DE4100727A1

DE4100727A1 - Analytisches verfahren fuer enzymelektrodensensoren

Info

Publication number: DE4100727A1
Application number: DE19914100727
Authority: DE
Inventors: Karl-Dittmar Dr Klein
Original assignee: KLEIN KARL DITTMAR DR
Current assignee: KLEIN KARL DITTMAR DR
Priority date: 1991-01-09
Filing date: 1991-01-09
Publication date: 1992-07-16
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: DE4100727C2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf analytische Verfahren unter Verwendung von Enzymelektrodensensoren, die auch als elektrochemische Biosensoren be zeichnet werden.

Enzymelektrodensensoren werden zunehmend für Analysen in der Medizin und der Biotechnologie eingesetzt. Hierbei sind von Vorteil die hohe Spezifi tät Enzym-katalysierter Reaktionen und die hohe Empfindlichkeit von Elek trodenmessungen bei geringem technischen Aufwand (siehe z. B. die Monogra phie "Biosensors", Fundamentals and Applications, herausgegeben von A.P.F. Turner, I. Karube und G.S. Wilson, Oxford University Press, 1987).

Es werden die Konzentrationen zahlreicher Stoffe wie Glucose, Harnstoff, Alkohol, Lactat usw. in physiologischen bzw. biotechnologischen Flüssig keiten gemessen. Diese Stoffe sind elektrochemisch inaktiv, d. h. sie las sen sich mit Hilfe von Elektrodenreaktionen nicht direkt nachweisen. Ein derartiger Stoff kann aber in Folge einer geeigneten chemischen Reaktion elektrochemisch aktive Substanzen erzeugen oder verbrauchen. Eine derar tige chemische Reaktion ist besonders geeignet, wenn für sie ein passen des Enzym zur Verfügung steht. Die Anwesenheit des Enzyms erniedrigt die Aktivierungsenergie der Reaktion, so daß sie im allgemeinen sehr schnell abläuft. Das Enzym wirkt außerdem zweifach spezifisch: Es selektiert aus einem Gemisch von Substraten nur eines (den Analyten) und katalysiert nur die eine (erwünschte) chemische Reaktion, die die an einer Elektrode nachweisbaren Substanzen erzeugt oder verbraucht. Aus diesem Zusammenwir ken von Enzym und Elektrode ergibt sich, daß beide eng benachbart sein müssen. Es ist deshalb günstig, das Enzym in Elektrodennähe zu immobili sieren.

Die elektrochemisch aktiven Substanzen der Enzym-katalysierten Reaktion können Elektronen an die Elektrode abgeben bzw. von der Elektrode aufneh men. Um sie nachzuweisen, wird z. B. im ersteren Fall von außen ein posi tives elektrisches Potential an die Elektrode gelegt, so daß die Elektro nen kontinuierlich von der Elektrode abgezogen werden. Die Stärke des sich einstellenden, äußeren elektrischen Stromes ist dann ein Maß für die Geschwindigkeit der Enzym-katalysierten Reaktion. Unter der Vorausset zung, daß die Konzentration des Analyten diese Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt, ist die Stärke des äußeren Stromes ein Maß für die Konzentra tion des Analyten. Dieses Meßverfahren heißt amperometrisches und ent spricht dem Stand der Technik.

Bei der Analytkonzentration Null wird im allgemeinen bereits ein äußerer Strom gemessen, der von interferierenden Substanzen herrührt. Diese Sub stanzen sind ebenfalls elektrochemisch aktiv, und zwar im allgemeinen un abhängig von der Enzym-katalysierten Reaktion. Man korrigiert die re sultierende Verfälschung der Meßergebnisse, indem man den Wert der Strom stärke bei der Analytkonzentration Null jeweils von den Strommeßwerten subtrahiert. In den meisten Fällen gelangen die interferierenden Substan zen jedoch zusammen mit dem Analyten in die zu untersuchende Probe. Ihr verfälschender Einfluß auf das Meßergebnis kann dann ohne weitere Analy severfahren nicht eliminiert oder korrigiert werden.

Um die Zeit für eine Meßprozedur zu verkürzen, wird häufig ein abgewan deltes amperometrisches Verfahren angewendet. Bei diesem Verfahren wird nur die Steilheit des anfänglichen Stromanstiegs ausgewertet, der nach dem Eintauchen des Enzymelektrodensensors in die zu untersuchende Probe auftritt. Vor jeder derartigen singulären Messung muß die Enzymelektrode in einer Lösung mit der Analytkonzentration Null ins Gleichgewicht gekom men sein. Dieses Verfahren hat ebenfalls den Mangel, daß der verfäl schende Einfluß interferierender Substanzen, die zusammen mit dem Analy ten auftreten, ohne weitere Analyseverfahren nicht eliminiert oder korri giert werden kann. Darüber hinaus ist das Verfahren aus praktischen Grün den nicht anwendbar, wenn die zeitliche Änderung der Analytkonzentration gemessen werden soll; Beispiele dazu: In-vivo-Überwachung der Glucosekon zentration bei Diabetikern, Prozeßsteuerung von Bioreaktoren.

Für in-vivo-Anwendungen hat das amperometrische Verfahren mit Enzymelek trodensensoren zwei weitere Nachteile:

1. Die Enzymelektrode und die stets erforderliche Gegenelektrode sind ständig mit elektrischen Potentialen beaufschlagt, an denen körperei gene Substanzen durch elektrochemische Oxidation oder Reduktion zu giftigen Substanzen umgewandelt werden können.
2. Der zwischen den Elektroden im Elektrolyten ständig fließende elek trische Strom ist ein Volumenstrom, d. h. Stromrandgebiete existieren auch außerhalb des Sensors. Dies provoziert möglicherweise die beob achtete, relativ schnelle und starke Abwehrreaktion des Körpers, die in einer Einkapselung des Sensors besteht.

Das technische Problem, das der Erfindung zugrunde liegt, ist es, ein diskontinuierliches, elektrochemisches, analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe unter Verwendung eines Sensors vom Typ Enzymelektrode zu finden, bei dem

- der verfälschende Einfluß von interferierenden Substanzen auf das Meßergebnis wesentlich verringert ist,
- an die Elektroden nur kurzzeitig von außen elektrische Potentiale an gelegt werden bzw. nur kurzzeitig ein äußerer elektrischer Strom fließt,
- wiederholte Messungen in derselben Probe möglich sind, ohne daß der Enzymelektrodensensor zwischen den Einzelmessungen die Probe regel mäßig verlassen muß,
- das jeweilige Meßergebnis nach kurzer Zeit zur Verfügung steht.

Die Lösung des technischen Problems und damit der Gegenstand der Erfin dung ist das im folgenden beschriebene potentiometrische Relaxationsmeß verfahren: An einer im elektrochemischen Gleichgewicht (es fließt dabei kein äußerer elektrischer Strom, und die inneren elektrischen Austauschströme kompen sieren sich paarweise) befindlichen Enzymelektrode wird durch Einprägen eines in Zeitdauer und Höhe definierten elektrischen Potentialimpulses ein kurzzeitiger, äußerer elektrischer Stromimpuls hervorgerufen, der mit einem gewissen "Druck" bzw. "Sog" Elektronen in die Elektrode hinein bzw. aus ihr heraustransportiert. Die Elektrode geht dadurch in einen Nichtgleichgewichtszustand über. Nach Beendigung dieser Störeinprägung kehrt das Elektrodenpotential selbständig zum Gleichgewichtswert zurück, wobei die Geschwindigkeit davon abhängt, wie schnell die Umgebung der Elektrode die überschüssigen Elektronen aufnimmt bzw. die fehlenden Elek tronen nachliefert. Die elektrochemisch aktiven Substanzen einer Enzym katalysierten Reaktion können diese Geschwindigkeit mit beeinflussen. Insgesamt besteht der Potentialzeitverlauf nach der Störeinprägung bis zur Wiedereinstellung des elektrochemischen Gleichgewichts an der Elek trode aus einer Summe von Exponentialverläufen mit verschiedenen Zeitkon stanten, wobei jeder einzelne Exponentialverlauf einem elektrochemischen Prozeß entspricht. Das erfindungsgemäße, analytische Verfahren besteht darin, zu einem geeigneten Zeitpunkt oder Zeitintervall nach Beendigung der Störeinprägung aus dem Wert der Änderungsgeschwindigkeit des potentiometrisch gemessenen Potentialzeitverlaufs den mit dem Analyten korrelierten elektrochemischen Prozeß quantitativ zu erfassen. Durch die Art und Weise der Störeinprägung sowie durch die Wahl des geeigneten Zeitpunktes oder Zeitintervalls der Messung kann der Einfluß in terferierender Substanzen weitgehend reduziert werden.

Das potentiometrische Relaxationsmeßverfahren wird erfindungsgemäß reali siert, indem man zu einem geeigneten Zeitpunkt oder in einem geeigneten Zeitintervall nach Beendigung der Störeinprägung den Wert der Potential änderungsgeschwindigkeit potentiometrisch mißt und ihn in Beziehung setzt zur Analytkonzentration der untersuchten Kalibrierlösung. Aus mehreren derartigen Messungen bei verschiedenen Analytkonzentrationen gewinnt man die Kalibrierkurve des Enzymelektrodensensors.

Anstelle des o.a. Wertes der Potentialänderungsgeschwindigkeit zu einem geeigneten Zeitpunkt oder Zeitintervall nach Beendigung der Störeinprä gung kann erfindungsgemäß alternativ der Wert des Integrals des o.a. Po tentialzeitverlaufs während eines geeigneten Zeitintervalls nach Beendi gung der Störeinprägung benutzt werden. Auf diese Weise läßt sich ein einfacher Aufbau mit Operationsverstärkern bewerkstelligen.

Der verfälschende Einfluß interferierender Substanzen kann weiter verrin gert werden, wenn statt einer einzigen Art von Störeinprägung dem An spruch 2 entsprechend eine Folge Potentialimpulse unterschiedlicher Hö hen, Polaritäten und Zeitdauern angewendet und die Ergebnisse der einzel nen, gemäß Anspruch 1 durchgeführten, potentiometrischen Relaxationsmes sungen rechnerisch kombiniert werden.

Die Messung des Potentials der Enzymelektrode geschieht erfindungsgemäß potentiometrisch, d. h. in Bezug auf eine Referenzelektrode und praktisch ohne äußeren Stromfluß, und zwar mit Hilfe von Feldeffekttransistoren sehr großer Eingangsimpedanz.

Erfindungsgemäß kann der zusätzliche Einbau eines Redoxsystems an die En zymelektrode vorteilhaft sein. Das Redoxsystem wirkt in gewissem Maße stabilisierend auf das Elektrodenpotential und kann als sogenannter Elek tronenakzeptor oder Mediator den Ladungstransfer vom Enzym bzw. von der elektrochemisch aktiven Substanz zur Elektrode beschleunigen (Zeitschrift "Clinica Chimica Acta", Jahrgang 57 (1974), Seiten 283-289, P. Schläp fer, W. Mindt, Ph. Racine). Diesem Vorteil bei in-vitro-Anwendungen steht bei in-vivo-Anwendungen der Nachteil entgegen, daß derartige Redoxsysteme giftig sind. Erfindungsgemäß kann das potentiometrische Relaxa tionsmeßverfahren sowohl mit als auch ohne zusätzliches Redoxsystem ange wendet werden.

Die Fig. 1 zeigt beispielsweise eine Ausführungsform des Meßaufbaus un ter Verwendung von Operationsverstärkern. Die Zahlen- haben folgende Be deutung:

1 Meßzelle
2 Arbeitselektrode (Enzymelektrode)
3 Referenzelektrode
4 Gegenelektrode
5 Impedanzwandler
6 Sollspannungsgeber
7 Potentiostat
8 Verstärker
9 Integrator
10 Zeitengeber
11 Schalter für den Spannungsimpuls
12 Schalter für die Integration
13 Schalter zum Rücksetzen des Integrators
14 Bewertungswiderstände
15 Ladekondensator
16 Masseanschluß
17 Ausgang Elektrodenpotential
18 Ausgang Integrator

Das erfindungsgemäße potentiometrische Relaxationsmeßverfahren soll im folgenden an dem Ausführungsbeispiel Messung der Glucosekonzentration einer Probe mit Hilfe einer Enzymelektrode erläutert werden. Das Enzym Glucoseoxidase katalysiert die folgende Reaktion:

Das erfindungsgemäße potentiometrische Relaxationsmeßverfahren funktio niert sowohl mit Elektronenzufuhr als auch mit Elektronenentzug als Störeinprägung.

Ein Beispiel für die Elektronenzufuhr als Störeinprägung zeigt die Fig. 2. Die Störeinprägung hatte die Dauer von jeweils 0,25 Sekunden und den Potentialwert - 0,5 Volt (bezogen auf eine Ag/AgCl-Referenzelektrode). Die Relaxation verläuft umso langsamer, je höher die Glucosekonzentration der Probe ist. Das wird folgendermaßen erklärt: Die überschüssigen Elektronen (e⁻) der Elektrode werden über die Reaktion

O₂ + 4 H⁺ + 4e^- → 2 H₂O

abgebaut. Diese Reaktion verläuft umso langsamer, je mehr Sauerstoff (O₂) von der vorher genannten Reaktion verbraucht wird, was wiederum von der Glucosekonzentration abhängt.

Beispielsweise erzeugt die interferierende Substanz Ascorbinsäure bei dem dem Stand der Technik entsprechenden amperometrischen Glucose-Verfahren einen etwa 10fach höheren Meßwert als Glucose selbst (bei jeweils gleicher Konzentration in der Probe), weil bei diesem Verfahren kontinuierlich anodisch oxidiert wird und Ascorbinsäure sehr leicht oxidierbar ist. Bei dem hier dargestellten Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird kurzzeitig kathodisch reduziert, so daß die Interferenz durch Elektronenabgabe der Ascorbinsäure sehr gering ist.

Ein Beispiel für den Elektronenentzug als Störeinprägung zeigt die Fig. 3. Die Enzymelektrode enthielt zusätzlich das Redoxsystem Dimethylferro cen. Die Störeinprägung hatte die Dauer von jeweils 1 Sekunde und den Potentialwert +0,2 Volt (bezogen auf eine Ag/AgCl-Referenzelektrode). Die Relaxation verläuft umso schneller, je höher die Glucosekonzentration der Probe ist. Das wird folgendermaßen erklärt: Entsprechend der Stärke der Enzym-katalysierten Reaktion wird am Enzym Wasserstoff produziert, der gemäß der Formel

2 H → 2 H⁺ + 2e^-

Elektronen an die Elektrode liefern kann. Den Transport der Elektronen zur Elektrode besorgt im vorliegenden Beispiel vorwiegend der Mediator. Der Einfluß der Sauerstoffkonzentration ist deshalb gering. (Das Redoxsy stem Dimethylferrocen wird bereits beim amperometrischen Verfahren be nutzt: Zeitschrift "Analytical Chemistry", Jahrgang 56 (1984), Heft 4, Seiten 667 bis 671, A.E.G. Cass, G. Davis, G.D. Francis, H.A.O. Hill, W.J. Aston, I.J. Higgins, E.V. Plotkin, L.D.L. Scott, A.P.F. Turner) Die mit der Erfindung nach Anspruch 1, 2 und 3 erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß

- der verfälschende Einfluß von interferierenden Substanzen auf das Meßergebnis wesentlich verringert wird,
- an die Elektroden nur kurzzeitig von außen elektrische Potentiale an gelegt werden bzw. nur kurzzeitig ein äußerer elektrischer Strom fließt,
- wiederholte Messungen in derselben Probe möglich sind, ohne daß der Enzymelektrodensensor zwischen den Einzelmessungen die Probe regel mäßig verlassen muß,
- das jeweilige Meßergebnis nach kurzer Zeit zur Verfügung steht.

Claims

1. Analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analy ten in einer Probe unter Verwendung eines Sensors vom Typ der Enzymelektrode, wobei der Analyt infolge seiner Reaktion mit dem auf dem Sensor vorhandenen Enzym elektrochemisch aktive Substanzen er zeugt oder verbraucht, die durch den Sensor nachweisbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß

a) einer im elektrochemischen Gleichgewicht befindlichen Enzymelek trode mit Hilfe einer potentiostatischen Anordnung ein in Zeit dauer und Höhe definierter elektrischer Potentialimpuls eingeprägt wird, der einen äußeren, kathodischen oder anodischen, elektri schen Stromimpuls erzeugt,
b) man nach Beendigung der in a) genannten Störeinprägung das elek trische Potential der Enzymelektrode selbständig und ungestört zum Wert des elektrochemischen Gleichgewichts zurückkehren läßt,
c) der potentiometrisch gemessene Wert der Potentialänderungsge schwindigkeit des in b) beschriebenen Potentialzeitverlaufs der Enzymelektrode zu einem geeigneten Zeitpunkt oder in einem ge eigneten Zeitintervall nach Beendigung der in a) genannten Störeinprägung ein Maß für die Konzentration des Analyten ist,
d) alternativ der Wert des Integrals des in b) beschriebenen Potenti alzeitverlaufs über ein geeignetes Zeitintervall nach Beendigung der in a) genannten Störeinprägung ein Maß für die Konzentration des Analyten ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

e) zur Verringerung des verfälschenden Einflusses interferierender Substanzen als Störeinprägung eine Folge Potentialimpulse unter schiedlicher Höhen, Polaritäten und Zeitdauern angewendet und die Ergebnisse der einzelnen, gemäß Anspruch 1 durchgeführten, poten tiometrischen Relaxationsmessungen rechnerisch kombiniert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß

f) die Enzymelektrode vorteilhaft zusätzlich ein Redoxsystem enthält.