DE4119395A1 - Monoklonaler antikoerper, der gegen delta-bilirubin spezifisch ist, seine verwendung zur bestimmung von delta-bilirubin und hierfuer vorgesehener analysekit - Google Patents

Description

Bilirubin, das Abbauprodukt des Hämoglobins, umfaßt vier Fraktionen. Unkonjugiertes Bilirubin ist eine lipophile, neurotoxische Fraktion. Zuckerkonjugiertes Bilirubin, das entweder mono- oder dikonjugiert sein kann, ist hydrophil und nicht-toxisch. Die vierte Fraktion, die als delta-Bilirubin bekannt ist, wurde erstmalig im Jahre 1981 identifiziert. In der Natur ist sie kovalent an Albuminprotein gebunden.

Delta-Bilirubin hat sich als klinisch bedeutsam erwiesen. Es kann bei der Diagnose einer Anzahl von hepatobiliären Erkran­ kungen eingesetzt werden, insbesondere bei Verschlußikterus.

Vor kurzem wurde festgestellt, daß δ-Bilirubin bei der Frühdiagnose von Abstoßungsreaktionen bei Lebertransplantaten wichtig ist (Clinical Chemistry, Vol. 36 : 9-14, 1990).

Die Lebertransplantation ist eine akzeptierte Therapieform bei unter Lebererkrankungen leidenden Patienten; es besteht jedoch ein Bedarf an nicht-invasiven Tests, die eine Abstoßung anzeigen können. Die postoperative quantitative Bestimmung von Enzymen, z. B. von Aspartat-Transaminasen und alkalischen Phosphatasen, gestattet keine hinreichende Unterscheidung zwischen Abstoßungen und Infektionen bei Leberpatienten. Die Bestimmung von δ-Bilirubin, entweder allein oder zusammen mit konjugiertem Bilirubin, hat sich als ein ungewöhnlich empfindlicher Nachweis der Leberfunktion oder -dysfunktion erwiesen. Ein Abfall der δ-Bilirubinfraktion mit einem gleichzeitigen Anstieg der Menge des konjugierten Bilirubins, oder ein ständig niedriger δ-Bilirubinwert (weniger als 30% des Gesamtbilirubins) ist ein spezifisches Indiz für eine Leberabstoßung. Die Funktion des δ-Bilirubins als ein präziser Prognoseindikator bei Leberpatienten und weiterhin als Index für die Rückbildung der Gelbsucht führte zu einem Bedarf an einer genauen, spezifischen Methode für seine Bestimmung.

Es sind bereits Verfahren für die Bestimmung und Quantifizie­ rung von δ-Bilirubin entwickelt worden; der Einsatz dieser Verfahren ist jedoch hinsichtlich der Effizienz, der Genauig­ keit und insbesondere der Spezifizität begrenzt. Ein Verfahren unter Einsatz der Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) wurde eingeführt (Lauff et al., CRC Series on Liquid Chromat­ ography (1984), Vol. 11, S. 32-39), hat sich jedoch als eine mühevolle Meßmethode erwiesen. Weiterhin ist das HPLC-Verfah­ ren für den präzisen diagnostischen Einsatz nicht empfindlich genug. Dünnschicht-Ausstrichverfahren, bei denen delta-Biliru­ bin indirekt berechnet wird, sind analytisch weniger genau als das HPLC-Verfahren. Andere analytische Methoden, z. B. Methoden auf der Basis von Diazoverbindungen, die in der Vergangenheit eingesetzt wurden, haben sich als zur Bestimmung von delta-Bi­ lirubin wenig erfolgreich erwiesen, weil dieses während der Proteinentfernung aus der Probe infolge der kovalenten Ver­ knüpfung des Bilirubins mit Albumin verlorengeht. Albumin ist ein sehr großes Molekül mit einem Molekulargewicht von 69.000 Dalton; dagegen beträgt das Molekulargewicht des Bilirubins lediglich 584,7 Dalton. Im Ergebnis besteht die Tendenz, daß Bilirubin vor Reagenzien versteckt oder maskiert wird, und zwar innerhalb der "Falten" des Albuminproteins, das häufig aus der Probe während der Bilirubinanalyse unter Verwendung von Methoden auf Diazobasis aus der Probe ausgefällt wird.

Um die Nachteile der gegenwärtig vorhandenen Methoden für die Bestimmung von δ-Bilirubin zu beheben, ist ein genaues, spezifisches Mittel für die Bestimmung von delta-Bilirubin erforderlich.

Ein gegen Bilirubin spezifischer monoklonaler Antikörper ist vor kurzem hergestellt worden (Chemical Abstracts, Vol. 104, 1986). Dieser Antikörper ist jedoch nicht wirksam gegenüber der δ-Bilirubinfraktion des Bilirubins. Delta-Bilirubin unterscheidet sich von anderen Bilirubin-Formen infolge seiner spezifischen, kovalenten Bindung an Albumin.

Andere Anti-Bilirubin-monoklonale Antikörper sind hergestellt worden, die spezifisch gegen haptenisches Bilirubin eines Bilirubin-Albumin-Komplexes sind (Shimizu, S. et al., Bi­ ochimica et Biophysica Acta, 967, 1988). Der Bilirubin- Albumin-Komplex enthält jedoch durchschnittlich 8 bis 11 Bilirubine pro Molekül des Serumalbumins. Im Gegensatz hierzu umfaßt authentisches Bilirubin, gegen das der monoklonale Antikörper der Erfindung gerichtet ist, einen 1 : 1-molekularen Komplex von Bilirubin und Albumin, bei dem die Bindung ko­ valent ist und in der Nähe der Reste 95 bis 297 vom N-termi­ nalen Ende des Albuminproteins liegt.

Die vorliegende Erfindung ist auf einen monoklonalen Antikör­ per gerichtet, der unter Verwendung der Hybridomtechnologie hergestellt wird und spezifisch gegen authentisches δ-Bi­ lirubin ist. Die zwei Komponenten des δ-Bilirubins, Albumin und Bilirubin, scheinen mittels einer Amidbindung zwischen einer freien Propionsäure-Seitenkette des Bilirubins und einer ε-Aminogruppe eines Lysinrestes innerhalb des Albuminproteins kovalent gebunden zu sein. Umfassende Untersu­ chungen durch den hier benannten Erfinder haben zu der Identi­ fizierung der spezifischen, kovalenten Verknüpfungsregion an dem Albuminmolekül geführt. Die hochspezifische Natur der kovalenten Bindung zwischen Albumin und Bilirubin ist charak­ teristisch für δ-Bilirubin. Es wird angenommen, daß diese Bindung die Antigen-Determinante ist, die von dem monoklonalen Antikörper erkannt wird. Andere Formen des Bilirubins, sowohl konjugierte als auch unkonjugierte, weisen diese spezifische Bindung an Albumin nicht auf und reagieren weiterhin nicht in nennenswertem Umfang mit dem monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung.

Demgemäß ist die Erfindung auf einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment desselben, der durch eine Antigen-Bindungs­ stelle gekennzeichnet ist, welche spezifisch gegenüber δ- Bilirubin ist, gerichtet.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Immunoassay-Verfahren zur Bestimmung und Quantifizierung von δ-Bilirubin in einer biologischen Probe, bei dem die Probe mit dem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment desselben in Berührung gebracht wird, wobei der monoklonale Antikörper bzw. das Fragment eine Antigen-Bindungsstelle aufweist, die spezifisch gegenüber δ-Bilirubin ist, und bei dem die Menge des genannten Antikörpers, der sich in der Folge mit dem δ-Bilirubin der biologischen, zu analysierenden Probe verbindet, bestimmt wird. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Analysekit zur Verwendung in einem derartigen Verfahren.

Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird zur Bildung der gewünschten monoklonalen Antikörper die Hybridomtechnologie eingesetzt. Die Immuni­ sierung von Versuchstieren mit dem Antigen, menschlichem δ-Bilirubin, bewirkt eine Immunantwort, bei der spezifisch gegen δ-Bilirubin gerichtete Antikörper gebildet werden. Lymphozyten, die Antikörper ausscheidenden Blutzellen, werden unter Einwirkung des Antigens zur Teilung stimuliert, und als Ergebnis werden Lymphozytenklone gebildet, die einen einzigen Typ von Antikörpern produzieren, insbesondere einen gegen δ-Bilirubin gerichteten Antikörper.

Als Ergebnis des Immunisierungsverfahrens gebildete Lymphozy­ ten werden aus dem immunisierten Tier isoliert und mit Myelom­ zellen kombiniert. Die Fusion der Myelomzellen mit Lymphozyten unter Bildung von Hybridomzellen können durch ein die Fusion förderndes Mittel (Fusogen), insbesondere ein chemisches Fusogen, stimuliert werden. Ein besonders bevorzugtes chemisches Fusogen ist Polyethylenglykol. Die Selektion auf fusionierte Hybridomzellen durch Suspension der Zellen in geeigneten Selektionsmedien gestattet die Züchtung von aus­ schließlich immortalen, fusionierten Zellen. Das bevorzugt eingesetzte Selektionsmedium enthält Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin und ist allgemein bekannt unter der Bezeichnung HAT-Medium. Das weitere Screening auf Hybridome, die den monoklonalen Antikörper der Erfindung bilden können, kann durch enzymabhängige Immunosorptionsverfahren (ELISA) erfol­ gen.

Bei der Charakterisierung und Isolierung einer Hybridom-Zelli­ nie, die gegenüber δ-Bilirubin spezifische monoklonale Antikörper bildet, kann der gebildete Antikörper selbst isoliert und zur Bestimmung und Quantifizierung von δ-Bi­ lirubin in biologischen Proben eingesetzt werden. Hierzu sind verschiedene Immunoassay-Methoden bekannt und beschrieben (Talwar, G.P., Non-Isotopic Immunoassays and their Appli­ cations). Diese Immunoassays können angepaßt werden, um bei der Bestimmung und Quantifizierung von δ-Bilirubin in einer biologischen Probe unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers der Erfindung eingesetzt zu werden.

Eines dieser Verfahren umfaßt die Markierung des monoklonalen Antikörpers bzw. eines Fragments desselben, der eine gegen delta-Bilirubin spezifische Antigen-Bindungsstelle aufweist, mit einer meßbaren Markerverbindung, die Reaktion des markier­ ten Antikörpers mit der zu analysierenden biologischen Probe, und die Bestimmung der sich ergebenden Menge des markierten Antikörper-δ-Bilirubin-Komplexes in der Probe. Der iso­ lierte monoklonale Antikörper wird in geeigneter Weise mar­ kiert, so daß er durch kolorimetrische, fluorometrische oder radiochemische Methoden bestimmt werden kann. Weiterhin kann er mit einem Enzym für die Bestimmung durch eine anschließende Substratreaktion markiert sein, oder er kann mit einem zusätz­ lichen Antikörper zur Bestimmung gemäß einer der vorgenannten Methoden markiert sein.

Weiterhin kann man auch eine Verdrängungsmethode für die Bestimmung des δ-Bilirubins in einer biologischen Probe verwenden. Dies schließt die Komplexierung des monoklonalen Antikörpers mit markiertem, exogenen δ-Bilirubin ein, und zwar unter Bildung eines Antikörper/δ-Bilirubin-Komplexes vor seiner Zugabe zu der auf δ-Bilirubingehalt zu bestim­ menden Probe. Bei der Zugabe des Komplexes zu der Probe verdrängt das vorhandene, endogene δ-Bilirubin das mar­ kierte exogene δ-Bilirubin, das anschließend quantitativ bestimmt werden kann. Somit entspricht die Menge des verdräng­ ten, markierten, exogenen delta-Bilirubins der Menge des endogenen δ-Bilirubins in der biologischen Probe. Das quantitative Bestimmungsverfahren kann von dem verwendeten Marker abhängen. Die vorstehend beschriebenen Marker sind auch bei diesem Verfahren anwendbar.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den folgenden Ausführungsbeispielen, die nicht im Sinne einer Einschränkung zu verstehen sind.

Materialien

• (a) Antigen für die Immunisierung: menschliches δ-Biliru­ bin, isoliert wie beschrieben in Clin. Chemistry, 28 : 629-637 (1982).
• (b) Screening-Antigen: unkonjugiertes und konjugiertes Bilirubin, isoliert und gelöst wie beschrieben in Wu et al., Clin. Chem., 26 : 1323-1335 (1989).
• (c) Gewebekulturmedien
  Vollständiges Medium: RPMI 1640 (Flow Laboratories, Mississauga, Ontario) wurde mit 10% V/V fötalem Kalbserum (Gibco, Burlington, Ontario), 10 mM Hepes-Puffer und 5×10^-5 M 2-Mercaptoethanol supplementiert.
• Serumfreies Medium: vollständiges Medium, hergestellt ohne das fötale Kalbserum.
• HAT-Medium: vollständiges Medium, supplementiert mit 5×10^-3 M Hypoxanthin, 2×10^-5 M Aminopterin und 8×10^-4 Thymidin.
• HT-Medium: vollständiges Medium, supplementiert mit 5×10^-5 M Hypoxanthin und 8×10^-4 M Thymidin.
• (d) ELISA-Lösungen und Reagenzien
  Phosphatgepuffertes Kochsalz (PBS): 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO₄ und 0,2 g KH₂PO₄ in 1 l H₂O, pH 7,4 bis 7,6.
• Beschichtungspuffer: 17,2 g NaHCO₃ und 8,6 g Na₂CO₃ in 1 l destilliertem H₂O, pH innerhalb von 0,2 pH-Einheiten von 9,6 ohne Einstellung. Dieser Puffer muß am Tage des Einsat­ zes frisch hergestellt werden.
• Waschpuffer: PBS mit einem Gehalt an 0,05% Tween 20.
• Peroxidasesubstrat: eine einzige O-Phenylendiamin-Tablette (J.D. Biologicals), gelöst in 2,5 ml destilliertem H₂O, enthaltend 2,5 µl 30% H₂O₂.

Beispiel 1 Immunisierung

Weibliche Balb/C-Mäuse mit einem Alter von 6 bis 8 Wochen wurden mit einer intraperitonealen (ip) Injektion von 50 µl (100 µg) des Antigens, menschlichem delta-Bilirubin, in Freund′s vollständigem Adjuvans immunisiert. Die Tiere wurden zusätzlich mit intraperitonealen Injektionen geboostet, die die gleiche Antigenmenge enthalten, jedoch in Freund′s unvoll­ ständigem Adjuvans hergestellt wurden, und zwar in den Wochen 3, 6 und 9 nach der ersten Injektion. Im Anschluß an diese Injektionen erhielten die Tiere eine minimale Ruheperiode von 4 Wochen. Drei Tage vor der Herstellung der Hybridomzellinie erhielten die Tiere einen letzten ip-Boost von 50 µl (100 µg) des Antigens, suspendiert in 0,5 ml pBS-Lösung.

Beispiel 2 Fusion

Den immunisierten Tieren wurde unter aseptischen Bedingungen die Milz entnommen und durch ein Maschendrahtgitter zum Erhalt einer Suspension von einzelnen Zellen gedrückt. Die Splenozy­ ten wurden mit Sp2/0-Myelomzellen bei einem Milz-Myelom-Ver­ hältnis von 5 : 1 vermischt und dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen. Nach der letzten Waschung wurde die überstehende Flüssigkeit vollständig entfernt; das Zellpellet wurde unter vorsichtigem Rühren aufgebrochen. Polyethylenglykol (PEG) 1450 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) wurde mit 37°C serumfreiem Medium auf 50% verdünnt und tropfenweise zu dem Pellet innerhalb von 60 sec gegeben. Die PEG/Zellsuspension wurde bei 30°C weitere 90 sec inkubiert, bevor sie mit 10 ml serumfreiem Medium innerhalb von 5 min verdünnt wurde. Im Anschluß an eine weitere, 10-minütige Inkubierung bei 37°C wurden die Zellen in HAT-Medium (Hypoxan­ thin, Aminopterin und Thymidin) resuspendiert (5×10⁶ Zel­ len/ml) und auf Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen (5× 10⁵/Vertiefung) plattiert. Die Platten wurden anschließend bei 37°C in einem befeuchteten CO₂-Inkubator inkubiert. Nach jeweils drei Tagen wurden die Vertiefungen mit 100 µl HAT-Medium aufgefüllt, bis ein heftiges Hybridomwachstum evident wurde.

Beispiel 3 Screeningassay

ELISA-Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc, Burlington, Ontario) wurden über Nacht mit Bilirubinantigen in Beschichtungspuffer (10 µg/ml) beschichtet. Die Platten wurden zweimal mit Wasch­ puffer gewaschen, und die Vertiefungen wurden mit gleichen Mengen Waschpuffer (50 µl) gefüllt. Die überstehenden Flüssig­ keiten (50 µl-Vertiefung) wurden aseptisch von den Gewebekul­ turplatten transferiert, und die ELISA-Platten wurden bei 37°C 2 h inkubiert. Die Vertiefungen wurden entleert, viermal gewaschen und mit Waschpuffer gefüllt, der Zie­ gen/Antimaus-IgG/IgM, konjugiert mit 1 : 1000 verdünnter Meer­ rettich-Peroxidase (J.D. Biologicals, Toronto, Ontario) enthielt. Nach einer abschließenden zweistündigen Inkubation wurden die Vertiefungen geleert, fünfmal mit Waschpuffer gewaschen und erneut mit Peroxidasesubstrat-Lösung (100 µl/ Vertiefung) gefüllt. Man ließ die Reaktion 30 min weiter­ laufen, bevor man sie durch Zugabe von 8 M H₂SO₄ (25 µl/ Vertiefung) beendete. Die Absorption in den Vertiefungen wurde bei 495 nm in einem BioTek-ELISA-Plattenableser gemes­ sen. Vertiefungen, die Absorptionsablesungen ergaben, welche größer als das Mittel zuzüglich des 3fachen der Standardab­ weichung der negativen Kontrollvertiefungen (kein primärer Antikörper) waren, wurden als positiv betrachtet.

Beispiel 4 Einfrieren der Zellen

Diejenigen Vertiefungen, die zweimal durch ELISA-Screening als positiv bestimmt wurden, wurden auf Gewebekulturplatten (Nunc) mit 24 Vertiefungen transferiert; man ließ sie bis zur Konflu­ enz wachsen. Die überstehende Flüssigkeit in jeder Vertiefung wurde entfernt und bei -70°C eingefroren. Die Zellen wurden abgelöst und in fötalem Kalbserum mit einem Gehalt an 10% Dimethylsulfoxid als Kryoschutz suspendiert. Die Zellen wurden über Nacht bei -70°C eingefroren und anschließend in flüssigen Stickstoff überführt.

Beispiel 5 Klonierung

Zwei parenterale Hybridome wurden durch limitierende Verdün­ nung für die Klonierung ausgewählt. Die Zellen wurden bei 1× 10⁴/ml in HT (Hypoxanthin und Thymidin)-Medium resuspendiert und in gleichen Teilen von 200 µl in 8 Vertiefungen einer Gewebekulturplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Die übrigen Vertiefungen wurden mit 100 µl HT-Medium gefüllt; unter Verwendung einer Multikanalpipette wurde eine serielle zweifa­ che Verdünnungsreihe erzeugt. Nach der Inkubation und dem Zellwachstum wurde die überstehende Flüssigkeit mittels ELISA auf Bilirubinreaktivität getestet. Die Vertiefung mit der höchsten Verdünnung, die positiv auf mit Bilirubin reaktivem Antikörper war, wurde durch limitierende Verdünnung erneut kloniert.

Beispiel 6 Aszitesbildung

Männliche Balb/C-Mäuse mit einem Alter von 6 bis 8 Wochen (Jackson Laboratories) erhielten eine einzige ip-Injektion von 0,5 ml Pristane (Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri). 10 Tage später erhielten die Mäuse 5×10⁶ Hybridomzellen durch ip-Injektion. 10 bis 14 Tage später bildete sich eine Aszites, die gesammelt wurde. Zellen und Fibrin wurden entfernt, indem man die Aszitesflüssigkeit gerinnen ließ. Die erhaltene Aszitesflüssigkeit wurde bei -70°C aufbewahrt.

Beispiel 7 Bestimmung von δ-Bilirubin

Die folgenden Daten illustrieren die Spezifizität eines monoklonalen Antikörpers der Erfindung, insbesondere des monoklonalen Antikörpers Nr. 108.

Das Verfahren, das verwendet wurde, um die Reaktion des monoklonalen Antikörpers mit drei unterschiedlichen Bilirubin­ proben zu bestimmen, d.h. authentisches delta-Bilirubin, isoliert aus Humanserum, konjugiertes Bilirubin, isoliert aus menschlicher Gallenflüssigkeit (typischerweise 70 bis 75% di- und 20 bis 25% mono-Konjugat) und unkonjugiertes Bilirubin, erfolgte unter Einschluß einer Enzym-Substrat-Reaktion.

Der monoklonale Antikörper wurde an Reaktionsvertiefungen gebunden, in die Bilirubinproben gegeben wurden. Handelsübli­ che albuminspezifische Antikörper (IgG), zuvor gebunden an Peroxidase (POD), wurden in die Reaktionsvertiefungen gegeben, die anschließend nach einer geeigneten Reaktionszeit frei von fremden nicht-gebundenem Material gewaschen wurden. Ein Substrat für Peroxidase, z. B. Phenylendiamin, wurde zugegeben; die Farbe des nach einer Stunde gebildeten Farbstoffproduktes wurde für jede Probe bei 630 nm gemessen.

Es ist zu beachten, daß die Reaktion des monoklonalen Antikör­ pers mit sowohl konjugiertem als auch unkonjugiertem Bilirubin vernachlässigbar gering war.

Tabelle 1

Reaktion des monoklonalen Antikörpers, bestimmt als Absorption bei 630 nm, mit δ-Bilirubin (B_d), konjugiertem Bilirubin (B_c) und unkonjugier­ tem Bilirubin (B_u).

Claims (8)

1. Monoklonaler Antikörper oder Fragment desselben, gekenn­ zeichnet durch eine gegen δ-Bilirubin spezifische Antigen-Bindungsstelle.

2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Antikörper gegen die singuläre Konforma­ tion des δ-Bilirubins gerichtet ist.

3. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Antikörper gegen die für δ-Bilirubin spezifische, Bilirubin mit Albumin verknüpfende kovalente Bindung gerichtet ist.

4. Immunoassay-Verfahren zur Bestimmung und Quantifizierung von δ-Bilirubin in einer biologischen Probe, bei dem man die biologische Probe mit dem monoklonalen Antikörper in Berührung bringt und die Menge des an δ-Bilirubin gebundenen Antikörpers bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß man den monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die an δ-Bilirubin gebundene Antikörpermenge durch Zugabe eines Substrats für einen Peroxid-Marker bestimmt.

6. Analysekit für die quantitative δ-Bilirubin-Bestimmung in einer biologischen Probe, enthaltend einen immobil­ isierten, enzymmarkierten Antikörper oder ein Fragment desselben mit einer Antigenbindungsstelle, die spezifisch gegen δ-Bilirubin gerichtet ist; ein gegenüber dem Enzymmarker spezifisches Substrat; eine Waschlösung sowie Mittel zur Vereinigung des Substrats mit dem Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper eine Antigenstelle aufweist, die spezifisch gegen δ- Bilirubin gerichtet ist.

7. Analysekit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er eine einen Marker enthaltende Lösung und Mittel zur Vereinigung des Markers mit dem Antikörper enthält.

8. Antikörper produzierende Hybridomzellinie, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie gegen δ-Bilirubin spezifische monoklonale Antikörper bildet.