DE4140003A1 - DNA encoding low mol.wt. glutaminase - used for glutamine isolation from human tissues or fluids for treating cancer and HIV - Google Patents
DNA encoding low mol.wt. glutaminase - used for glutamine isolation from human tissues or fluids for treating cancer and HIVInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA mit einer Basensequenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutami nase, ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase be sitzt, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung bei der antiviralen und Anti-Krebstherapie.The present invention relates to a DNA with a Base sequence necessary for a therapeutically suitable glutamine nase, a polypeptide having an amino acid sequence containing the Activity of a therapeutically suitable glutaminase be as well as methods for their production and use in antiviral and anti-cancer therapy.
Die Verwendung von Glutaminase, um Glutamin in Tumor-tra genden Wirten zu entleeren, stellt ein attraktives Grund prinzip zur Bekämpfung von Krebszellen dar. Glutamin nimmt eine wichtige Rolle in der Biosynthese einer großen Anzahl zellulärer Metaboliten ein. Es wurde gezeigt, daß im Ver gleich mit normalen Geweben einige Neoplasmen mit einer maximalen Konzentration an Glutaminverfügbarkeit leben, weil die Synthese herabgesetzt und der Verbrauch erhöht ist (Levintow L. (1954): J. Natl. Cancer Inst. 15: 347-352; Roberts E. und Simonsen D.G. (1960): Amino Acids, Proteins and Cancer Biochemistry (J.T. Edsall, Herausg.), Academic Press, New York, N.Y., S. 121-145; Weber G. (1983): Cancer Res. 43: 3466-3492; Sebolt J.S. und Weber G. (1984): Life Sci. 34: 301-306). Versuche zeigten eine negative Korrela tion zwischen dem Glutamingehalt und der Wachstumsrate von transplantierten Rattenhepatomen. Die in-vivo-Konzentration an Glutamin im Hepatom 3924A erwies sich als 9fach niedri ger (0,5 mM) als in Leber (4,5 mM) und niedriger als in irgendeinem anderen Gewebe der Ratte (2 bis 5 mM) (Weber G. (1983): Cancer Res. 43: 3466-3492). In den vergangenen Jah ren häuften sich Daten, die anzeigten, daß Glutamin eine wichtige Energiequelle für die zelluläre Energie bei einer Vielzahl von Neoplasmen einschließlich hämatopoetischen Tumoren, Hepatomen, Ehrlich-Karzinom und HeLa-Zellen ist (Abou-Khalil W.F., Yunis A.A. und Abou Khalil S. (1983): Cancer Res. 43: 1990-1993; Kovacevic Z. und Morris H.P. (1972): J. Biol. Chem. 33: 326-333; Kovacevic Z. (1971): Biochem. J. 125: 757-763; Reitzer L.J., Wice B.M., Kennell D. (1979): J. Biol. Chem. 254: 2669-2676).The use of glutaminase to glutamine in tumor tra emptying hosts is an attractive reason principle for combating cancer cells. Glutamine decreases an important role in the biosynthesis of a large number cellular metabolite. It has been shown that in Ver same with normal tissues, some neoplasms with one live maximum concentration of glutamine availability, because the synthesis is lowered and the consumption is increased (Levintow L. (1954): J. Natl. Cancer Inst. 15: 347-352; Roberts E. and Simonsen D.G. (1960): Amino Acids, Protein and Cancer Biochemistry (J.T. Edsall, ed.), Academic Press, New York, N.Y., pp. 121-145; Weber G. (1983): Cancer Res. 43: 3466-3492; Sebolt J.S. and Weber G. (1984): Life Sci. 34: 301-306). Trials showed a negative Korrela tion between the glutamine content and the growth rate of transplanted rat hepatomas. The in vivo concentration glutamine in the hepatoma 3924A proved to be 9-fold lower ger (0.5 mM) than in liver (4.5 mM) and lower than in any other rat tissue (2 to 5 mM) (Weber G. (1983): Cancer Res. 43: 3466-3492). In the past years Data were accumulating, indicating that glutamine had a important source of energy for cellular energy at one Variety of neoplasms including hematopoietic Tumors, hepatomas, Ehrlich carcinoma and HeLa cells (Abou-Khalil W.F., Yunis A.A. and Abou Khalil S. (1983): Cancer Res. 43: 1990-1993; Kovacevic Z. and Morris H.P. (1972): J. Biol. Chem. 33: 326-333; Kovacevic Z. (1971): Biochem. J. 125: 757-763; Reitzer L.J., Wice B.M., Kennell D. (1979): J. Biol. Chem. 254: 2669-2676).
L-Asparaginase, das erste Enzym, das intensiver als Anti- Tumormittel bei Menschen untersucht wurde, ist hochwirksam bei der Behandlung der akuten lymphoplastischen Leukämie. Dieses Enzym besitzt jedoch geringe oder keine Aktivität gegen irgendwelche anderen Neoplasmen beim Menschen. Das Enzym Glutaminase scheint eine viel breitere potentielle Nützlichkeit bei der Krebstherapie als Asparaginase zu be sitzen.L-asparaginase, the first enzyme more intense than anti- Tumor agent has been studied in humans is highly effective in the treatment of acute lymphoblastic leukemia. However, this enzyme has little or no activity against any other human neoplasms. The Enzyme glutaminase seems to be a much broader potential Usefulness in cancer therapy as asparaginase be sit.
Verschiedene Glutaminase- und Glutaminase-Asparaginase- Enzyme von Säugern und Mikroorganismen wurden gereinigt und charakterisiert. Davon scheint Pseudomonas 7A-Glutaminase- Asparaginase wegen ihres niedrigen Km-Werts für Glutamin (Mikromolar-Bereich), ihrer guten Stabilität und Aktivität in physiologischem Milieu und einer langen Halbwertszeit in Plasma bei Tumor-tragenden Wirten für die therapeutische Verwendung am besten geeignet zu sein (Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 2119-2123; und Roberts J., Schmid F.A. und Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054).Various glutaminase and glutaminase asparaginase enzymes of mammals and microorganisms have been purified and characterized. Of these, Pseudomonas 7A-glutaminase asparaginase seems most suitable for therapeutic use because of its low K m for glutamine (micromolar range), good stability and activity in physiological milieu, and a long plasma half-life in tumor-bearing hosts (Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 2119-2123; and Roberts J., Schmid FA and Rosenfeld HJ (1979): Cancer Treat, Rep. 63: 1045-1054).
Die bekannten Glutaminaseenzyme von Säugern sind für die Verwendung als therapeutische Mittel wegen ihrer hohen Km- Werte (Millimolar-Bereich) und ihres Erfordernisses nach Phosphatestern oder Malat zur Aktivierung als therapeuti sche Mittel nicht geeignet. Die E. coli-Glutaminasen (A und B) sind ebenfalls wegen ihrer hohen Km-Werte (Millimolar- Bereich), niedrigen Aktivität bei physiologischem pH (Glutaminase A) oder des Erfordernisses nach speziellen aktivierenden Substanzen (Glutaminase B) für therapeutische Zwecke nicht geeignet.The known mammalian glutaminase enzymes are not suitable for use as therapeutic agents because of their high K m values (millimolar range) and their requirement for phosphate esters or malate for activation as therapeutic agents. The E. coli glutaminases (A and B) are also not useful for therapeutic purposes because of their high K m (millimolar range), low activity at physiological pH (glutaminase A), or the requirement for special activating substances (glutaminase B) suitable.
Pseudomonas 7A-Glutaminase-Asparaginase setzt sich aus vier identischen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von etwa 35 000 zusammen. Sedimentationsstudien mit dem aktiven Enzym zeigten, daß die katalytische Aktivität im Tetramer liegt; keine kleineren aktiven Spezies wurden beobachtet (Holcenberg J.S., Teller D.C. und Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 5375-5380). Das gereinigte Enzym besitzt ein Verhältnis von Glutaminase- zu Asparaginaseaktivität von etwa 2:1. Bindungsstudien mit C14-markierten Glutamin- Analoga (6-Diazo-5-oxo-L-norleucin; DON) und Asparagin (6-Diazo-5-oxo-L-norvalin; DONV) legten nahe, daß die bei den Analoga bevorzugt mit Hydroxylgruppen an verschiedenen Stellen des Proteins reagieren und daß die beiden Bindungs stellen kooperativ als Teil des aktiven Zentrums wirken (Holcenberg J.S., Ericsson L. und Roberts J. (1978): Bio chemistry 17: 411-417). Es wurde gezeigt, daß Pseudomonas 7A-Glutaminase-Asparaginase eine beträchtliche antineopla stische Aktivität gegen eine Vielzahl von Leukämien bei Nagern (L1210, C1498, EARAD/1), Ascites-Tumoren (Taper- Leber, Ehrlich-Karzinom, Meth-A-Sarcom, S 180) und bestimm te feste Tumore (Carinosarcom Walker 256, B16-Melanom) be sitzt. Zusätzlich wurde gefunden, daß der Antagonismus von Glutamin durch Glutamin-Analoga und Glutaminase stark inhi bierend auf menschliche Kolon-, Brust- und Lungenkarzinome, die in athymischen Mäusen wachsen, wirkt (McGregor W. und Roberts J. (1989): Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 30, 578; Robert J., Schmid F.A. und Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054; Ovejera A.A., Houchens D.P., Catane R., Sheridan M.A. und Muggia F.M. (1979): Cancer Res. 39: 3220-3224; Houchens D.P., Ovejera A.A., Sheridan M.A., Johnson R.K., Bogden A.E. und Neil G.L. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 473-476; Duvall L.R. (1960): Cancer Chemother. Rep. 7: 86-98).Pseudomonas 7A-glutaminase asparaginase is composed of four identical subunits with a molecular weight of about 35,000. Sedimentation studies with the active enzyme showed that the catalytic activity lies in the tetramer; no smaller active species were observed (Holcenberg JS, Teller DC and Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 5375-5380). The purified enzyme has a ratio of glutaminase to asparaginase activity of about 2: 1. Binding studies with C 14 -labelled analogs of glutamine (6-diazo-5-oxo-L-norleucine; DON) and asparagine (6-diazo-5-oxo-L-norvaline; DONV) suggested that the preferred for the analogues react with hydroxyl groups at different sites of the protein and that the two binding sites act cooperatively as part of the active site (Holcenberg JS, Ericsson L. and Roberts J. (1978): Bio chemistry 17: 411-417). It has been shown that Pseudomonas 7A-glutaminase asparaginase has considerable antineoplastic activity against a variety of leukemias in rodents (L1210, C1498, EARAD / 1), ascites tumors (taper liver, Ehrlich carcinoma, Meth A sarcoma , S 180) and certain solid tumors (Carinosarcom Walker 256, B16 melanoma) be sitting. In addition, glutamine antagonism by glutamine analogs and glutaminase has been found to act strongly on human colon, breast and lung carcinomas growing in athymic mice (McGregor W. and Roberts J. (1989): Proc. Amer 30, 578; Robert J., Schmid FA and Rosenfeld HJ (1979): Cancer Treat, Rep. 63: 1045-1054; Ovejera AA, Houchens DP, Catane R., Sheridan MA, and Muggia FM (1979). 39: 3220-3224; Houchens DP, Ovejera AA, Sheridan MA, Johnson RK, Bogden AE and Neil GL (1979): Cancer Treat, Rep. 63: 473-476, Duvall LR (1960): Cancer Chemother, Rep. 7: 86-98).
Ein wichtiges Charakteristikum der Glutaminasetherapie ist die Tatsache, daß sich nach wiederholten Behandlungen mit diesem Enzym keine resistenten Stämme entwickeln (Roberts J., Schmid F.A. und Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054). Es wurde ebenfalls gezeigt, daß die Be handlung mit Glutaminase die Resistenzbildung gegen Metho trexat (Roberts J., Schmid F.A. und Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054) verzögert.An important characteristic of glutaminase therapy is the fact that after repeated treatments with do not develop resistant strains of this enzyme (Roberts J., Schmid F.A. and Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054). It has also been shown that Be treatment with glutaminase, the formation of resistance to metho trexat (Roberts J., Schmid F.A. and Rosenfeld H.J. (1979): Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054).
Es wurde gezeigt, daß eine bioaktive Glutaminase-Asparagi nase retrovirale Erkrankungen bei Mäusen inhibiert. Die Glutaminentleerung inhibiert stark die Replikation des Rauscher-Mäuseleukämie-Retrovirus (RLV) in vitro. Pseudomo nas 7A-Glutaminase-Asparaginase (PGA), die in der Lage ist, Glutamin und Asparagin für längere Zeitspannen zu entlee ren, wurde verwendet, um die therpeutische Wirksamkeit der Glutaminentleerung bei mit RLV oder dem Friend-Virus infi zierten Mäusen zu bestimmen. Während der PGA-Behandlung von virämischen Tieren fiel die Aktivität der reversen Trans kriptase im Serum auf Kontrollspiegel, und die infizierten Tiere entwickelten keine Splenomegalie. Die therapeutischen Ergebnisse, die mit PGA erhalten wurden, zeigten einen gün stigen Vergleich mit den Ergebnissen, die mit intraperito neal in einer Dosierung von 30 mg/kg/Tag verabreichtem Azi dothymidin erhalten wurden (Robert J. und McGregor W. (1991): Journal of General Virology, 72, 299-305).It has been shown that a bioactive glutaminase asparagus nase inhibits retroviral diseases in mice. The Glutamine depletion strongly inhibits the replication of Rauscher mouse leukemia retrovirus (RLV) in vitro. Pseudomo nas 7A-glutaminase-asparaginase (PGA), which is able To empty glutamine and asparagine for longer periods of time was used to assess the therapeutic efficacy of Emptying of glutamine with RLV or Friend Virus infi to determine adorned mice. During the PGA treatment of In viremic animals, the activity of the reverse trans cryptase in serum on control levels, and those infected Animals did not develop splenomegaly. The therapeutic Results obtained with PGA showed a gün similar comparison with the results with intraperitoneal neal administered at a dosage of 30 mg / kg / day dothymidine were obtained (Robert J. and McGregor W. (1991): Journal of General Virology, 72, 299-305).
Gegenwärtig sind keine therapeutisch nützlichen Glutamina sen verfügbar, die billig und mit geringer oder keiner Kontamination durch andere Substanzen, beispielsweise durch Endotoxine eines Wirts-Mikroorganismus, erzeugt werden kön nen. Ferner sind keine therpeutisch nützlichen Glutaminasen verfügbar, denen die Asparaginaseaktivität fehlt und die ein niedrigeres Molekulargewicht als das native Enzym be sitzen und die somit in den behandelten Tieren oder Men schen weiter verteilt werden können und mit geringeren immunogenen Problemen verbunden sind. Ferner steht ein geeignetes Enzym in Mengen, die groß genug für eine weit angelegte klinische Erprobung sind, nicht zur Verfügung.At present there are no therapeutically useful glutamines available, cheap and with little or no Contamination by other substances, for example by Endotoxins of a host microorganism can be generated NEN. Furthermore, there are no therapeutically useful glutaminases which lack asparaginase activity and the a lower molecular weight than the native enzyme be sit and thus in the treated animals or men can be further distributed and with less immunogenic problems. It also arrives suitable enzyme in amounts large enough for a long time clinical trials are not available.
Folglich ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die obigen Nachteile zu überwinden und die Gentechnik zu ver wenden, um eine therapeutisch geeignete Glutaminase mit verbesserter und vergrößerter therapeutischer Wirksamkeit bereitzustellen. Weiterhin soll erfindungsgemäß eine thera peutisch geeignete Glutaminase bereitgestellt werden, die klein genug ist, um eine verbesserte Durchdringbarkeit von Tumoren und Virus-infizierten Geweben, die im extravaskulä ren Bereich liegen, zu ermöglichen. Weiterhin soll erfin dungsgemäß eine therapeutisch geeignete Glutaminase zur Verfügung gestellt werden, die keine Asparaginaseaktivität besitzt. Weiterhin soll erfindungsgemäß eine therapeutisch nützliche Glutaminase bereitgestellt werden, die die wirk same Behandlung viraler Infektionen ermöglicht und die von Verunreinigungen frei ist. Consequently, an object of the present invention is overcome the above disadvantages and ver genetic engineering use a therapeutically suitable glutaminase with improved and increased therapeutic efficacy provide. Furthermore, according to the invention a thera peutically suitable glutaminase are provided is small enough to have improved penetrability Tumors and virus-infected tissues in extravascular range. Furthermore, should invent According to the invention, a therapeutically suitable glutaminase for Be provided, no asparaginase activity has. Furthermore, according to the invention a therapeutic useful glutaminase are provided, which are the most effective same treatment of viral infections and that of Contamination is free.
Erfindungsgemäß wird somit eine DNA mit einer Basensequenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert, sowie ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase be sitzt, bereitgestellt. Zusätzlich wird ein Expressionsvek tor, der eine Basensequenz, die für eine therapeutisch ge eignete Glutaminase codiert, umfaßt, bereitgestellt.According to the invention thus a DNA with a base sequence, which codes for a therapeutically suitable glutaminase, and a polypeptide having an amino acid sequence containing the Activity of a therapeutically suitable glutaminase be sits, provided. In addition, an expression vector tor, which has a base sequence suitable for a therapeutically ge suitable glutaminase encoded, provided.
Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung einer DNA mit einer Basensequenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert, bereitgestellt, das dadurch gekenn zeichnet ist, daß man (a) chromosomale DNA, die aus mikro biellen, tierischen oder pflanzlichen Zellen mit Sau3A oder einem anderen geeigneten Restriktionsenzym isoliert worden ist, teilabbaut; (b) eine genomische Bank aus der Fraktion gemäß (a) herstellt; (c) die genomische Bank mit bekannten Oligonucleotid-Sonden, deren Sequenzen entweder dem Amino- Terminus oder dem Carboxyl-Terminus oder dem Mittelteil einer bekannten Glutaminase entsprechen, absucht; (d) ein Plasmid gewinnt, das gleichzeitig mit der Oligonucleotid- Sonde des Amino-Terminus, des Mittelteils und des Carboxyl- Terminus der Glutaminase hybridisiert; (e) das rekombinante Plasmid in einen Expressionsvektor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors inseriert; und (f) den rekom binanten Vektor in einen Wirt zu dessen Transformation ein führt. Weiterhin wird ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase besitzt, bereit gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) chro mosomale DNA, die aus mikrobiellen, tierischen oder pflanz lichen Zellen mit Sau3A oder einem anderen geeigneten Restriktionsenzym isoliert worden ist, teilabbaut; (b) eine genomische Bank aus der Fraktion gemäß (a) herstellt; (c) die genomische Bank mit bekannten Oligonucleotid-Sonden, deren Sequenzen entweder dem Amino-Terminus oder dem Carb oxyl-Terminus oder dem Mittelteil einer bekannten Glutami nase entsprechen, absucht; (d) ein Plasmid gewinnt, das gleichzeitig mit der Oligonucleotid-Sonde des Amino-Termi nus, des Mittelteils und des Carboxyl-Terminus der Glutami nase hybridisiert; (e) das rekombinante Plasmid in einen Expressionsvektor unter der Kontrolle eines geeigneten Pro motors inseriert; (f) den rekombinanten Vektor in einen Wirt zu dessen Transformation einführt; (g) den Transfor manten kultiviert; und (h) das entstandene Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die die Aktivität einer therapeu tisch geeigneten Glutaminase besitzt, gewinnt.Further, a method for producing a DNA with a base sequence suitable for a therapeutically appropriate Glutaminase provided thereby characterized is characterized in that (a) chromosomal DNA consisting of micro Bone, animal or plant cells with Sau3A or another suitable restriction enzyme has been isolated is, partially dismantled; (b) a genomic bench from the Group produced according to (a); (c) the genomic library with known ones Oligonucleotide probes whose sequences are either amino acid Terminus or the carboxyl terminus or the middle part a known glutaminase, scans; (d) a Plasmid that coexists with the oligonucleotide Probe of the amino terminus, middle part and carboxyl Terminus of glutaminase hybridizes; (e) the recombinant Plasmid in an expression vector under the control a suitable promoter inserted; and (f) the rekom binant vector into a host for its transformation leads. Furthermore, a method for producing a Polypeptides having an amino acid sequence that has the activity a therapeutically suitable glutaminase ready , which is characterized in that one (a) chro mosomal DNA consisting of microbial, animal or plant cells with Sau3A or another suitable Restriction enzyme has been isolated, partially degraded; (legs genomic library prepared from the fraction in (a); (C) the genomic library with known oligonucleotide probes, their sequences either to the amino terminus or the carb oxyl terminus or the middle part of a known glutamate nose correspond, searches; (d) a plasmid wins, the simultaneously with the oligonucleotide probe of the amino termi nus, the middle part and the carboxyl terminus of the glutamis nose hybridizes; (e) the recombinant plasmid into a Expression vector under the control of a suitable pro motors advertised; (f) the recombinant vector into a Introduces host to its transformation; (g) the transfor manten cultivated; and (h) the resulting polypeptide having an amino acid sequence that determines the activity of a therapeu has appropriate glutaminase, wins.
Die Klonierung und Expression des Gens, das für Pseudomonas 7A-Glutaminase-Asparaginase in E. coli codiert, erhöht den Gehalt an Glutaminase in der Zelle um mindestens das 10fache und die bakterielle Masse/l-Kultur um das 3- bis 5fache. Dies reduziert deutlich die Produktionskosten von Glutaminase und ermöglicht eine größer angelegte klinische Erprobung. Zusätzlich kann durch Erzeugung der Glutaminase in E. coli die Kontamination des Anti-Tumor-Arzneimittels durch das hochtoxische Pseudomonas-Endotoxin vermieden wer den. Ferner gestattet die Reduktion der Größe der aktiven Glutaminase eine weitere Verteilung des Enzyms in dem extravaskulären Raum und führt so zu einer größeren thera peutischen Wirksamkeit gegen feste Tumore.The cloning and expression of the gene responsible for Pseudomonas 7A-glutaminase asparaginase encoded in E. coli, increases the Content of glutaminase in the cell by at least the 10-fold and the bacterial mass / L culture around the 3- to 5 times. This significantly reduces the production costs of Glutaminase and allows a larger-scale clinical Testing. Additionally, by producing the glutaminase in E. coli the contamination of the anti-tumor drug avoided by the highly toxic Pseudomonas endotoxin who the. Furthermore, the reduction allows the size of the active Glutaminase a further distribution of the enzyme in the extravascular space, thus leading to a larger thera peutic efficacy against solid tumors.
Die vorliegende Erfindung eröffnet die Möglichkeit, eine Asparaginase-freie Glutaminase zu erhalten, die therapeuti sche Vorteile gegenüber Glutaminase-Asparaginase-Enzymprä paraten haben kann, da L-Asparaginase als kompetitiver Inhibitor des Glutaminabbaus dient. Die Eliminierung der Asparaginaseaktivität von diesem Enzym verringert auch die Toxizität für den Wirt. Es gibt gegenwärtig keine therapeu tisch nützlichen Glutaminasen, denen die Asparaginaseakti vität fehlt. The present invention opens up the possibility of a To obtain asparaginase-free glutaminase, the therapeuti advantages over glutaminase asparaginase enzyme preparations Since L-asparaginase is more competitive, it can be helpful Inhibitor of glutamine degradation is used. The elimination of the Asparaginase activity of this enzyme also reduces the Toxicity to the host. There are currently no therapeu useful glutaminases that cause asparaginase activity is missing.
Ferner zeigt die vorliegende Erfindung, daß die Wirksamkeit von Glutaminase gegen eine Neoplasie erhöht werden kann, wenn Glutaminase an einen monoklonalen Antikörper, der für die zu behandelnde Neoplasie spezifisch ist, geheftet wird. Ferner kann ein Glutaminase-Antimetabolit mit Vorteil mit der erfindungsgemäßen Glutaminase bei der Behandlung von Krebs verwendet werden. Zusätzlich wurde die Wirksamkeit von Glutaminase gegen das Human Immunodeficiency Virus nachgewiesen.Furthermore, the present invention shows that the effectiveness can be increased by glutaminase against a neoplasm, when glutaminase binds to a monoclonal antibody that is responsible for the neoplasia to be treated is specific, stapled. Furthermore, a glutaminase antimetabolite may be advantageous the glutaminase according to the invention in the treatment of Cancer can be used. In addition, the effectiveness was of glutaminase against the human immunodeficiency virus demonstrated.
Ferner wird erfindungsgemäß zum ersten Mal die DNA-Sequenz einer therapeutisch nützlichen Glutaminase bereitgestellt.Furthermore, according to the invention for the first time the DNA sequence a therapeutically useful glutaminase.
Schließlich ermöglicht die Sequenzierung des Gens der bak teriellen Glutaminase die Isolierung weiterer therapeutisch nützlicher Glutaminasen aus menschlichen Geweben oder Kör perflüssigkeiten.Finally, the sequencing of the gene allows the bak terial glutaminase the isolation of further therapeutic useful glutaminases from human tissues or bodies perflüssigkeiten.
Im folgenden wird das modifizierte Glutaminase-Asparagi nase-Enzym mit Asparaginaseaktivität oder mit verminderter oder fehlender Asparaginaseaktivität als Glutaminase be zeichnet.The following is the modified glutaminase asparagi Nasal enzyme with asparaginase activity or with reduced or lacking asparaginase activity as glutaminase records.
Der Ausdruck "therapeutisch geeignet" im Zusammenhang mit den Enzymen zur spezifischen Entleerung einer Aminosäure bezeichnet Enzyme mit den folgenden Eigenschaften:The term "therapeutically appropriate" in connection with the enzymes for the specific emptying of an amino acid refers to enzymes with the following properties:
- 1. Hohe Aktivität und Stabilität bei physiologischem pH- Wert.1. High activity and stability at physiological pH Value.
- 2. Beibehaltung der hohen Aktivität und Stabilität in Seren und Blut von Tieren und Menschen. 2. Maintaining high activity and stability in sera and blood of animals and humans.
- 3. Langsame Clearance aus dem Kreislauf bei Injektion in die Tiere oder Menschen.3. Slow clearance from the circulation when injected in the animals or humans.
- 4. Keine Inhibierung durch ihre Produkte oder andere Bestandteile, die normalerweise in Körperflüssigkeiten vorkommen.4. No inhibition by their products or others Ingredients that are normally in body fluids occurrence.
- 5. Kein Erfordernis nach Cofaktoren oder prosthetischen Gruppen, die leicht vom Enzym abdissoziieren können.5. No requirement for cofactors or prosthetic Groups that can easily dissociate from the enzyme.
- 6. Niedriger Km-Wert (im Bereich von 10-6 bis 10-4 M) und enge Substratspezifität.6. Low K m (ranging from 10 -6 to 10 -4 M) and tight substrate specificity.
- 7. Effektive Irreversibilität der enzymatischen Reaktion unter physiologischen Bedingungen.7. Effective irreversibility of the enzymatic reaction under physiological conditions.
- 8. Verfügbarkeit aus einem Organismus, der niedrige Gehalte an Endotoxin besitzt.8. Availability from an organism, the low levels possesses endotoxin.
- 9. Niedrige Immunogenizität.9. Low immunogenicity.
Eine Anzahl von Aminosäure-abbauenden Enzymen, die keine Anti-Tumoraktivität zeigen, sind ebenfalls nicht in der Lage, irgendeines der obigen Kriterien zu erfüllen. Bei spielsweise besitzt E. coli-Glutaminase ein pH-Optimum von 5 und im wesentlichen keine Aktivität bei physiologischem pH. Eine ineffektive Form der E. coli-Asparaginase besitzt einen Km über 1 mM. Asparaginaseenzyme aus Hefe, Bacillus coagulans und Fusarium tricinctum besitzen alle sehr hohe Clearanceraten bei Mäusen.A number of amino acid degrading enzymes which show no antitumor activity are also unable to meet any of the above criteria. For example, E. coli glutaminase has a pH optimum of 5 and essentially no activity at physiological pH. An ineffective form of E. coli asparaginase has a K m above 1 mM. Asparaginase enzymes from yeast, Bacillus coagulans and Fusarium tricinctum all have very high clearance rates in mice.
Mittels Oligonucleotid- und Deletionsmutagenese wird ein Enzym erhalten, das ausschließlich Glutaminase ist und das so klein ist, daß eine verbesserte Durchdringbarkeit von Tumoren und Virus-infiziertem Gewebe im extravaskulären Raum erhalten wird. Dabei kann die DNA gemäß Beispiel 1 verwendet werden. Mittels Analyse der Aminosäuresequenz (abgeleitet von der Nucleotidsequenz) und aus röntgenkri stallographischen Daten wurden Regionen des Glutaminasepro teins identifiziert, die für die Katalyse oder strukturelle Integrität nicht benötigt werden, und sie wurden auf der DNA-Ebene durch Deletion der relevanten Nucleotidsequenzen deletiert.By means of oligonucleotide and deletion mutagenesis becomes Receive enzyme that is glutaminase exclusively and that is so small that improved penetrability of Tumors and virus-infected tissue in the extravascular Room is obtained. In this case, the DNA according to Example 1 be used. By analysis of the amino acid sequence (derived from the nucleotide sequence) and from X-ray crystal Stallographic data were regions of glutaminase identified for catalysis or structural Integrity is not needed and they were based on the DNA level by deletion of the relevant nucleotide sequences deleted.
Die Inaktivierung der Asparagin-Bindungsstelle von PGA wird erreicht, da Bindungsstudien mit Glutamin und Asparagin- Analoga DON bzw. DONV zeigen, daß die Glutamin- und Aspara ginstellen nicht identisch sind, obwohl sie räumlich dicht beieinander angeordnet sind. DON bindet irreversibel an das Threonin der Aminosäure 20, wohingegen DONV an einen Threo nin- oder Serinrest in einer anderen Region des Proteins zu binden scheint. Die entsprechende ortsspezifische Mutage nese der klonierten DNA kann nach Standardtechniken durch geführt werden (Molecular Cloning, a laboratory manual - Sambrook et al. - Buch 2, 2. Ausgabe, 1989, S. 15.80- 14.113, Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA).The inactivation of the asparagine binding site of PGA is since binding studies with glutamine and asparagine Analogs DON and DONV show that glutamine and aspara They are not identical, although they are spatially dense are arranged together. DON irreversibly binds to the Threonine of amino acid 20, whereas DONV to a threo nine or serine residue in another region of the protein seems to bind. The corresponding site-specific mutagen The cloned DNA can be purified by standard techniques (Molecular Cloning, a laboratory manual - Sambrook et al. - Book 2, 2nd ed., 1989, p. 15.80- 14.113, Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA).
Gewebskultur-Experimente mit Pseudomonas 7A-Glutaminase (PGA) zeigten, daß dieses Enzym stark die Replikation des Human Immunodeficiency Virus (HIV), das in den empfängli chen Human-T-Zellen H9 wächst, inhibiert. Die Anwesenheit von 0,4 µg PGA/ml-Kulturmedium verursachte in der Tat eine 10%ige Inhibierung der viralen Replikation, und 0,016 µg pro ml verursachte eine 50%ige Inhibition. Eine viel grö ßere Konzentration an PGA (50 µg/ml) war erforderlich, um eine bemerkbare Toxizität gegenüber den menschlichen Wirts zellen H9 hervorzurufen. Die Gewebskultur-Experimente wur den mit dem HIV-I-Virus durchgeführt, aber andere Varianten können ebenfalls inhibiert werden. Tissue culture experiments with Pseudomonas 7A glutaminase (PGA) showed that this enzyme strongly inhibits the replication of the Human Immunodeficiency Virus (HIV), which is found in the receptors human T cells H9 grows, inhibits. The presence of 0.4 μg PGA / ml culture medium indeed caused one 10% inhibition of viral replication, and 0.016 μg per ml caused a 50% inhibition. A much bigger The concentration of PGA (50 μg / ml) was required to a noticeable toxicity to the human host cells H9. The tissue culture experiments were the one carried out with the HIV-I virus, but other variants can also be inhibited.
Die Ergebnisse des Gewebskultur-Experiments zeigen, daß PGA viel toxischer gegenüber HIV als gegenüber den menschlichen Wirtszellen ist, und es wird erwartet, daß PGA einen größe ren therapeutischen Index bei Verabreichung an HIV-infi zierte Patienten zeigen wird.The results of the tissue culture experiment show that PGA much more toxic to HIV than to human Host cells is and it is expected that PGA a size therapeutic index when administered to HIV infi graced patients will show.
Ferner erwies sich PGA in Kombination mit dem Glutamin- Antimetabolit DON als besonders erfolgreich bei der Behand lung von Lungen-, Brust- oder Kolonkrebs (McGregor W. und Roberts J. (1989): Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 30, 578).Furthermore, PGA in combination with the glutamine Antimetabolite DON is particularly successful in the treatment lung, breast or colon cancer (McGregor W. and Roberts J. (1989): Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 30, 578).
Die DNA mit einer Basensequenz, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase oder das entsprechende Polypeptid codiert, kann aus jeder beliebigen mikrobiellen, tierischen oder Pflanzenzelle unter Verwendung von Oligonucleotid-Son den, die gemäß den bekannten Glutaminase-Proteinsequenzen hergestellt wurden, isoliert werden. Bevorzugt wird die DNA aus Pseudomonas 7A-Zellen isoliert. Es ist jedoch zu ver stehen, daß die Verfahren und die Bedingungen bei den ein zelnen Verfahrensstufen, die im folgenden näher erläutert werden, nach dem Stand der Technik gut bekannt sind, und daß die erfindungsgemäßen Verfahren nicht auf diese spe ziellen Verfahren beschränkt sind.The DNA with a base sequence that is therapeutic suitable glutaminase or the corresponding polypeptide can be coded from any microbial, animal or plant cell using oligonucleotide Son those according to the known glutaminase protein sequences were prepared, isolated. The DNA is preferred isolated from Pseudomonas 7A cells. It is too ver stand that the procedures and conditions in the one individual process steps, which are explained in more detail below are well known in the art, and that the inventive method does not spe to this spe are restricted to certain methods.
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Figuren näher er läutert. Es bedeuten:The invention will be described with reference to the accompanying figures purifies. It means:
Fig. 1 die Nucleotid- und Peptidsequenz des N-Terminus des Gens für Pseudomonas 7A-Glutaminase, Fig. 1 shows the nucleotide and peptide sequence of the N-terminus of the gene for Pseudomonas 7A glutaminase,
Fig. 2 das Vorgehen bei der Konstruktion des Plasmids zur Expression der Pseudomonas 7A-Glutaminase, Fig. 2 shows the procedure for construction of plasmid for expression of the Pseudomonas 7A glutaminase,
Fig. 3 die Restriktionskarte des zur Expression in Escherichia coli geänderten Pseudomonas 7A-Glutaminase gens und FIG. 3 shows the restriction map of Pseudomonas 7A-glutaminase gens modified for expression in Escherichia coli and FIG
Fig. 4 das Induktionsprofil der PGA-Expression. Fig. 4 shows the induction profile of PGA expression.
Chromosomale DNA wurde aus Pseudomonas 7A (ein aus dem Boden isolierter Organismus, der bei der American Type Cul ture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 29598 hinterlegt wurde), im wesentlichen wie beschrieben (Strom M. und Lory S. (1986): J. Bacteriol. 165: 367-372), isoliert und wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A teilabgebaut. Fragmente dieses Abbaus mit durchschnittlich 5-10 Kbp wur den mittels präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert und in die BamHI-Schnittstelle des Vektors pBR322 kloniert. Die entstandene Genbank (in E. coli-Stamm LE392) wurde unter Verwendung gemischter Oligonucleotid-Sonden abgesucht (Wallace R.B., Johnson M.J., Hirose T., Miyake T., Kawa shima E.H. und Itakura K. (1981): Nucleic Acids Res. 9: 879- 89; und Paddock G.V. (1987): Biotechniques 5: 13-16). Es wurde die Information über die Peptid-Teilsequenz erhalten und verwendet, um die drei in Tabelle 1 gezeigten Oligo nucleotid-Sonden abzuleiten. Die Oligonucleotid-Sonden wur den für die Peptidsequenz des Amino-Terminus des Enzyms (Sonde A), des Carboxyl-Terminus (Sonde C) und für ein Pep tid in der Nähe der Mitte des Proteins (Sonde B) ausge wählt. Sonde B wurde von dem anfänglichen Absuchen von 3560 Ampicillin-resistenten Transformanten ausgewählt. Ausgehend von dem anfänglichen Absuchen wurden zwei Hybridisations positive Klone identifiziert. Diese wurden unter Verwendung der Sonden A und C nochmals abgesucht. Beide Klone hybridi sierten mit Sonde A, aber nur einer der Klone, pKD2, hybri disierte mit Sonde C. Weil pKD2 mit allen drei Sonden hybridisiert hatte, wurde er für die weitere Analyse ausge wählt.Chromosomal DNA was prepared from Pseudomonas 7A (one of the Ground isolated organism found in the American Type Cul ture Collection under the accession number ATCC 29598 deposited), essentially as described (current M. and Lory S. (1986): J. Bacteriol. 165: 367-372), isolated and was partially digested with the restriction enzyme Sau3A. Fragments of this degradation averaging 5-10 Kbp wur isolated by preparative agarose gel electrophoresis and cloned into the BamHI site of the vector pBR322. The resulting library (in E. coli strain LE392) was using mixed oligonucleotide probes (Wallace R.B., Johnson M.J., Hirose T., Miyake T., Kawa shima E.H. and Itakura K. (1981): Nucleic Acids Res. 9: 879- 89; and Paddock G.V. (1987): Biotechniques 5: 13-16). It the information on the peptide partial sequence was obtained and used the three oligo shown in Table 1 Derive nucleotide probes. The oligonucleotide probes were used for the peptide sequence of the amino terminus of the enzyme (Probe A), the carboxyl terminus (probe C) and for a Pep tid near the center of the protein (probe B) chooses. Probe B was recovered from the initial scan of 3560 Ampicillin-resistant transformants selected. outgoing from the initial screening, two were hybridized identified positive clones. These were using probed the probes A and C again. Both clones hybridi probed with probe A, but only one of the clones, pKD2, hybri dissected with probe C. Because pKD2 with all three probes hybridized, it was left out for further analysis chooses.
Rohe Zellextrakte des Stammes LE392, der mit dem Plasmid pKD2 transformiert worden war, wurden dadurch hergestellt, daß man Aliquote einer Übernachtkultur in einer French Pressure Cell aufbrach und das Homogenat bei 15 000 UpM zur Entfernung nichtaufgebrochener Zellen und Zelltrümmer zen trifugierte. Der entstandene Überstand wurde auf die Gluta minaseaktivität durch direkte Analyse mittels Nessler′s Reagens auf Ammoniak untersucht (Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 2119-2123). Um die störende Aktivität bei der E. coli-Glutaminaseenzyme zu minimieren, wurde der Enzymassay bei pH 8,0 unter Verwendung von D-Glutamin als Substrat durchgeführt. Keines der beiden E. coli-Enzyme ist unter diesen Bedingungen aktiv, während die Pseudmonas 7A- Glutaminase (PGA) 87% ihrer Aktivität behält (Pruisner S., Davis J.N., Stadtman E.R. (1976): J. Biol. Chem. 251: 3447- 3456; und Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 2119-2123). Kontrollversuche mit rohen Zellextrakten bestätigten die Wirksamkeit dieses Assays, um die PGA-Aktivität in Abwesen heit der E. coli-Glutaminaseaktivität zu messen.Crude cell extracts of the strain LE392, which interact with the plasmid pKD2 was transformed by that you aliquot an overnight culture in a French Pressure cell broke and the homogenate at 15 000 rpm Removal of unbroken cells and cell debris trifugierte. The resulting supernatant was on the gluta minaseactivity through direct analysis using Nessler's Reagent for ammonia (Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 2119-2123). To the disturbing activity at to minimize the E. coli glutaminase enzymes, was the Enzyme assay at pH 8.0 using D-glutamine as Substrate performed. Neither of the two E. coli enzymes is active under these conditions, while the pseudmonas 7A- Glutaminase (PGA) retains 87% of its activity (Pruisner S., Davis J.N., Stadtman E.R. (1976): J. Biol. Chem. 251: 3447- 3456; and Roberts J. (1976): J. Biol. Chem. 251: 2119-2123). Control experiments with crude cell extracts confirmed the Effectiveness of this Assay on Downtime PGA Activity unit of E. coli glutaminase activity.
Um die Identität des vermutlichen PGA-Klons zu bestätigen, wurde die homologe Region der zum Absuchen verwendeten Son den mittels Southern Blot-Analyse lokalisiert, und geeig nete Fragmente wurden teilsequenziert. Diese Analyse iden tifizierte ein 1,1 Kbp SalI-Fragment, das mit Sonde A hybridisierte, und ein 1,5 Kbp SalI-Fragment, das mit Sonde B hybridisierte. Dies zeigte an, daß es eine SalI-Schnitt stelle im Gen gab und daß die Sequenzierung von dieser Sequenz aus unmittelbar die Identität des Gens als PGA durch Vergleich der Nucleotidsequenz mit der bekannten Ami nosäuresequenz bestätigen würde. Die zwei SalI-Fragmente wurden somit in M13mp8 kloniert und mittels des Kettenter minationsverfahrens nach Sanger sequenziert (Sanger F., Nicklen S. und Coulson A.R. 1977): Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Es wurde gefunden, daß das 1,1 Kbp SalI- Fragment für das N-terminale, 42 Aminosäuren lange Ende des reifen Proteins codiert, und eine 23 Aminosäuren lange mög liche Signalsequenz wurde identifiziert, der eine potenti elle Ribosomen-Bindungsstelle folgt. Die erhaltenen Se quenzdaten sind in Fig. 1 dargestellt. Die Aminosäurereste, die sich von der bekannten Peptidsequenz-Information unter scheiden, sind unterstrichen. Die in Fig. 1 dargestellte Sequenz ist von dem N-terminalen Lysin des reifen Proteins aus gezählt - die vermutliche Sekretions-Signalsequenz ist nicht gezeigt. Auf der Basis dieser Sequenz-Information wurde gefolgert, daß das PGA-Gen kloniert worden war.To confirm the identity of the putative PGA clone, the homologous region of the probes used for screening was localized by Southern blot analysis, and suitable fragments were partially sequenced. This analysis identified a 1.1 Kbp SalI fragment that hybridized with probe A and a 1.5 Kbp SalI fragment that hybridized with probe B. This indicated that there was a SalI site in the gene and that sequencing from this sequence would directly confirm the identity of the gene as PGA by comparing the nucleotide sequence with the known amino acid sequence. The two SalI fragments were thus cloned into M13mp8 and sequenced by the Sanger chain-termination method (Sanger F., Nicklen S. and Coulson AR 1977): Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). The 1.1 Kbp SalI fragment was found to encode the N-terminal 42 amino acid end of the mature protein and a 23 amino acid long signal sequence was identified, followed by a potent ribosome binding site. The obtained Se sequence data are shown in Fig. 1. The amino acid residues that differ from the known peptide sequence information are underlined. The sequence shown in Figure 1 is counted from the N-terminal lysine of the mature protein - the putative secretory signal sequence is not shown. Based on this sequence information, it was concluded that the PGA gene had been cloned.
Um kontrollierte Expression des klonierten PGA-Gens in hoher Konzentration zu erhalten, wurde beschlossen, den Pseudomonas-Promotor durch den, der in E. coli erkannt wird, zu ersetzen. Das Gen wurde an den Lambda-Phagen PL- Promotor ligasiert, der nur bei ausreichend hoher Tempera tur (beispielsweise 37 bis 40°C) die Funktion, den Lambda- cI-Repressor zu unterdrücken, zeigt. Promotoren, die in gleicher Weise verwendet werden können, umfassen beispiels weise den tac-Promotor (ein hybrider lac-Promotor) und das T7-RNA-Polymerase/Promotor-System (Molecular Cloning - A laboratory manual, 2. Ausgabe, Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Buch 3, S. 17.2-17.44). Zu dieser Konstruktion wurde pPL322 verwendet. Dies ist ein Expressionsvektor, in den der Lambda-PL-Promo tor in die EcoRI- und HindIII-Schnittstellen von pBR322 inseriert sind. Dieser Vektor plaziert jedes Strukturgen, das die korrekten Translationssignale enthält, unter die Kontrolle des Lambda-PL-Promotors, wenn das Gen in die HindIII-Restriktions-Schnittstelle in korrekter Orientie rung ligasiert wird. Zur Verwendung dieses Vektors sind zwei Lambda-Lysogene erforderlich, N99cI+, welches das Wildtyp-cI-Repressorgen trägt und die Expression negativ reguliert, und N4830, das das temperaturempfindliche cI857- Allel des Repressorgens trägt. Somit tritt, wenn ein Expressionsvektor in dem Stamm N4830 bei 28°C gezüchtet wird, keine Expression eines Gens unter der Kontrolle des Lambda-PL-Promotors ein, aber nach Verschiebung auf 37°C beginnt die Lambda-regulierte Expression. Zusätzlich zur Verwendung des Lambda-PL-Expressionssystems wurde beschlos sen, das reife Protein zu exprimieren, anstatt sich darauf zu verlassen, daß das Protein in E. coli unter Verwendung des Pseudomonas-Sekretionssignals korrekt weiterverarbeitet und sezerniert wird.In order to obtain controlled expression of the cloned PGA gene in high concentration, it was decided to substitute the Pseudomonas promoter for that recognized in E. coli. The gene was ligated to the lambda phage P L promoter, which shows the function of suppressing the Lambda cI repressor only at a sufficiently high temperature (for example 37 to 40 ° C). Promoters that can be used equally include, for example, the tac promoter (a hybrid lac promoter) and the T7 RNA polymerase / promoter system (Molecular Cloning - A laboratory manual, 2nd ed., Sambrook, Fritsch Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Book 3, pp. 17-2-17.44). PPL322 was used for this construction. This is an expression vector into which the lambda PL promoter is inserted into the EcoRI and HindIII sites of pBR322. This vector places any structural gene containing the correct translational signals under the control of the lambda P L promoter when the gene is ligated into the HindIII restriction site in the correct orientation. The use of this vector requires two lambda lysogens, N99cI +, which carries the wild-type cI repressor gene and negatively regulates expression, and N4830, which carries the temperature-sensitive cI857 allele of the repressor gene. Thus, when an expression vector is grown in strain N4830 at 28 ° C, expression of a gene under control of the lambda P L promoter does not occur, but upon shift to 37 ° C, lambda regulated expression begins. In addition to using the lambda P L expression system, it was decided to express the mature protein instead of relying on the protein in E. coli to be correctly processed and secreted using the Pseudomonas secretion signal.
Das entstandene Plasmid wurde, wie unten beschrieben und in Fig. 2 näher erläutert, konstruiert. Das 1,1 Kbp SalI-Frag ment, das für die Amino-terminalen 42 Aminsoäuren des PGA- Gens codiert, wurde einer Oligonucleotid-Mutagenese unter Verwendung der Technik von Zoller und Smith (Zoller M.J. und Smith M. (1983): Methods Enzymol. 100: 468-685) unter worfen. Eine einzige EcoRI-Schnittstelle wurde unmittelbar stromaufwärts des für das N-terminale Lysin codierenden Tripletts unter Verwendung eines Oligonucleotids mit fünf Fehlpaarungen erzeugt. Dieses Schema wurde so entwickelt, daß Ligasierung einer im Handel erhältlichen "tragbaren Translations-Initiations-Stelle" (PTIS - Pharmacia, Inc.) in die entstandene EcoRI-Schnittstelle möglich war, so daß das benötigte Start-f-Methionin translationell in dem kor rekten Leseraster war. Die entstandene N-terminale Sequenz des gebildeten Proteins lautete dann wie folgt: met-asn- ser-lys-glu-val. Somit wurden also Asparagin- und Serin reste dem reifen Protein zusätzlich zu dem Methionin hin zugefügt. Bei Klonierung in die EcoRI-Restriktions-Schnitt stellen stellt der PTIS-Linker nicht nur die notwendige ribosomale Bindungsstelle und das Translations-Startcodon dar, sondern auch eine HindIII-Restriktions-Schnittstelle stromaufwärts von der ribosomalen Bindungsstelle zur leich teren Kopplung an die einzige HindIII-Schnittstelle in pPL322 dar. Das Plasmid, welches die PTIS und den N-termi nalen Teil des vermutlichen PGA-Gens enthält, wurde pRK102 genannt: Das entstandene HindIII bis SalI-Fragment von pRK102 wurde in die HindIII bis SalI-Schnittstellen von pPL322 unter Erhalt des in Fig. 2 gezeigten Plasmids pRK103 kloniert. Um das defekte PGA-Gen "zu reparieren", wurde das 1,5 Kbp SalI-Fragment anschließend in die einzige SalI- Schnittstelle von pRK103 in korrekter Orientierung unter Erhalt des Plasmids pRK104 kloniert. Dieses Plasmid wurde anschließend verwendet, um auf die Glutaminaseaktivität zu testen. Eine Restriktionskarte des PGA-Gens und des Lambda- Promotorteils von Plasmid pRK104 ist in Fig. 3 gezeigt.The resulting plasmid was constructed as described below and further illustrated in FIG . The 1.1 Kbp SalI fragment encoding the amino terminal 42 amino acids of the PGA gene was subjected to oligonucleotide mutagenesis using the technique of Zoller and Smith (Zoller MJ and Smith M. (1983): Methods Enzymol 100: 468-685). A single EcoRI site was generated immediately upstream of the triplet encoding the N-terminal lysine using a five mismatched oligonucleotide. This scheme was developed to allow ligation of a commercially available "portable translation initiation site" (PTIS-Pharmacia, Inc.) into the resulting EcoRI site such that the required starting f-methionine is translational in the cor was right reading frame. The resulting N-terminal sequence of the protein formed was then as follows: met-asnser-lys-glu-val. Thus, asparagine and serine residues were added to the mature protein in addition to the methionine. When cloned into the EcoRI restriction sites, the PTIS linker not only provides the necessary ribosomal binding site and translation initiation codon, but also a HindIII restriction site upstream of the ribosomal binding site for easier coupling to the unique HindIII restriction site. The plasmid containing the PTIS and the N-terminal portion of the putative PGA gene was named pRK102: The resulting HindIII to SalI fragment of pRK102 was ligated into the HindIII to SalI sites of pPL322 of plasmid pRK103 shown in FIG. 2. To "repair" the defective PGA gene, the 1.5 Kbp SalI fragment was then cloned into the only SalI site of pRK103 in the correct orientation to give the plasmid pRK104. This plasmid was then used to test for glutaminase activity. A restriction map of the PGA gene and the lambda promoter portion of plasmid pRK104 is shown in FIG .
Um die induzierbare Expression der PGA-Aktivität von dem Plasmid pRK104 zu untersuchen, wurde das Plasmid in den Stamm N4830 transformiert. Kulturen für das Inokulum wurden über Nacht bei 30°C in LB (Luria-Bouillon, enthaltend 50 µg Ampicillin/ml) gezüchtet und anschließend in das gleiche Medium, welches 725 µg Glutamin/ml und 1,0% Glucose ent hielt, transferiert. Diese Kultur wurde bei 30°C gezüchtet, bis die Kultur die mid-log-Wachstumsphase erreichte, und anschließend wurde ein Teil der Kultur durch Verschiebung der Inkubationstemperatur auf 37°C induziert. Proben wurden zur Analyse nach 1- und 2stündiger Inkubation entnommen. Die Zellproben wurden entnommen, und die Rohextrakte wur den, wie zuvor für die Enzymanalyse beschrieben, herge stellt. Die Expression von PGA bei der permissiven Tempe ratur von 37°C betrug das 10fache im Vergleich zu der bei der restriktiven Temperatur von 30°C. Das exprimierte Pro tein zeigte Funktion, wie durch die Fähigkeit des aus E. coli, welcher das PGA-Gen enthielt, isoliertem Rohextrakt, L-Glutamin in L-Glutamat plus Ammoniak umzuwandeln, gezeigt wurde. Um sicherzustellen, daß die beobachtete Aktivität von der Pseudomonas-Glutaminase im Gegensatz zu den endoge nen E. coli-Glutaminasen A und B stammte, wurde die Reak tion mit D-Glutamin bei pH 8 wiederholt. Nur das Pseudomo nas-Enzym funktioniert unter diesen Bedingungen. In der Tat wandelt es D-Glutamin in Glutamat mit 87% der Effizienz, mit der es L-Glutamin umwandelt, um. Die Ergebnisse zeigen, daß die gesamte meßbare Aktivität von PGA stammt. Protein assays nach Lowry wurden auch an den rohen Zellextrakten durchgeführt, um die Berechnung der Enzymaktivität als spe zifische Aktivität zu gestatten. Proben jedes Extrakts wur den auch auf SDS-PAGE-Gelen, im wesentlichen wie von Laemmli (Laemmli U.K. (1970): Nature (London) 227: 680-685) beschrieben, durchgeführt. Die entstandene Enzym-Indukti onskurve ist in Fig. 4 dargestellt, worin die Erhöhung der Glutaminaseaktivität in dem Zellextrakt unter Verwendung von D-Glutamin als Substrat gezeigt ist. Wie aus der Figur hervorgeht, steigt die Aktivität gegen D-Glutamin um über das 10fache nach Temperaturinduktion, während die nichtin duzierte Kontrollkultur im wesentlichen keine Erhöhung der D-Glutaminaseaktivität zeigt. Eine zweite Kontrollkultur, welche ein Plasmid mit dem 1,5 Kbp SalI-Fragment in umge kehrter Orientierung enthält (die Daten sind nicht ge zeigt), wurde angesetzt, und keine signifikante D-Gluta minaseaktivität wurde bei diesem Plasmid unter beliebigen Bedingungen detektiert.To study the inducible expression of PGA activity from plasmid pRK104, the plasmid was transformed into strain N4830. Cultures for the inoculum were grown overnight at 30 ° C in LB (Luria broth containing 50 μg ampicillin / ml) and then transferred to the same medium containing 725 μg glutamine / ml and 1.0% glucose. This culture was cultured at 30 ° C until the culture reached the mid-log growth phase, and then a part of the culture was induced by shifting the incubation temperature to 37 ° C. Samples were taken for analysis after 1 and 2 hours of incubation. The cell samples were removed and the crude extracts were prepared as described previously for enzyme analysis. The expression of PGA at the permissive temperature of 37 ° C was 10 times compared to that at the restrictive temperature of 30 ° C. The expressed protein showed function as evidenced by the ability of the crude extract isolated from E. coli containing the PGA gene to convert L-glutamine to L-glutamate plus ammonia. To ensure that the observed activity was from Pseudomonas glutaminase as opposed to the endogenous E. Coli glutaminases A and B, the reaction with D-glutamine was repeated at pH 8. Only the pseudomonas enzyme works under these conditions. In fact, it converts D-glutamine into glutamate at 87% of the efficiency with which it converts L-glutamine. The results show that all measurable activity is from PGA. Lowry protein assays were also performed on the crude cell extracts to allow the calculation of enzyme activity as specific activity. Samples of each extract were also run on SDS-PAGE gels essentially as described by Laemmli (Laemmli UK (1970): Nature (London) 227: 680-685). The resulting enzyme induction curve is shown in Figure 4, which shows the increase in glutaminase activity in the cell extract using D-glutamine as the substrate. As can be seen from the figure, the activity against D-glutamine increases more than 10-fold after temperature induction, whereas the uninduced control culture shows substantially no increase in D-glutaminase activity. A second control culture containing a plasmid with the 1.5 Kbp SalI fragment in the reverse orientation (data not shown) was set up and no significant D-glutamine activity was detected on this plasmid under any conditions.
Die beiden E. coli-Kulturen (ECrecPGA1 und ECrecPGA2), die mit dem Plasmid pRK104 transformiert worden sind, wurden am 12. November 1991 bei Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, D-3300 Braun schweig, unter den Hinterlegungsnummern DSM 6787 und DSM 6789 hinterlegt. Beide Kulturen sind Gal-. The two E. coli cultures (ECrecPGA1 and ECrecPGA2) transformed with the plasmid pRK104 were silent on November 12, 1991 at Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, D-3300 Braun, under the accession numbers DSM 6787 and DSM 6789 deposited. Both cultures are Gal - .
ECrecPGA1 ist geeignet zur Herstellung von Plasmidpräpara tionen und kann bei 37°C in LB-Bouillon oder in einem ande ren geeigneten Medium gezüchtet werden.ECrecPGA1 is suitable for the preparation of Plasmidpräpara at 37 ° C in LB broth or in another be grown suitable medium.
ECrecPGA2 benötigt Histidin, Isoleucin, Valin und Leucin zum Wachstum. Diese Kultur ist geeignet, um große Mengen des Glutaminaseenzyms herzustellen. Sie sollte bei 28 bis 30°C gezüchtet werden und dann auf 37°C zur Enzyminduktion transferiert werden. Dieser Organismus enthält das cIS57- Allel des Repressorgens, das allgemein verwendet wird, um die Expression zur Bildung von Proteinen in E. coli zu re gulieren. Dieses Allel ist temperatursensitiv und erzeugt ein funktionelles Repressorprotein nur bei Temperaturen 30°C; oberhalb dieser Temperatur wird das Protein funkti onslos, und die Transkription wird initiiert.ECrecPGA2 requires histidine, isoleucine, valine and leucine to growth. This culture is suitable for large quantities of the glutaminase enzyme. She should be at 28 to 30 ° C and then to 37 ° C for enzyme induction be transferred. This organism contains the cIS57 Allele of Repressorgens commonly used to to repress expression for the production of proteins in E. coli gulieren. This allele is temperature sensitive and generates a functional repressor protein only at temperatures 30 ° C; above this temperature the protein will function onslos, and transcription is initiated.
Menschliche Melanomzellen wurden in vitro 30 Minuten entwe der mit freiem Antikörper, freier Glutaminase oder einem kovalent gebundenen Antikörper-Glutaminase-Komplex inku biert. Der kovalent gebundene Antikörper-Glutaminase-Kom plex wurde gemäß an sich bekannten Techniken hergestellt. Die Zellen wurden gewaschen und in frische Gewebskulturme dien gegeben, und die 3H-Thymidin-Inkorporation wurde ge messen. Nur die Zellen, die mit dem Antikörper-Glutaminase- Komplex inkubiert worden waren, zeigten eine Inhibierung der 3H-Thymidin-Aufnahme, was anzeigt, daß der Antikörper- Glutaminase-Komplex an die Zellen gebunden worden war und die DNA-Synthese inhibierte.Human melanoma cells were incubated in vitro for 30 minutes either with free antibody, free glutaminase or a covalently bound antibody-glutaminase complex. The covalently bound antibody-glutaminase complex was prepared according to techniques known in the art. The cells were washed and placed in fresh tissue culture media and 3 H-thymidine incorporation was measured. Only the cells incubated with the antibody-glutaminase complex showed inhibition of 3 H-thymidine uptake, indicating that the antibody-glutaminase complex had been bound to the cells and inhibited DNA synthesis.
Claims (38)
- a) chromosomale DNA, die aus mikrobiellen, tieri schen oder pflanzlichen Zellen isoliert wurde, mit Sau3A oder einem anderen geeigneten Restriktionsenzym teilweise abbaut,
- b) eine Genbank aus der Fraktion gemäß (a) her stellt;
- (c) die Genbank mit bekannten Oligonucleotid-Sonden, deren Sequenzen entweder dem Amino-Terminus oder dem Carboxyl-Terminus oder dem Mittelteil einer bekannten Glutaminase entsprechen, absucht;
- d) ein Plasmid, das gleichzeitig mit der Oligo nucleotid-Sonde des Amino-Terminus, des Mittelteils und des Carboxyl-Terminus der Glutaminase hybridisiert, gewinnt;
- e) das rekombinante Plasmid in einen Expressionsvek tor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors inse riert; und
- f) den rekombinanten Vektor in einen Wirt zu dessen Transformation einführt.
- a) partially degrades chromosomal DNA isolated from microbial, animal or plant cells with Sau3A or another suitable restriction enzyme,
- b) produces a gene bank from the fraction in (a);
- (c) searching the library with known oligonucleotide probes whose sequences correspond to either the amino terminus or the carboxyl terminus or the middle part of a known glutaminase;
- d) a plasmid which hybridizes simultaneously with the oligo nucleotide probe of the amino terminus, the middle part and the carboxyl terminus of glutaminase wins;
- e) inserting the recombinant plasmid into an expression vector under the control of a suitable promoter; and
- f) introducing the recombinant vector into a host for its transformation.
- a) chromosomale DNA, die aus mikrobiellen, tieri schen oder pflanzlichen Zellen isoliert wurde, mit Sau3A oder einem anderen geeigneten Restriktionsenzym teilweise abbaut;
- b) eine Genbank aus der Fraktion gemäß (a) her stellt,
- c) die Genbank mit bekannten Oligonucleotid-Sonden, deren Sequenzen entweder dem Amino-Terminus oder dem Carboxyl-Terminus oder dem Mittelteil einer bekannten Glutaminase entsprechen, absucht;
- d) ein Plasmid, das gleichzeitig mit der Oligo nucleotid-Sonde des Amino-Terminus, des Mittelteils und des Carboxyl-Terminus der Glutaminase hybridisiert, gewinnt;
- e) das rekombinante Plasmid in einen Expressionsvek tor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors inse riert;
- f) den rekombinanten Vektor in einen Wirt zu dessen Transformation einführt;
- g) den Transformanten kultiviert; und
- h) das entstandene Polypeptid mit einer Aminosäure sequenz, die die Aktivität einer therapeutisch geeigneten Glutaminase besitzt, gewinnt.
- a) partially degrades chromosomal DNA isolated from microbial, animal or plant cells with Sau3A or another suitable restriction enzyme;
- b) produces a gene bank from the fraction according to (a),
- c) scanning the library with known oligonucleotide probes whose sequences correspond to either the amino terminus or the carboxyl terminus or the middle part of a known glutaminase;
- d) a plasmid which hybridizes simultaneously with the oligo nucleotide probe of the amino terminus, the middle part and the carboxyl terminus of glutaminase wins;
- e) inserting the recombinant plasmid into an expression vector under the control of a suitable promoter;
- f) introducing the recombinant vector into a host for its transformation;
- g) cultivating the transformant; and
- h) the resulting polypeptide with an amino acid sequence which has the activity of a therapeutically suitable glutaminase wins.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2004108153A1 (en) * | 2003-06-11 | 2004-12-16 | Medical Enzymes Ag | Combined pharmaceutical preparations for the treatment of cancer, containing glutaminase and antineoplastic anthracyclines or platinum compounds |
-
1991
- 1991-12-04 DE DE4140003A patent/DE4140003C2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NICHTS ERMITTELT * |
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|---|---|---|---|---|
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| DE4140003C2 (en) | 1994-09-29 |
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