DE4112528A1 - Spektralfotometer fuer die hochdruckfluessigkeitschromatographie - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Spektralfotometer mit einer Licht­ quelle, die elektromagnetische Strahlung in einem Wellenlängenbereich emittiert, in dem die zu erfassenden Sub­ stanzen absorbieren können, und deren Strahlung über eine Meßküvette und eine Transferoptik auf einen fotoelektrischen Detektor fällt.

Solche Spektralfotometer werden unter anderem in der Hochdruckflüssigkeitschromatografie (HPLC) seit einigen Jahren eingesetzt und als UV-HPLC-Detektoren bezeichnet.

Gebräuchliche UV-Detektoren für die HPLC verwenden Deuterium- Lampen, Quecksilber-Lampen oder Xenon-Blitzlampen als Strahlungsquelle und eine lange, dünne und röhrenförmige Kü­ vette als Absorptionsküvette. Typische Abmessungen sind: In­ nendurchmesser 1 mm, Länge 10 mm. Der Nachteil dieser Spek­ tralfotometer ist oft eine Abhängigkeit vom Brechungsindex, wodurch Gradientenelution mit kontinuierlich variierendem Bre­ chungsindex erschwert wird. Außerdem tritt immer eine soge­ nannte Totzeitspitze am Anfang des Chromatogramms auf. Beide Effekte gehen auf die räumlich inhomogene Strömungsverteilung (dynamische thermische Linse) innerhalb der Kapillarküvette zurück und werden in der Fachliteratur ausführlich beschrie­ ben. Zur Kompensation müssen aufwendige Optiken verwendet wer­ den. So wird in DE 33 06 763 ein optisches System beschrieben, das drei Linsen und zwei Blenden enthält, die exakt justiert sein müssen.

In der DE-OS 39 33 592 und dem GM 89 11 983 wird ein Spektral­ fotometer mit einer UV-Lichtquelle beschrieben, die auf dem Prinzip der Beta-induzierten Lumineszenz beruht. Als Absorp­ tionsküvette dient eine Durchflußküvette mit großem Quer­ schnitt und kurzer Länge. Durch diese Zellengeometrie erreicht man zum einen ein völlig anderes Stromungsprofil, wodurch ein Einfluß des Brechungsindex′ auf das Meßsignal vermieden wird. Zum anderen gelangt wegen des großen Querschnittes viel Licht durch diese Zelle, so daß trotz der geringen UV-Intensität eine Fotodiode statt sonst üblicher Fotomultiplier eingesetzt werden kann. Leider ist das Rauschen dieses Spektralfotometers im Vergleich zu herkömmlichen HPLC-Detektoren relativ groß.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Spektralfotome­ ter zu entwickeln, das insbesondere als UV-Detektor in der Prozeß-HPLC eingesetzt werden kann, eine geringe Nachweis­ grenze hat, unabhängig von Schwankungen des Brechungsindex′ ist und einfach und kostengünstig herzustellen ist. Diese Auf­ gabe wird mit einem Spektralfotometer gelöst, welches die Merkmale des Anspruchs 1 aufweist.

Zur Lösung dieser Aufgabe werden mehrere optische Elemente in vorteilhafter Weise kombiniert. Zunächst läßt sich auf einfa­ che Weise eine Absorptionsküvette mit geringem Einfluß des Brechungsindex dadurch realisieren, indem eine planare Geome­ trie verwendet wird, wie sie bereits in dem GM 89 11 983 be­ schrieben ist. Diese Zelle weist ein geringes Zellvolumen von ca. 10 µl auf, wie es in der HPLC nötig ist und führt weiter­ hin auch zu keinem schlechteren Ausspülverhalten im Vergleich zu konventionellen Kapillarküvetten.

Um den Nachteil des relativ hohen Rauschens (siehe DE-OS 39 33 592) beim Einsatz dieser Zelle zu vermeiden, wird statt der dort verwendeten, lichtschwachen UV-Lichtquelle eine Quecksil­ berniederdrucklampe verwendet, die eine wesentlich größere In­ tensität aufweist. Statt dessen können aber auch andere Entla­ dungslampen, wie z. B. phosphorbeschichtete Hg-, Zink-, Cad­ mium-, Jod-, Xenon- und Deuteriumlampen sowie thermische Strahlungsquellen für den sichtbaren Spektralbereich verwendet werden.

Um möglichst viel Licht auf den Fotodetektor zu bekommen, müs­ sen weiterhin alle Abstände zwischen den optischen Komponenten und dem fotoelektrischen Detektor so kurz wie möglich sein.

Mit beiden Maßnahmen, der intensiven UV-Lampe und der lichtstarken Absorptionsküvette, ist die notwendige Vorausset­ zung geschaffen, große Signale am Fotodetektor zu erhalten und damit an das physikalisch limitierende Schrotrauschen heranzu­ kommen, das ein maximales Signal-Rausch-Verhältnis ergibt.

Beim Schrotrauschen ist das elektrische Signal proportional zur Lichtintensität, das Rauschen wird mit der Wurzel aus der Lichtintensität größer, so daß das Signal-Rausch-Verhältnis I/δI mit der Wurzel aus der Lichtintensität größer wird. Die Lichtintensität am Fotodetektor wird andererseits mit dem Raumwinkel Ω = A/l² größer, wobei A die Querschnittsfläche des Lichtdurchtritts und l den maßgebenden Abstand angibt. Wird nun wie in der HPLC gefordert, das Zellvolumen nicht größer als typisch 10 µl sein, dann ergibt sich bei einem als konstant betrachteten Volumen V (= A·l) eine Raumwinkelabhän­ gigkeit von Ω = V/l³. Die Nachweisgrenze hängt nun sowohl vom Signal-Rausch-Verhältnis als auch von der Absorptionslänge ab. Mit dem Lambert-Beerschen Gesetz gilt, daß T - 10^-E = 10⁻^{ε cd} ist, wobei T die Transmission, E die Extinktion, ε der Ex­ tinktionskoeffizient, c die Konzentration und d die Absorpti­ onslänge bedeutet. Das Signal-Rausch-Verhältnis I/δI ent­ spricht einem Rauschen der Transmission δT = δI/I, was wie­ derum einem Rauschen der Extinktion von δE = 0,4 δT ent­ spricht. Die Nachweisgrenze c_min ist dann c_min = δE/(εd) = 0,4 δT/(εd). Ist die Absorptionsküvette das optische Bauteil, das die Intensität auf dem Detektor begrenzt, dann kann näherungs­ weise d = l gesetzt werden und die Nachweisgrenze c_min ist dann proportional zur Wurzel aus der Absorptionslänge. D. h. trotz Verringerung der Absorptionslänge wird die Nachweis­ grenze kleiner.

Diese Betrachtung enthält einige Annahmen und gilt auch nur näherungsweise. So wird bei kleinen Absorptionslängen bei­ spielsweise der Raumwinkel so groß, daß dies technisch gar nicht zu realisieren ist. Außerdem begrenzen auch noch andere Quellen wie z. B. das Verstärkerrauschen die obige Abschät­ zung. Aus diesem Grund wird es eine optimale Absorptionslänge geben, die von der Optik und dem Verstärkerrauschen bestimmt wird. Trotzdem ist ersichtlich, daß nicht nur eine Kapillar­ küvette zu guten Nachweisgrenzen führen muß, sondern daß auch eine kurze Zelle gute oder sogar bessere Ergebnisse bringen kann.

Eine geringe Nachweisgrenze kann jedoch durch diese Abwandlung des früheren Aufbaus allein noch nicht erreicht werden. Dazu muß zunächst die Intensitätsfluktuation der Entladungslampe kompensiert werden. Zur Lösung wird ein Glasfaserstrahlteiler verwendet, der die von der UV-Lampe kommende Strahlung in zwei Strahlengänge aufteilt. In einem dieser Zweige ist die bereits erwähnte Absorptionsküvette angeordnet, der andere Zweig kann eine weitere Zelle enthalten, muß es aber nicht. Wesentlich dabei ist die mechanische Stabilität des Strahlteilers, da ge­ ringste Bewegungen zu Unterschieden in beiden Strahlengängen führen und zu Grundlinienbewegungen oder auch Rauschen führt.

Eine weitere Maßnahme zur Erhöhung der Meßgenauigkeit besteht in der Thermostatisierung dieses Gerätes. Damit werden gering­ fügige Änderungen der inhomogen leuchtenden UV-Lampe, Luftkon­ vektion, die Temperaturabhängigkeit des Brechungsindex aller optischer Komponenten sowie die der Fotodetektoren und der Elektronik vermieden.

Durch oben beschriebene Maßnahmen ergeben sich stabile und rauscharme Detektorsignale, die von der folgenden Signalverarbeitselektronik unverfälscht verarbeitet werden müssen. Übliche UV-HPLC-Detektoren zeigen ein Rauschen von ca. 10^-5 a.u. (absorbance units), so daß auch der Verstärker ein Eingangsrauschen in dieser Größenordnung aufzuweisen braucht. In diesem Fall ist jedoch die Absorptionsküvettenlänge kürzer als üblich und das Signal-Rausch-Verhältnis aufgrund der hohen Lichtintensität größer, so daß auch der Verstärker dafür ge­ eignet sein muß. Typisch sind Werte von 10^-6 a.u.

Eine vorteilhafte Weiterbildung ist der Einsatz einer ab­ dichtenden Schottwand zur Trennung von einer nicht explosions­ geschützten von einem explosionsgeschütztem Raum. Der Grund ist, daß die UV-Lampe u. U. ein gasförmiges Gemisch zünden kann und daher prinzipiell in einem explosionsgeschützten Raum untergebracht sein muß. Die Transferoptik läßt dagegen auf­ grund ihres geringen Lichtleitwertes nur einen kleinen Teil der gesamten UV-Strahlung passieren, so daß diese Optik auch in einem explosionsgefährdetem Raum angeordnet sein kann. Die Elektronik muß sich im explosionsgeschützten Raum befinden, wenn keine besonderen Maßnahmen getroffen werden. Wird sie je­ doch eigensicher (Ex-i) ausgeführt, dann kann sie auch in einem explosionsgefährdetem Raum untergebracht werden.

Eine andere, vorteilhafte Weiterbildung besteht darin, die Strahlung der UV-Lichtquelle zu modulieren und eine dazu ange­ paßte Elektronik zu verwenden, um das Rauschen noch weiter zu verringern und die Stabilität zu erhöhen (Lock-in-Verfahren). Zu diesem Zweck wird die Strahlung der Lichtquelle z. B. mechanisch durch einen Chopper periodisch unterbrochen. Eine weitere Möglichkeit besteht in der direkten Modulation des Lampenstroms oder der Lampenspannung. Das letztgenannte Ver­ fahren kann allerdings nicht bei allen Lampentypen eingesetzt werden. Geeignet sind z. B. Hg-Niederdrucklampen, die aufgrund des geringen Gasdrucks schnellen Modulationsfrequenzen gut folgen können, während Hochdruckbogenentladungen nur einen ge­ ringen Modulationsgrad ergeben. Die Signalverarbeitungs­ elektronik kann nunmehr so aufgebaut werden, daß nur die Komponente mit der Modulationsfrequenz verstärkt wird. Das wird durch phasensensitive Lock-in-Verstärker erreicht. Durch die Transformation des benutzten Frequenzbereiches bei niedri­ gen Frequenzen entsprechend der oberen Grenzfrequenz des Ver­ stärkers zu einem Bereich höherer Frequenz entsprechend der Modulationsfrequenz kann bei gleicher elektrischer Bandbreite das Rauschen reduziert werden. Das ist deswegen möglich, weil oft ein sogenanntes 1/f-Rauschen, z. B. durch die Fotodioden oder den Verstärker, auftritt, das für kleine Frequenzen f stark ansteigt und das bei der Modulationsfrequenz schon we­ sentlich geringer ist. Ein weiterer Vorteil der wechselspan­ nungsmäßig gekoppelten Verstärker liegt bekanntlich in der größeren Stabilität, da Gleichspannungsdriften unberücksichtigt bleiben.

Die. Erfindung wird nachstehend anhand der in der Zeichnung dargestellten Ausführungsform erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 Gesamtansicht des HPLC-Detektors,

Fig. 2 Durchflußküvette,

Fig. 3 Chromatogramm eines konventionellen HPLC-Detektors,

Fig. 4 Chromatogramm des neuen HPLC-Detektors,

Fig. 5 Ausspülverhalten eines konventionellen HPLC-Detektors,

Fig. 6 Ausspülverhalten des neuen HPLC-Detektors.

Die Gesamtansicht des HPLC-Detektors ist in Fig. 1 schema­ tisch dargestellt. In dem Lampengehäuse 1 ist die UV-Licht­ quelle 2 starr eingebaut, deren Strahlung nur durch eine kleine Öffnung 3 austreten kann. In der Halterung 4 ist eine Linse 5 und das Interferenzfilter 6 untergebracht, wobei die Linse 5 die UV-Strahlung durch den Hohlraum 7 auf den in der Halterung 8 eingegossenen Lichtleiter 9 fokussiert.

Dieser Lichtleiter 9 spaltet sich in zwei Lichtleiter 10, 11 auf und dient als Strahlteiler. Die aus dem Lichtleiter 11 austretende Strahlung gelangt nach Durchgang durch die Adapterplatte 12 auf die in der Halterung 13 eingebaute Durchflußküvette 14 und bestrahlt die Fotodiode 15. Die aus dem Lichtleiter 10 austretende Strahlung durchstrahlt eine Bohrung 16 und gelangt auf die Fotodiode 17. Beide Fotodioden 15, 17 sind in einer gemeinsamen Halterung 18 untergebracht, in der sich auch die Vorsignalverarbeitungselektronik 19 be­ findet und die direkt mit den Anschlüssen der beiden Fotodi­ oden 15, 17 verbunden ist. Ein Deckel 20 verschließt die Hal­ terung 18. Durch diesen Aufbau werden elektrische Einstreuun­ gen unterrückt und weiterhin ein gutes Temperaturverhalten der Fotodioden 15, 17 und der Elektronik 19 erreicht.

Diese Lampe 2 ist im explosionsbeschützten Bereich unterge­ bracht, da die UV-Intensität zu stark ist. Zur Abtrennung des explosionsgeschützten vom explosionsgefährdetem Raum dient eine Schottwand 21 aus 4 mm dickem Stahl, in die das Lichtlei­ terende 9 dichtend eingebaut ist.

Die Vorsignalverarbeitungselektronik 19 muß eigensicher (Ex-i) ausgeführt sein, weil sie im explosionsgefährdeten Bereich un­ tergebracht ist.

Zur weiteren Signalverarbeitung ist eine gekapselte Elektronik 22 an der Schottwand 21 angebracht, die über ein Kabel mit der Vorsignalverarbeitungselektronik 19 verbunden ist, das eben­ falls dicht durch die Schottwand 21 herausgeführt wird. Zur Spannungsversorgung der UV-Lampe 2 dient das Netzteil 23, das über ein Kabel mit der UV-Lampe 2 verbunden ist.

Die in Fig. 2 dargestellte Durchflußküvette 14 besteht aus ka­ pillaren Zu- und Ableitungen 24, zwei Quarzplatten 25 und ei­ nem Quarzabstandsstück 26. Dieses Quarzabstandsstück 26 be­ steht aus einem gefärbten, für UV-Strahlung undurchlässigen Quarzglas und enthält eine runde Aussparung 26a, deren Durch­ messer D den durchstrahlbaren Bereich der Durchflußküvette 14 bestimmt. Dieser Durchmesser D der Aussparung 26a ist an die Dimensionen der die Durchflußküvette 14 umgebenden Komponen­ ten, Lichtleiter 11 auf der einen und Fotodiode 15 auf der an­ deren Seite, angepaßt, so daß die gesamte durchstrahlbare Fläche der Durchflußküvette 14 auch durchstrahlt wird und das gesamte aus der Durchflußküvette 14 tretende Licht in der wei­ terführenden Optik erfaßt wird. Das Quarzabstandsstück 26 be­ stimmt mit seiner Dicke die Absorptionsweglänge L und legt da­ mit zusammen mit dem Durchmesser D seiner Aussparung 26a das Durchflußküvettenvolumen fest. Die zwei Quarzplatten 25 sind mit dem Quarzabstandsstück 26 ohne Verformung der einzelnen Teile zu einem Stück verschmolzen. Dadurch kann der Eluent oder die Probensubstanz nicht zwischen die Quarzplatten 25 und das Quarzabstandsstück 26 eindringen und zu Substanzverschlep­ pungen führen. In diese zusammengeschmolzene Einheit aus den zwei Quarzplatten 25 und dem Quarzabstandsstück 26 sind senk­ recht zu zwei gegenüberliegenden Längsflächen in der Mitte dieser Längsflächen zwei Bohrungen bis zur Aussparung 26a des Quarzabstandsstücks 26 angebracht, in die die Zu- und Ablei­ tungen 24 in Kapillarform mit einer kegelförmigen Teflonfolie dichtend eingeschoben sind. Alternativ können die Zuleitungen auch geklebt werden, sofern der Kleber chemisch resistent ge­ genüber der Eluentenflüssigkeit ist.

In den folgenden Figuren sind einige Meßergebnisse zusammenge­ stellt, die mit diesem HPLC-Detektor und anderen Detektoren zum Vergleich erhalten wurden.

Fig. 3 zeigt zunächst das Chromatogramm eines konventionellen HPLC-Detektors, das mit 5 ng Naphthalin in 100% Methanol, ei­ nem 9:1 Methanol-Wassergemisch, einer C-18 (7 µm) Säule bei 0,8 ml/min Durchfluß, einer Absorptionsküvette mit 10 mm Schichtdicke und bei 254 nm Wellenlänge und einer elektrischen Zeitkonstanten von 0,25 s aufgenommen wurde. Das Rauschen be­ trägt 3 10^-5 a.u. (absorbance units) und die Höhe des Naphtha­ lin-Peaks 1,75 10^-3 a.u., woraus sich eine Nachweisgrenze von 0,3 ng ergibt, wenn das dreifache Rauschen als Grenze betrach­ tet wird. Beachtenswert ist der Peak zu Beginn des Chromato­ gramms, der zunächst in positiver Richtung der Extinktion, dann in negativer Richtung ausschlägt. Ursache für diesen so­ genannten Totzeitpeak ist der Unterschied des Brechungsindex zwischen Eluent (9:1 Methanol-Wassergemisch) und dem der inji­ zierten Lösung (100% Methanol). Es ergibt sich eine Kurven­ form, die wie die Differentiation eines normalen Peaks aus­ sieht. Als Ursache kann das Strömungsprofil mit seiner inhomo­ genen Verteilung des Brechungsindex herangezogen werden und ist in der Fachliteratur unter dem Begriff "dynamische Linse" bekannt.

Fig. 4 zeigt das Chromatogramm mit dem neuen HPLC-Detektor, das unter denselben Bedingungen wie in Fig. 3 aufgenommen wurde. Als Durchflußküvette diente eine 1 mm Zelle. Das Rau­ schen beträgt 3 10^-6 a.u. (absorbance units) und die Höhe des Naphthalin-Peaks 1,70 10^-4 a.u., woraus sich ebenfalls eine Nachweisgrenze von 0,3 ng ergibt. Bei einer neueren Version dieses Detektors wurde das Rauschen durch eine bessere Elek­ tronik auf 1 10^-6 a.u. verbessert, so daß sich sogar eine Nachweisgrenze von nur 100 pg ergibt. Im Gegensatz zu Fig. 3 ist der "differenzierte" Peak hier nicht zu erkennen. Statt dessen werden an dieser Stelle zwei kleine Peaks beobachtet. Als Grund wird das andere Strömungsprofil angesehen: Die Strahlung gelangt nicht in Flußrichtung durch die Durchflußkü­ vette, was zu der dynamischen Linse führt, sondern senkrecht dazu. Aus diesem Grund wird hier lediglich ein Ausschlag in positiver Richtung der Extinktion beobachtet, der durch die unterschiedliche Absorption zwischen dem 9:1 Methanol- Wassergemisch und den 100% Methanol der injizierten Lösung bewirkt wird.

Diese Messungen zeigen, daß der neue HPLC-Detektor hinsicht­ lich Nachweisgrenze und Brechungsindexeinfluß gute Ergebnisse liefert. Ein weiterer Vergleich mußte jedoch noch bezüglich des Ausspülverhaltens gemacht werden.

Fig. 5 zeigt dazu zunächst einen gespreizten Peak, der mit ei­ nem konventionellen HPLC-Detektor durchgeführt wurde. Die Be­ dingungen ähneln denen aus Fig. 3; es wurde allerdings eine größere Menge injiziert. Daraus ergibt sich eine Halbwerts­ breite von 5,1 s, eine 5%-Breite von 11,5 s und ein Symmetrie­ verhältnis bei der 5%-Linie von 1:1,4.

Zum Vergleich dazu ist in Fig. 6 ein entsprechender Peak dargestellt, der mit dem neuen HPLC-Detektor erhalten wurde. Daraus ergibt sich eine Halbwertsbreite von 4,8 s, eine 5%- Breite von 10,0 s und ein Symmetrieverhältnis bei der 5%-Linie von 1:1,4. Diese guten Ergebnisse sind nur möglich, weil die neue Durchflußküvette sehr gute Strömungseigenschaften und kaum ein Totvolumen hat.

Bezugszeichenliste

 1 Lampengehäuse
 2 UV-Lichtquelle
 3 Öffnung
 4 Halterung
 5 Linse
 6 Interferenzfilter
 7 Hohlraum
 8 Halterung
 9 Lichtleiter
10 Lichtleiter
11 Lichtleiter
12 Adapterplatte
13 Halterung
14 Durchflußküvette
15 Fotodiode
16 Bohrung
17 Fotodiode
18 Halterung
19 Vorsignalverarbeitungselektronik
20 Deckel
21 Schottwand
22 Elektronik
23 Netzteil
24 Zu- und Ableitung
25 Quarzplatten
26 Abstandsstück
26a Aussparung
D Durchmesser
L Absorptionsweglänge

Claims (3)

1. Spektralfotometer als Detektor für die Hochdruckflüssig­ keitschromatographie (High Pressure Liquid Chromatography (HPCL)) mit einer Lichtquelle (2), die elektromagnetische Strahlung in einem Wellenlängenbereich emittiert, in dem die zu erfassenden Substanzen absorbieren können, und deren Strahlung über einen Lichtleiterstrahlteiler zum einen auf eine Meßküvette (14) mit zugehörigem fotoelektrischen De­ tektor (15) und zum anderen auf einen Referenzdetektor (17) fällt, dadurch gekennzeichnet, daß

• - die Lichtquelle (2) eine ultraviolette Entladungslampe ist,
• - die Meßküvette (14) eine Durchflußküvette mit zwei parallelen Fenstern (25) ist, die durch ein Abstands­ stück (26) zur Bildung eines Hohlraumes (26a) voneinan­ der getrennt sind, wobei die die Absorptionsweglänge be­ stimmende Dicke (L) dieses Abstandsstückes (26) kleiner ist als die Wurzel der Hohlraumquerschnittsfläche,
• - zwischen der Lichtquelle (2) und den fotoelektrischen De­ tektoren (15, 17) ein Lichtleiter (9, 10, 11) ist und
• - zwischen Lichtquelle (2) und dem Lichtleiter (9, 10, 11) eine Schottwand (21) als dichtendes Element zur Trennung von Ex-freien und Ex-geschützten Räumen eingebaut ist.

2. Spektralfotometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ultraviolette Lichtquelle eine reine oder phosphor­ beschichtete Quecksilberlampe, Zink-, Cadmium-, Jod-, Xenon- oder Deuteriumlampe ist.

3. Spektralfotometer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die UV-Lampe mechanisch oder elektrisch modu­ liert ist und darauf abgestimmte frequenz- und phasensensi­ tive Verstärker eingesetzt werden.