Katalyse oder strukturelle Integrität nicht benötigt werden, und sie wurden auf der DNA-Ebene durch Deletion der relevanten Nucleotidsequenzen deletiert.

Die Inaktivierung der Asparagin-Bindungsstelle von PGA wird erreicht, da Bindungsstudien mit Glutamin und Asparagin- Analoga DON bzw. DONV zeigen, daß die Glutamin- und Aspara ginstellen nicht identisch sind, obwohl sie räumlich dicht beieinander angeordnet sind. DON bindet irreversibel an das Threonin der Aminosäure 20, wohingegen DONV an einen Threo nin- oder Serinrest in einer anderen Region des Proteins zu binden scheint. Die entsprechende ortsspezifische Mutage nese der klonierten DNA kann nach Standardtechniken durch geführt werden (Molecular Cloning, a laboratory manual - Sambrook et al. - Buch 2, 2. Ausgabe, 1989, S. 15.80- 14.113, Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA).

Gewebskultur-Experimente mit Pseudomonas 7A-Glutaminase (PGA) zeigten, daß dieses Enzym stark die Replikation des Human Immunodeficiency Virus (HIV), das in den empfängli chen Human-T-Zellen H9 wächst, inhibiert. Die Anwesenheit von 0,4 µg PGA/ml-Kulturmedium verursachte in der Tat eine 10%ige Inhibierung der viralen Replikation, und 0,016 µg pro ml verursachte eine 50%ige Inhibition. Eine viel grö ßere Konzentration an PGA (50 µg/ml) war erforderlich, um eine bemerkbare Toxizität gegenüber den menschlichen Wirts zellen H9 hervorzurufen. Die Gewebskultur-Experimente wur den mit dem HIV-I-Virus durchgeführt, aber andere Varianten können ebenfalls inhibiert werden.

Die Ergebnisse des Gewebskultur-Experiments zeigen, daß PGA viel toxischer gegenüber HIV als gegenüber den menschlichen Wirtszellen ist, und es wird erwartet, daß PGA einen größe ren therapeutischen Index bei Verabreichung an HIV-infi zierte Patienten zeigen wird.

Ferner erwies sich PGA in Kombination mit dem Glutamin- Antimetabolit DON als besonders erfolgreich bei der Behand lung von Lungen-, Brust- oder Kolonkrebs (McGregor W. und Roberts J. (1989): Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 30, 578).

Die DNA mit einer Basensequenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase oder das entsprechende Polypeptid codiert, kann aus jeder beliebigen mikrobiellen, tierischen oder Pflanzenzelle unter Verwendung von Oligonucleotid-Son den, die gemäß den bekannten Glutaminase-Proteinsequenzen hergestellt wurden, isoliert werden. Bevorzugt wird die DNA aus Pseudomonas 7A-Zellen isoliert. Es ist jedoch zu ver stehen, daß die Verfahren und die Bedingungen bei den ein zelnen Verfahrensstufen, die im folgenden näher erläutert werden, nach dem Stand der Technik gut bekannt sind, und daß die erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf diese spe ziellen Verfahren beschränkt sind.

Die Erfindung wird anhand der beigefügten Figuren näher er läutert. Es bedeuten:

Fig. 1 die Nucleotid- und Peptidsequenz des N-Terminus des Gens für Pseudomonas 7A-Glutaminase,

Fig. 2 das Vorgehen bei der Konstruktion des Plasmids zur Expression der Pseudomonas 7A-Glutaminase,

Fig. 3 die Restriktionskarte des zur Expression in Escherichia coli geänderten Pseudomonas 7A-Glutaminase gens und

Fig. 4 das Induktionsprofil der PGA-Expression.

Beispiel 1 Identifizierung des Klons, der die Sequenz, die für Pseudomonas 7A-Glutaminase codiert, enthält

Chromosomale DNA wurde aus Pseudomonas 7A (ein aus dem Boden isolierter Organismus, der bei der American Type Cul ture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 29598 hinterlegt wurde), im wesentlichen wie beschrieben (Strom M. und Lory S. (1986): J. Bacteriol. 165: 367-372), isoliert und wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A teilabgebaut. Fragmente dieses Abbaus mit durchschnittlich 5-10 Kbp wur den mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert und in die BamHI-Schnittstelle des Vektors pBR322 kloniert. Die entstandene Genbank (in E. coli-Stamm LE392) wurde unter Verwendung gemischter Oligonucleotid-Sonden abgesucht (Wallace R.B., Johnson M.J., Hirose T., Miyake T., Kawa shima E.H. und Itakura K. (1981): Nucleic Acids Res. 9: 879- 89; und Paddock G.V. (1987): Biotechniques 5: 13-16). Es wurde die Information über die Peptid-Teilsequenz erhalten und verwendet, um die drei in Tabelle 1 gezeigten Oligo nucleotid-Sonden abzuleiten. Die Oligonucleotid-Sonden wur den für die Peptidsequenz des Amino-Terminus des Enzyms (Sonde A), des Carboxyl-Terminus (Sonde C) und für ein Pep tid in der Nähe der Mitte des Proteins (Sonde B) ausge wählt. Sonde B wurde von dem anfänglichen Absuchen von 3560 Ampicillin-resistenten Transformanten ausgewählt. Ausgehend von dem anfänglichen Absuchen wurden zwei Hybridisations positive Klone identifiziert. Diese wurden unter Verwendung der Sonden A und C nochmals abgesucht. Beide Klone hybridi sierten mit Sonde A, aber nur einer der Klone, pKD2, hybri disierte mit Sonde C. Weil pKD2 mit allen drei Sonden hybridisiert hatte, wurde er für die weitere Analyse ausge wählt.

Rohe Zellextrakte des Stammes LE392, der mit dem Plasmid pKD2 transformiert worden war, wurden dadurch hergestellt, daß man Aliquote einer Übernachtkultur in einer French Pressure Cell aufbrach und das Homogenat bei 15 000 UpM zur Entfernung nichtaufgebrochener Zellen und Zelltrümmer zen trifugierte. Der entstandene Überstand wurde auf die Gluta minaseaktivität durch direkte Analyse mittels Nessler′s Reagens auf Ammoniak untersucht (Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 2119-2123). Um die störende Aktivität bei der E. coli-Glutaminaseenzyme zu minimieren, wurde der Enzymassay bei pH 8,0 unter Verwendung von D-Glutamin als Substrat durchgeführt. Keines der beiden E. coli-Enzyme ist unter diesen Bedingungen aktiv, während die Pseudmonas 7A- Glutaminase (PGA) 87% ihrer Aktivität behält (Pruisner S., Davis J.N., Stadtman E.R. (1976): J. Biol. Chem. 251: 3447- 3456; und Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 2119-2123). Kontrollversuche mit rohen Zellextrakten bestätigten die Wirksamkeit dieses Assays, um die PGA-Aktivität in Abwesen heit der E. coli-Glutaminaseaktivität zu messen.

Oligonucleotid-Sonden, die für die Detektion des Glutaminase-Gens verwendet wurden
Peptidsequenz (1-5)
NH₂-Lys-Glu-Val-Glu-Asn
Sonde A (14-mer × 32)
AA(AG)GA(AG)GT(TCAG)GA(AG)AA
Peptidsequenz (156-161)	Met-Asn-Asp-Glu-Ile-Glu @	Sonde B (18-mer × 48)	ATGAA(TC)GA(TC)GA(AG)AT(TCA)GA(AG) @	Peptidsequenz (325-329)	Ile-Phe-Trp-Glu-Tyr-COOH @	Sonde C (14-mer × 12)	AT(TCA)TT(TC)TGGGA(AG)TA

Um die Identität des vermutlichen PGA-Klons zu bestätigen, wurde die homologe Region der zum Absuchen verwendeten Son den mittels Southern Blot-Analyse lokalisiert, und geeig nete Fragmente wurden teilsequenziert. Diese Analyse iden tifizierte ein 1,1 Kbp SalI-Fragment, das mit Sonde A hybridisierte, und ein 1,5 Kbp SalI-Fragment, das mit Sonde B hybridisierte. Dies zeigte an, daß es eine SalI-Schnitt stelle im Gen gab und daß die Sequenzierung von dieser Sequenz aus unmittelbar die Identität des Gens als PGA durch Vergleich der Nucleotidsequenz mit der bekannten Ami nosäuresequenz bestätigen würde. Die zwei SalI-Fragmente wurden somit in M13mp8 kloniert und mittels des Kettenter minationsverfahrens nach Sanger sequenziert (Sanger F., Nicklen S. und Coulson A.R. 1977): Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Es wurde gefunden, daß das 1,1 Kbp SalI- Fragment für das N-terminale, 42 Aminosäuren lange Ende des reifen Proteins codiert, und eine 23 Aminosäuren lange mög liche Signalsequenz wurde identifiziert, der eine potenti elle Ribosomen-Bindungsstelle folgt. Die erhaltenen Se quenzdaten sind in Fig. 1 dargestellt. Die Aminosäurereste, die sich von der bekannten Peptidsequenz-Information unter scheiden, sind unterstrichen. Die in Fig. 1 dargestellte Sequenz ist von dem N-terminalen Lysin des reifen Proteins aus gezählt - die vermutliche Sekretions-Signalsequenz ist nicht gezeigt. Auf der Basis dieser Sequenz-Information wurde gefolgert, daß das PGA-Gen kloniert worden war.

Expression des Gens für die Pseudomonas 7A-Glutaminase

Um kontrollierte Expression des klonierten PGA-Gens in hoher Konzentration zu erhalten, wurde beschlossen, den Pseudomonas-Promotor durch den, der in E. coli erkannt wird, zu ersetzen. Das Gen wurde an den Lambda-Phagen P_L- Promotor ligasiert, der nur bei ausreichend hoher Tempera tur (beispielsweise 37 bis 40°C) die Funktion, den Lambda- cI-Repressor zu unterdrücken, zeigt. Promotoren, die in gleicher Weise verwendet werden können, umfassen beispiels weise den tac-Promotor (ein hybrider lac-Promotor) und das T7-RNA-Polymerase/Promotor-System (Molecular Cloning - A laboratory manual, 2. Ausgabe, Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Buch 3, S. 17.2-17.44). Zu dieser Konstruktion wurde pPL322 verwendet. Dies ist ein Expressionsvektor, in den der Lambda-PL-Promo tor in die EcoRI- und HindIII-Schnittstellen von pBR322 inseriert sind. Dieser Vektor plaziert jedes Strukturgen, das die korrekten Translationssignale enthält, unter die Kontrolle des Lambda-P_L-Promotors, wenn das Gen in die HindIII-Restriktions-Schnittstelle in korrekter Orientie rung ligasiert wird. Zur Verwendung dieses Vektors sind zwei Lambda-Lysogene erforderlich, N99cI+, welches das Wildtyp-cI-Repressorgen trägt und die Expression negativ reguliert, und N4830, das das temperaturempfindliche cI857- Allel des Repressorgens trägt. Somit tritt, wenn ein Expressionsvektor in dem Stamm N4830 bei 28°C gezüchtet wird, keine Expression eines Gens unter der Kontrolle des Lambda-P_L-Promotors ein, aber nach Verschiebung auf 37°C beginnt die Lambda-regulierte Expression. Zusätzlich zur Verwendung des Lambda-P_L-Expressionssystems wurde beschlos sen, das reife Protein zu exprimieren, anstatt sich darauf zu verlassen, daß das Protein in E. coli unter Verwendung des Pseudomonas-Sekretionssignals korrekt weiterverarbeitet und sezerniert wird.

Das entstandene Plasmid wurde, wie unten beschrieben und in Fig. 2 näher erläutert, konstruiert. Das 1,1 Kbp SalI-Frag ment, das für die Amino-terminalen 42 Aminsoäuren des PGA- Gens codiert, wurde einer Oligonucleotid-Mutagenese unter Verwendung der Technik von Zoller und Smith (Zoller M.J. und Smith M. (1983): Methods Enzymol. 100: 468-685) unter worfen. Eine einzige EcoRI-Schnittstelle wurde unmittelbar stromaufwärts des für das N-terminale Lysin codierenden Tripletts unter Verwendung eines Oligonucleotids mit fünf Fehlpaarungen erzeugt. Dieses Schema wurde so entwickelt, daß Ligasierung einer im Handel erhältlichen "tragbaren Translations-Initiations-Stelle" (PTIS - Pharmacia, Inc.) in die entstandene EcoRI-Schnittstelle möglich war, so daß das benötigte Start-f-Methionin translationell in dem kor rekten Leseraster war. Die entstandene N-terminale Sequenz des gebildeten Proteins lautete dann wie folgt: met-asn- ser-lys-glu-val. Somit wurden also Asparagin- und Serin reste dem reifen Protein zusätzlich zu dem Methionin hin zugefügt. Bei Klonierung in die EcoRI-Restriktions-Schnitt stellen stellt der PTIS-Linker nicht nur die notwendige ribosomale Bindungsstelle und das Translations-Startcodon dar, sondern auch eine HindIII-Restriktions-Schnittstelle stromaufwärts von der ribosomalen Bindungsstelle zur leich teren Kopplung an die einzige HindIII-Schnittstelle in pPL322 dar. Das Plasmid, welches die PTIS und den N-termi nalen Teil des vermutlichen PGA-Gens enthält, wurde pRK102 genannt: Das entstandene HindIII bis SalI-Fragment von pRK102 wurde in die HindIII bis SalI-Schnittstellen von pPL322 unter Erhalt des in Fig. 2 gezeigten Plasmids pRK103 kloniert. Um das defekte PGA-Gen "zu reparieren", wurde das 1,5 Kbp SalI-Fragment anschließend in die einzige SalI- Schnittstelle von pRK103 in korrekter Orientierung unter Erhalt des Plasmids pRK104 kloniert. Dieses Plasmid wurde anschließend verwendet, um auf die Glutaminaseaktivität zu testen. Eine Restriktionskarte des PGA-Gens und des Lambda- Promotorteils von Plasmid pRK104 ist in Fig. 3 gezeigt.

Um die induzierbare Expression der PGA-Aktivität von dem Plasmid pRK104 zu untersuchen, wurde das Plasmid in den Stamm N4830 transformiert. Kulturen für das Inokulum wurden über Nacht bei 30°C in LB (Luria-Bouillon, enthaltend 50 µg Ampicillin/ml) gezüchtet und anschließend in das gleiche Medium, welches 725 µg Glutamin/ml und 1,0% Glucose ent hielt, transferiert. Diese Kultur wurde bei 30°C gezüchtet, bis die Kultur die mid-log-Wachstumsphase erreichte, und anschließend wurde ein Teil der Kultur durch Verschiebung der Inkubationstemperatur auf 37°C induziert. Proben wurden zur Analyse nach 1- und 2stündiger Inkubation entnommen. Die Zellproben wurden entnommen, und die Rohextrakte wur den, wie zuvor für die Enzymanalyse beschrieben, herge stellt. Die Expression von PGA bei der permissiven Tempe ratur von 37°C betrug das 10fache im Vergleich zu der bei der restriktiven Temperatur von 30°C. Das exprimierte Pro tein zeigte Funktion, wie durch die Fähigkeit des aus E. coli, welcher das PGA-Gen enthielt, isoliertem Rohextrakt, L-Glutamin in L-Glutamat plus Ammoniak umzuwandeln, gezeigt wurde. Um sicherzustellen, daß die beobachtete Aktivität von der Pseudomonas-Glutaminase im Gegensatz zu den endoge nen E. coli-Glutaminasen A und B stammte, wurde die Reak tion mit D-Glutamin bei pH 8 wiederholt. Nur das Pseudomo nas-Enzym funktioniert unter diesen Bedingungen. In der Tat wandelt es D-Glutamin in Glutamat mit 87% der Effizienz, mit der es L-Glutamin umwandelt, um. Die Ergebnisse zeigen, daß die gesamte meßbare Aktivität von PGA stammt. Protein assays nach Lowry wurden auch an den rohen Zellextrakten durchgeführt, um die Berechnung der Enzymaktivität als spe zifische Aktivität zu gestatten. Proben jedes Extrakts wur den auch auf SDS-PAGE-Gelen, im wesentlichen wie von Laemmli (Laemmli U.K. (1970): Nature (London) 227: 680-685) beschrieben, durchgeführt. Die entstandene Enzym-Indukti onskurve ist in Fig. 4 dargestellt, worin die Erhöhung der Glutaminaseaktivität in dem Zellextrakt unter Verwendung von D-Glutamin als Substrat gezeigt ist. Wie aus der Figur hervorgeht, steigt die Aktivität gegen D-Glutamin um über das 10fache nach Temperaturinduktion, während die nichtin duzierte Kontrollkultur im wesentlichen keine Erhöhung der D-Glutaminaseaktivität zeigt. Eine zweite Kontrollkultur, welche ein Plasmid mit dem 1,5 Kbp SalI-Fragment in umge kehrter Orientierung enthält (die Daten sind nicht ge zeigt), wurde angesetzt, und keine signifikante D-Gluta minaseaktivität wurde bei diesem Plasmid unter beliebigen Bedingungen detektiert.

Die beiden E. coli-Kulturen (ECrecPGA1 und ECrecPGA2), die mit dem Plasmid pRK104 transformiert worden sind, wurden am 12. November 1991 bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, D-3300 Braun schweig, unter den Hinterlegungsnummern DSM 6787 und DSM 6789 hinterlegt. Beide Kulturen sind Gal^-.

ECrecPGA1 ist geeignet zur Herstellung von Plasmidpräpara tionen und kann bei 37°C in LB-Bouillon oder in einem ande ren geeigneten Medium gezüchtet werden.

ECrecPGA2 benötigt Histidin, Isoleucin, Valin und Leucin zum Wachstum. Diese Kultur ist geeignet, um große Mengen des Glutaminaseenzyms herzustellen. Sie sollte bei 28 bis 30°C gezüchtet werden und dann auf 37°C zur Enzyminduktion transferiert werden. Dieser Organismus enthält das cIS57- Allel des Repressorgens, das allgemein verwendet wird, um die Expression zur Bildung von Proteinen in E. coli zu re gulieren. Dieses Allel ist temperatursensitiv und erzeugt ein funktionelles Repressorprotein nur bei Temperaturen 30°C; oberhalb dieser Temperatur wird das Protein funkti onslos, und die Transkription wird initiiert.

Beispiel 2 In-vitro-Inhiebierungvon menschlichen Melanomzellen durch Glutaminase, welche an einen Anti-Melanom- Antikörper geknüpft ist

Menschliche Melanomzellen wurden in vitro 30 Minuten entwe der mit freiem Antikörper, freier Glutaminase oder einem kovalent gebundenen Antikörper-Glutaminase-Komplex inku biert. Der kovalent gebundene Antikörper-Glutaminase-Kom plex wurde gemäß an sich bekannten Techniken hergestellt. Die Zellen wurden gewaschen und in frische Gewebskulturme dien gegeben, und die ³H-Thymidin-Inkorporation wurde ge messen. Nur die Zellen, die mit dem Antikörper-Glutaminase- Komplex inkubiert worden waren, zeigten eine Inhibierung der ³H-Thymidin-Aufnahme, was anzeigt, daß der Antikörper- Glutaminase-Komplex an die Zellen gebunden worden war und die DNA-Synthese inhibierte.

Behandlung
prozentuale Inhibierung der ³H-Thymidin-Aufnahme
freier Antikörper
0
freie Glutaminase (0,06 IU)	0
Antikörper-Glutaminase-Komplex (0,06 IU)	93

Claims

1. DNA mit einer Basensequenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert.

2. DNA nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die Basensequenz für eine therapeu tisch geeignete Glutaminase codiert, die ein Molekularge wicht besitzt, welches niedriger als das der nativen Gluta minase ist.

3. DNA nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß die Basensequenz für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert, die keine oder erniedrigte Asparaginaseaktivität besitzt.

4. DNA nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß die Basensequenz für eine therapeutisch geeignete Glutaminase von Pseudomonas co diert.

5. DNA nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß die Basensequenz für eine therapeutisch geeignete Glutaminase von Pseudomonas 7A co diert und die folgende 5′-terminale Sequenz besitzt: oder eine davon abgeleitete Sequenz, die für das 5′-termi nale Ende einer Glutaminase mit den gleichen oder ähnlichen Eigenschaften der genannten Glutaminase von Pseudomonas 7A codiert.

6. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die die Akti vität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase besitzt.

7. Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekenn zeichnet, daß die Sequenz die Aktivität einer the rapeutisch geeigneten Glutaminase besitzt, die ein Moleku largewicht besitzt, welches niedriger ist als das der nati ven Glutaminase.

8. Polypeptid nach den Ansprüchen 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase besitzt, die keine oder erniedrigte Asparaginaseaktivität besitzt.

9. Polypeptid nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine the rapeutisch geeignete Glutaminase von Pseudomonas ist.

10. Polypeptid nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine the rapeutisch geeignete Glutaminase von Pseudomonas 7A ist und die folgende N-terminale Sequenz besitzt: oder eine davon abgeleitete Sequenz, die der N-terminalen Sequenz einer Glutaminase mit den gleichen oder ähnlichen Eigenschaften der Glutaminase von Pseudomonas 7A ent spricht.

11. Expressionsvektor, dadurch gekennzeich net, daß er eine Basensequenz, die für eine therapeu tisch geeignete Glutaminase codiert, umfaßt.

12. Expressionsvektor nach Anspruch 11, dadurch ge kennzeichnet, daß die Basensequenz für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert, die ein Mole kulargewicht besitzt, das niedriger als das der nativen Glutaminase ist.

13. Expressionsvektor nach den Ansprüchen 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Basense quenz für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert, die keine oder erniedrigte Asparaginaseaktivität besitzt.

14. Expressionsvektor nach den Ansprüchen 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Basense quenz für eine therapeutisch geeignete Glutaminase von Pseudomonas codiert.

15. Expressionsvektor nach den Ansprüchen 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Basense quenz für eine therapeutisch geeignete Glutaminase von Pseudomonas 7A codiert und die folgende 5′-terminale Sequenz besitzt: oder eine davon abgeleitete Sequenz, die für die 5′-termi nale Sequenz einer Glutaminase mit den gleichen oder ähnli chen Eigenschaften wie die Glutaminase von Pseudomonas 7A codiert.

16. Expressionsvektor nach den Ansprüchen 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressi onsvektor die Basensequenz und einen Promotor, der die Basensequenz kontrolliert, enthält.

17. Expressionsvektor nach Anspruch 16, dadurch ge kennzeichnet, daß der Promotor der Lambda-P_L- Promotor ist.

18. Expressionsvektor nach den Ansprüchen 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressi onsvektor pPL322 ist.

19. Verfahren zur Herstellung einer DNA mit einer Basense quenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) chromosomale DNA, die aus mikrobiellen, tieri schen oder pflanzlichen Zellen isoliert wurde, mit Sau3A oder einem anderen geeigneten Restriktionsenzym teilweise abbaut,
b) eine Genbank aus der Fraktion gemäß (a) her stellt;
(c) die Genbank mit bekannten Oligonucleotid-Sonden, deren Sequenzen entweder dem Amino-Terminus oder dem Carboxyl-Terminus oder dem Mittelteil einer bekannten Glutaminase entsprechen, absucht;
d) ein Plasmid, das gleichzeitig mit der Oligo nucleotid-Sonde des Amino-Terminus, des Mittelteils und des Carboxyl-Terminus der Glutaminase hybridisiert, gewinnt;
e) das rekombinante Plasmid in einen Expressionsvek tor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors inse riert; und
f) den rekombinanten Vektor in einen Wirt zu dessen Transformation einführt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekenn zeichnet, daß eine DNA hergestellt wird, die für eine Glutaminase codiert, die ein Molekulargewicht besitzt, welches niedriger ist als das der nativen Glutaminase.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch ge kennzeichnet, daß eine DNA hergestellt wird, die für eine Glutaminase codiert, die keine oder ernied rigte Asparaginaseaktivität besitzt.

22. Verfahren nach Anspruch 19 bis 21, dadurch ge kennzeichnet, daß eine DNA hergestellt wird, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase von Pseu domonas codiert.

23. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA hergestellt wird, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase von Pseudomonas 7A codiert und die folgende 5′-terminale Se quenz besitzt: oder eine davon abgeleitete Sequenz, die für die 5′-termi nale Sequenz einer Glutaminase mit den gleichen oder ähnli chen Eigenschaften wie die Glutaminase von Pseudomonas 7A codiert.

24. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, welche die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase besitzt, dadurch gekenn zeichnet, daß man

a) chromosomale DNA, die aus mikrobiellen, tieri schen oder pflanzlichen Zellen isoliert wurde, mit Sau3A oder einem anderen geeigneten Restriktionsenzym teilweise abbaut;
b) eine Genbank aus der Fraktion gemäß (a) her stellt,
c) die Genbank mit bekannten Oligonucleotid-Sonden, deren Sequenzen entweder dem Amino-Terminus oder dem Carboxyl-Terminus oder dem Mittelteil einer bekannten Glutaminase entsprechen, absucht;
d) ein Plasmid, das gleichzeitig mit der Oligo nucleotid-Sonde des Amino-Terminus, des Mittelteils und des Carboxyl-Terminus der Glutaminase hybridisiert, gewinnt;
e) das rekombinante Plasmid in einen Expressionsvek tor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors inse riert;
f) den rekombinanten Vektor in einen Wirt zu dessen Transformation einführt;
g) den Transformanten kultiviert; und
h) das entstandene Polypeptid mit einer Aminosäure sequenz, die die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase besitzt, gewinnt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekenn zeichnet, daß ein Polypeptid hergestellt wird, welches ein Molekulargewicht besitzt, das niedriger als das der nativen Glutaminase ist.

26. Verfahren nach den Ansprüchen 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid herge stellt wird, das keine oder erniedrigte Asparaginaseaktivi tät besitzt.

27. Verfahren nach den Ansprüchen 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid herge stellt wird, das die Aktivität einer therapeutisch geeigne ten Glutaminase von Pseudomonas besitzt.

28. Verfahren nach den Ansprüchen 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polypeptid herge stellt wird, das eine therapeutisch geeignete Glutaminase von Pseudomonas 7A ist und das die folgende N-terminale Se quenz besitzt: oder eine davon abgeleitete Sequenz entsprechend der N-ter minalen Sequenz einer Glutaminase mit den gleichen oder ähnlichen Eigenschaften wie die Glutaminase von Pseudomonas 7A codiert.

29. Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß der transformierte Wirt E. coli-Zellen DSM 6789 und DSM 6787 ist.

30. DNA, erhalten gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 19 bis 23.

31. Polypeptid, erhalten gemäß dem Verfahren nach den Ansprüchen 24 bis 28.

32. Verwendung der DNA nach den Ansprüchen 1 bis 5 zur Isolierung einer therapeutisch geeigneten Glutaminase in menschlichem Gewebe oder Körperflüssigkeiten.

33. Verwendung des Polypeptids nach den Ansprüchen 6 bis 10 zur Behandlung von Neoplasie.

34. Verwendung des Polypeptids nach den Ansprüchen 6 bis 10 in Kombination mit einem monoklonalen Antikörper, der für die zu behandelnde Neoplasie spezifisch ist, zur Behandlung von Neoplasie.

35. Verwendung nach den Ansprüchen 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Neoplasie Lungen-, Brust- oder Kolonkrebs ist.

36. Verwendung des Polypeptids nach den Ansprüchen 6 bis 10 zur Behandlung von viralen Erkrankungen.

37. Verwendung nach Anspruch 36, dadurch gekenn zeichnet, daß die virale Erkrankung eine HIV- Infektion ist.

38. Verwendung nach den Ansprüchen 36 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß ein Glutamin-Antimeta bolit zusätzlich zu dem Polypeptid verwendet wird.