DE4039716A1 - Verfahren zur aufbereitung von gewebeproben - Google Patents
Verfahren zur aufbereitung von gewebeprobenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung einer
Gewebeprobe, bei dem die Gewebeprobe mit einer sie stabili
sierenden Einbettung versehen wird.
Zur Herstellung von sehr dünnen Gewebeschnitten sind Verfah
ren bekannt, bei denen nach einer Fixierung und Dehydrierung
des Gewebes eine Einbettung in ein das Gewebe härtendes
Material, beispielsweise Paraffin oder Kunststoff, erfolgt.
Als Kunststoffe sind insbesondere Methacrylate, Epoxidharze
und Polyester geeignet. Die herkömmliche Einbettung des Ge
webes in verschiedenen Kunststoffen weist jedoch durch die
stattfindenden Polymerisationsvorgänge den Nachteil auf, daß
aufgrund der erheblichen exothermen Verläufe dieser Reaktio
nen Wärmedenaturierungen eintreten. Darüber hinaus ist es
möglich, daß Teile des Gewebes mit kurzzeitig auftretenden
Radikalen chemische Reaktionen durchführen, die sowohl zu
Veränderungen an Aminogruppen als auch zu Veränderungen im
Bereich von Proteinseitenketten der Gewebesubstanzen führen
können. Schließlich sind auch Veränderungen im Bereich von
Peptidgruppen sowie im Bereich von Hauptketten möglich. Mit
dem bekannten Verfahren aufbereitete Gewebeproben erlauben
es in der Regel auch nicht, immun- und enzymhistochemische
Reaktionen durchzuführen.
Darüber hinaus ist es auch möglich, daß aus der Durchführung
der bislang bekannten Verfahren zur Fixation und Dehydrie
rung zusätzliche Konformationsänderungen im Bereich der
Gewebemoleküle resultieren. Insgesamt kommt es dann zu einem
partiellen oder vollständigen Verlust der Antigenität und
Enzymaktivität im Gewebe. Insbesondere erwies sich bei den
bekannten Verfahren zur Aufbereitung von Gewebeproben nach
Kunststoffeinbettung die Anwendung von polyklonalen und
monoklonalen Antikörpern im Bereich der lichtmikroskopischen
Immunhistochemie und von enzymhistochemischen Methoden somit
als problematisch, d. h., die Methoden führten in der breiten
Anwendung zu keinen reproduzierbaren Ergebnissen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfah
ren zur Aufbereitung einer Gewebeprobe so zu verbessern, daß
eine Beeinflussung von Gewebeeigenschaften weitgehend ausge
schlossen wird.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die
Gewebeprobe mit einer mindestens ein Acrylat enthaltenden
Substanz beaufschlagt und unter Verwendung eines Redoxsys
tems eine Polymerisation bei einer Temperatur unterhalb von
0 Grad Celsius durchgeführt wird.
Die Einbettung der Gewebeprobe in eine acrylathaltige
Substanz gewährleistet eine ausreichende Festigkeit des
präparierten Gewebes und somit die Möglichkeit zur Erzeugung
von dünnen Schnitten mit Schichtdicken im Bereich von etwa
0,5 bis 1 Micrometer (sogenannte Semidünnschnitte). Es ist
aber weiterhin möglich, andere Schnittdicken zu realisieren
und beispielsweise mit Hilfe eines üblichen Rotationsmikro
toms unter Verwendung einer Hartschnitteinrichtung Schnitte
mit Schnittdicken von etwa 4 Micrometern zu erzeugen (soge
nannte Dünnschnitte). Die Durchführung des Polymerisations
vorganges bei einer Temperatur unterhalb von 0 Grad Celsius
führt zu einer wesentlichen Verlangsamung der Reaktionsge
schwindigkeit und somit zu einer geringen Wärmeerzeugung je
Zeiteinheit. Die in diesem Temperaturbereich erzeugte Wärme
kann ohne eine wesentliche Beeinträchtigung der Gewebeprobe
abgeführt werden. Durch den langsamen Ablauf der Polymeri
sationsreaktion sind auch nur geringe Anteile von Reaktions
produkten enthalten, deren Reaktionsfreudigkeit aufgrund der
tiefen Temperaturen erheblich gedämpft ist. Somit wird auch
die Gefahr einer Reaktion von Molekülen des Gewebes mit
Reaktionsprodukten oder Zwischenprodukten erheblich herab
gesetzt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung er
folgt die Polymerisation bei einer Temperatur von etwa minus
10 bis minus 15 Grad Celsius. In diesem Temperaturbereich
läuft der Polymerisationsvorgang zum einen noch so schnell
ab, daß die Präparation des Gewebes innerhalb einer vertret
baren Zeit erfolgen kann, zum anderen ist jedoch die Wärme
erzeugung pro Zeiteinheit so weit herabgesetzt, daß eine
merkliche Beeinträchtigung des Gewebes nicht zu befürchten
ist.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfin
dung besteht die Substanz aus einer Mischung von Methylme
thacrylat und Butylmethacrylat. Diese Methacrylate eignen
sich bei Anwesenheit eines geeigneten Redoxsystemes in be
sonderer Weise zur Durchführung von Kältepolymerisationen in
einem Temperaturbereich unterhalb von 0 Grad Celsius.
Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der
nachfolgenden ausführlichen Beschreibung, in der bevorzugte
Ausführungsformen der Erfindung beispielsweise veranschau
licht sind.
Zur Durchführung des Verfahrens wird ein zu präparierendes
Gewebe zunächst auf eine geeignete Verarbeitungsdicke zuge
schnitten. Beispielsweise werden aus einem Knochentumorge
webe ca. 3 Millimeter dicke Scheiben mit einer als Diamant
säge ausgebildeten Trennvorrichtung im Trennschleifverfahren
herausgeschnitten. Der Zuschnitt von Tumorweichgewebe kann
mit einem Messer erfolgen. In Abhängigkeit von der Größe
einer zur nachfolgenden Polymerisation verwendeten Gelatine
kapsel wird die Fläche der derart hergestellten Scheibe
festgelegt. Bei einer Gelatinekapsel mit einem Durchmesser
von 24 Millimetern ist eine Flächengröße der Einzelprobe von
etwa 15 mal 15 Millimetern zweckmäßig. Bei langen dünnen
Knochenbiopsien können mehrere Teilstücke nebeneinander beim
Einbetten positioniert werden. Knochenbiopsien mit einem
größeren Durchmesser können mittels einer Bohrlochschablone
unter Benutzung einer Rasierklinge längsgeteilt werden.
Weichgewebe ist problemlos auf die genannte Größe
zuzuschneiden.
Als Fixationsflüssigkeit ist eine Substanz geeignet, die aus
einer 1,6 prozentigen Paraformaldehydlösung besteht, die mit
einem 0,02 molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von etwa
7,4 sowie einer 5 prozentigen Succroselösung kombiniert ist.
Die Fixationslösung wird aus gekühlten Vorratslösungen in
Dispensetten durch Mischung hergestellt. Je Probe werden
etwa 20 Milliliter Fixationslösung benutzt. Die Fixation
wird als Kältefixation bei einer Temperatur von etwa 4 Grad
Celsius durchgeführt. Hieraus resultiert, daß die Osmolari
tät der Fixationsflüssigkeit von Bedeutung ist. Der theore
tische Wert liegt bei der oben angegebenen Fixationsflüssig
keit bei etwa 680 mOsm/Kg und weist eine gewisse Schwankung
auf. Eine achtprozentige Paraformaldehydlösung liegt in
ihrer Osmolarität zwischen etwa 2200 und 2300 mOsm/Kg. Die
Fixationslösung entsteht durch eine Mischung von 4 Millili
tern achtprozentiger Paraformaldehydlösung, 6 Millilitern
0,04 molarem Phosphatpuffer mit einem zehnprozentigen
Succrosegehalt bei einem pH-Wert von 7,4. Es werden 10
Milliliter destilliertes Wasser hinzugefügt. Die 0,04molare
Phosphatpufferlösung wird aus einer Phosphatpufferstamm
lösung aus Na2HPO4 mit einem Molargewicht von 142, sowie
einem KH2PO4-Anteil mit einem Molargewicht von 136 mit einem
molaren Verhältnis der beiden Substanzen im Ansatz 3,5 : 1
hergestellt. Die benötigte Menge wird bis zu ihrem Verbrauch
kühl gelagert. Zur Konservierung der Puffer-Succrose-Lösung
wird 0,1% Natriumazid zugegeben. Für die Durchführung der
Fixation wird ein Zeitraum von etwa 24 Stunden benötigt.
Diese Zeit kann verlängert werden, eine Verkürzung ist je
doch von Nachteil auf die Fixationsergebnisse. Von besonde
rer Bedeutung für die Qualität der Fixation ist auch die
Einhaltung der Temperatur von etwa 4 Grad Celsius. Eine
Erneuerung der Fixationsflüssigkeit sollte einmal nach etwa
1 bis 2 Stunden erfolgen, da bei der Fixation Formalin
verbraucht wird und in der verwendeten Lösung nur geringe
Konzentrationen vorliegen.
Nach einer Durchführung der Fixation wird das fixierte Ge
webe in Abhängigkeit von der Probengröße ein- oder zweimal
bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius in einem 0,2
molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 mit einem
fünfprozentigen Succroselösungszusatz gespült, die aus der
bereits erwähnten Vorratslösung durch eine Verdünnung mit
destilliertem Wasser im Verhältnis von 1 : 1 hergestellt
wird. Durch diese Gewebespülung wird das Formalin ausgewa
schen. Nach der Durchführung dieser Auswaschung wird das
Gewebe eingekapselt und die Gewebekapseln in einem Vorrats
behälter, beispielsweise einer Kastenküvette, mit ca. 300
Kubikzentimetern der gleichen Pufferlösung für etwa 24
Stunden zu einer Demaskierung antigener Determinaten und
einer Enzymaktivierung belassen.
Im Anschluß an diese Gewebespülung und Reaktivierung wird
eine Dehydrierung durchgeführt. Der Dehyderierungsvorgang
wird gleichfalls als Kaltdehyderierung durchlaufen. Hierzu
wird sehr reines Azeton in einer aufsteigenden Konzentra
tionsreihe verwendet. Als Intermedium ist Xylol geeignet.
Die erforderlichen Arbeitsschritte können entweder manuell
durch Umsetzen der Proben über Lösungen in Kastenküvetten
oder über Einbettungsautomaten realisiert werden.
Nach der Dehydrierung der Proben erfolgt die Methacrylat
einbettung. Das verwendete Methacrylatgemisch wird aus einem
Methylmethacrylat und einem Butylmethacrylat hergestellt.
Zunächst werden diese Komponenten jeweils isoliert voneinan
der säulenchromatographisch mit Aluminiumoxid entstabili
siert (Entfernung des Stabilisators Hydrochinon) und die
dabei entstehenden entstabilisierten Monomere mit Kupfer
sulfat nachgetrocknet. Die derart hergestellten Komponenten
können verschlossen bei einer Temperatur von etwa 4 Grad
Celsius aufbewahrt werden. Das entstabilisierte Methylmetha
crylat wird zur Herstellung der einen Methacrylatkomponente
gekühlt mit etwa 2 Gewichtsprozenten Benzozylperoxid ver
setzt und durch Rühren gut gelöst. Das Benzozylperoxid wurde
zuvor bei etwa 37 bis 40 Grad Celsius für einen Zeitraum von
etwa 1 bis 2 Tagen getrocknet. Die fertiggestellte Methyl
methacrylatkomponente kann bei einer Temperatur von etwa 4
Grad Celsius gelagert werden. Eine zweite, die Butylmetha
crylatkomponente wird bezogen auf die Butylmethacrylatmenge
mit zwei Volumenprozenten Polyethylenglykol (Molargewicht:
400) in ein Reagenzglas pipettiert und ein Volumenprozent
N,N-Dimethyl-p-Toluidin hinzugegeben. Die Substanzen werden
anschließend gut gemischt. Das Polyethylenglykol dient hier
bei als Lösungsvermittler und als äußerer Weichmacher. Nach
der Hinzugabe von 5 Volumenprozenten entstabilisiertem und
auf eine Temperatur von 4 Grad Celsius gekühltem Butyl
methacrylat wird wiederum gut gemischt und anschließend die
gesamte Mischung in das gekühlte und entstabilisierte Bu
tylmethacrylat gegeben. Das eine Funktion als innerer Weich
macher ausübende Butylmethacrylat weist hierbei eine Menge
von 92 Volumenprozenten auf. Die fertiggestellte Butymetha
krylatkomponente kann bei einer Temperatur von etwa 4 Grad
Celsius gelagert werden. Der geschilderte Lösungsvorgang von
N,N-Dimethyl-p-Toluidin dient zur gleichmäßigen Verteilung
in der Butylmethacrylatkomponente.
Vor der Methacrylateinbettung werden die fixierten und dehy
drierten Gewebeproben bei einer Temperatur von etwa 4 Grad
Celsius für 1 bis 2 Stunden mit einer Mischung von stabili
siertem Methylmethacrylat und Xylol im Verhältnis 1 : 1
durchtränkt. Anschließend erfolgt eine weitere Durchtränkung
der Gewebeproben für einen Zeitraum von etwa 12 Stunden bis
zu 3 Tagen bei einer Temperatur von 4 Grad Celsius mit einem
entstabilisierten Gemisch aus Methyl- und Butylmethacrylat
im Verhältnis von 2 : 3 unter Zusatz von 1,5 Gewichtsprozen
ten getrocknetem Benzozylperoxid sowie 2% Polyethylen
glykol (Molargewicht : 400).
Die vorbehandelten Proben werden dann in eine Gelatinekapsel
gegeben und mit einer frisch zubereiteten Mischung aus der
Methylmethacrylatkomponente und der Butylmethacrylatkompo
nente im Verhältnis von 2 : 3 überschichtet. Die Kapsel wird
anschließend verschlossen und bei einer Temperatur von etwa
minus 10 bis etwa minus 15 Grad Celsius für einen Zeitraum
von etwa 12 bis 24 Stunden einem Polymerisierungsvorgang
unterworfen. Anschließend erfolgt eine Nachpolymerisation
für etwa 2 Stunden bei etwa plus 4 Grad Celsius, für einen
Zeitraum von etwa einer Stunde bei Zimmertemperatur sowie
für einen Zeitraum von etwa 12 Stunden bei einer Temperatur
von etwa 37 bis 40 Grad Celsius.
Die Entstabilisierung der Methacrylate mit Hilfe des Alumi
niumoxides im Bereich der Chromatographiesäule erfolgt mit
basischem Aluminiumoxid. Etwa 300 ccm Aluminiumoxidpulver
werden benötigt, um etwa 1500 ccm Methacrylatflüssigkeit zu
entstabilisieren. Die Entstabilisierung erfolgt durch die
Entfernung des als Stabilisator wirkenden Hydrochinons aus
der Flüssigkeit.
Die in der Mischung der Methylmethacrylatkomponente und der
Butylmethacylatkomponente enthaltenen Anteile aus Benzozyl
peroxid wirken als Katalysator und die Anteile von N,N-
Dimethyl-p-Toluidin als Initiator der Polymerisationsreak
tion (Redoxsystem). Nur diese angegebenen Konzentrationen
beider Substanzen ermöglichen die gesteuerte Polymerisation
bei der niedrigen Temperatur von minus 10 bis minus 15 Grad
Celsius.
Bevor die vorbehandelten Proben in die Gelatinekapseln gege
ben werden, wird in den etwa halbkugligen Boden der Kapseln
ein monomeres entstabilisiertes Methylmethacrylat gegeben
und unter Zusatz von etwa 3 Gewichtsprozenten getrocknetem
Benzozylperoxid bei etwa 37 bis 40 Grad Celsius eine Polyme
risation durchgeführt. Diese vorpolymerisierten Kapseln
werden in einem Wärmeschrank bevorratet. Auf die vorpoly
mersisierte Methacrylatschicht wird dann anschließend die
Gewebeprobe aufgelegt und die Kapsel bis zum Kapselrand mit
der Mischung aus der Methylkomponente und der Butylkompo
nente gefüllt und gut verschlossen sowie zur Verhinderung
von Sauerstoffzutritt mit einem farblosen Nagellack am
Kapselverschluß umrandet (zusätzliche Abdichtung).
Nach der Durchführung der Nachpolymerisation bei etwa 4 Grad
Celsius weisen die polymerisierten Gewebeproben einen schma
len, zähelastischen bis zähflüssigen Überstand auf. Dieser
resultiert aus verbleibenden und die Polymerisation stören
den Luftresten in der Kapsel. Durch den aus der Anwesenheit
von Luftresten resultierenden Sauerstoffzutritt wird die
Polymerisation gestört und durch die leichte Volumen
schrumpfung des Polymerisates kann bei schlechter Abdichtung
zusätzlich Luft gezogen werden. Das obere Viertel des Poly
merisates mit dem weichen Überstand wird deshalb mittels
einer kleinen Kreissäge unter Wasserkühlung abgetrennt. Bei
diesem Schneidvorgang, der auch mit anderen Schneidgeräten
durchgeführt werden kann, wirkt das Wasser nicht nur als
Kühlung, sondern auch als Gleitmittel. Von dem derart vorbe
reiteten Block kann die Gelatinekapsel in kaltem Wasser
abgeweicht werden. Eine Nachbearbeitung des Blockes an der
Gewebeeinbettungsseite erfolgt mit einer Feile, ein soge
nanntes Trimmen der Schnittfläche für die anschließende
Schnittpräparation mittels Hartschnittmikrotom. Die Objekt
trägerbeschichtung erfolgt mit Chromalaun-Gelatine. Das
Pressen und Trocknen der Schnitte erfolgt nach bekannten
Arbeitsgängen der Hartschnittpräparation. Als Schneid- und
Streckflüssigkeit ist die Verwendung von siebzig- bis acht
zigprozentigem Äthanol zweckmäßig. Im Gegensatz zur Ver
wendung von Methylglykolazetat wird durch die Verwendung von
Äthanol die Gefahr einer Freisetzung von Essigsäure durch
Hydrolyse vermieden, wenn keine absolut wasserfreie Flüssig
keit vorliegt. Diese kann zur Beeinträchtigung des Gewebes
mit negativem Ausfall der angestrebten Untersuchungen in
der Immun- und Enzymhystochemie führen.
Nach der Herstellung der dünnen Gewebeschnitte erfolgt eine
Herauslösung des Polymethacrylates aus dem Gewebe (sog.
Entakrylierung), um eine Demaskierung der Antigene
durchzuführen und eine gegebenenfalls vorhandene unspezi
fische Untergrundfärbung bei immunhistochemischen Nachweisen
zu vermeiden. Zur restlosen Herauslösung des Polymethacry
lates ist die kombinierte Verwendung von Xylol, wasserfreiem
Methylglykolazetat und Azeton Voraussetzung. Nach der
Herauslösung der Methacrylate erfolgt ein Nachspülen mit
destilliertem Wasser zur Rehydrierung der Schnittpräparate
und anschließend die Überführung in die gewünschte gepuffer
te wäßrige Lösung.
Bei der Durchführung von immunhistochemischen Untersuchungen
ist es vorteilhaft, die entacrylierten und gepufferten
Schnittpräparate zur Reduktion der unspezifischen Unter
grundfärbung mit einem zehnprozentigen Normalserum der Tier
spezies zu behandeln, die zur Herstellung des Brückenanti
körpers dient. Das Normalserum wird mit einem 0,01 molaren
Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 unter Zusatz von
4% BSA versetzt. Als Brückenantikörper kann beim Arbeiten
im ABC-System (Avidin-Biotin-Komplex) mit monoklonalen
Antikörpern von der Maus ein biotinylierter Antikörper vom
Kaninchen-Anti-Mausglobulin bzw. bei der Verwendung von
polyklonalen Antikörpern vom Kaninchen ein Immunserum vom
Schwein-Anti-Kaninchenglobulin vorgesehen werden.
Eine Hemmung der endogenen Peroxidase kann mit einem frisch
angesetzten 0,6 prozentigen Gemisch aus Methanol und Wasser
erfolgen. Dieser Vorgang wird entgegengesetzt der üblichen
Arbeitsvorschriften nach der Inkubation mit dem Primäranti
körper durchgeführt. Der Brückenantikörper kommt in einer
Verdünnung von etwa 1 : 300 sowohl für das monoklonale als
auch für das poliklonale System zur Anwendung. Als Chromogen
kann Diaminobenzidin verwendet werden, um die Präparate über
die aufsteigende Alkoholreihe nach vorheriger Gegenfärbung
mit Hämalaun bearbeiten zu können.
Bei der Aufbereitung von Gewebeproben für osteologische
Untersuchungen, die nicht als Frischmaterial verfügbar sind,
wird das Gewebe nach einer Formalinfixation für etwa 2 bis 3
Tage in dem zur Fixation verwendeten Puffer-Succrosegemisch
belassen. Diese Lagerung erfolgt bei etwa 4 Grad Celsius und
reduziert durch diesen Waschvorgang die Antigenmaskierung.
Eine Umbettung von zuvor in Paraffin eingebettetem Tumorge
webe kann nach einem Herausschneiden eines interessierenden
Blockgebietes und einer Entparaffinierung erfolgen. Nach
einer Xylolbehandlung wird die Probe zur Durchtränkung in
das Methacrylatgemisch oder zur Antigenreaktivierung nach
vorheriger Rehydrierung über eine absteigende Konzentra
tionsreihe von Äthanol in die gesamte Puffer-Succrose-
Lösung eingebracht. Anschließend können die bereits be
schriebenen Arbeitsschritte der Methacrylateinbettung er
folgen.
Bei der Durchführung des Einbettungsverfahrens wird durch
die Verwendung der entstabilisierten monomeren Methacrylate
eine Herabsenkung der Dibenzozylperoxidkonzentration auf
einen Anteil von unterhalb 1 Gewichtsprozent ermöglicht. Die
bei höheren Benzozylperoxidkonzentrationen beobachteten Hem
mungen von einigen Enzymen werden so vermieden. Aufgrund der
vorgeschlagenen Konzentrationen und Reaktionstemperaturen
läuft die Polymerisierung derart langsam ab, daß es bei
einem Polymerisationsgemisch von etwa von 20 ccm nur zu
einer Temperaturerhöhung von etwa 1 bis 2 Grad nach einer
Latenzzeit von etwa 2 bis 3 Stunden kommt. Die geringe
Temperaturerhöhung erfolgt für einen Zeitraum von etwa 1,5
Stunden.
In Fig. 1 ist skizzenhaft dargestellt, wie das Polymeri
sationsgemisch hergestellt wird. Die Methylmethacrylatkom
ponente (1) wird durch Mischung von entstabilisiertem und
nachgetrocknetem monomeren Methylmethacrylat und zwei
Gewichtsprozenten getrocknetem Benzozylperoxid bei vier Grad
Celsius hergestellt. Die Methylmethacrylatkomponente (2)
entsteht durch die Vermischung von entstabilisiertem nach
getrockneten monomeren Butylmethacrylat sowie zwei Volumen
prozenten Polyethylenglykol mit einem Molargewicht von vier
hundert und einem Volumenprozent N,N-Dimethyl-p-Toluidin
bei einer Temperatur von 4 Grad Celsius. Die Methylmethacry
latkomponente (1) und die Butylmethacrylatkomponente (2)
werden zu einem Polymerisationsgemisch (3) vermengt, das
zwei Volumenteile der Methylmethacrylatkomponente (1) sowie
drei Volumenteile der Butylmethacrylatkomponente (2) ent
hält. Die Polymerisationstemperatur liegt im Bereich von
minus 10 bis minus 15 Grad Celsius und die primäre Polymeri
sationszeit beträgt etwa 12 bis 24 Stunden.
In Fig. 2 sind die wesentlichen Verfahrensschritte des
Verfahrenslaufes zur Aufbereitung der Gewebeprobe darge
stellt. Nach einem Gewebezuschnitt (4) erfolgt eine Fixation
(5) mit Hilfe einer 1,6%igen Paraformaldehyd - 0,02molaren
Phosphat-puffer - fünfprozentigen - Succroselösung bei einer
Temperatur von etwa 5 Grad Celsius und einem pH-Wert von
etwa 7,4. Die Fixation wird für einen Zeitraum von etwa 24
Stunden bis 3 Tagen durchgeführt. Nach der Fixation (5)
erfolgt die Dehydrierung (6) zunächst mit siebzigprozentigem
Azeton, anschließend mit neunzigprozentigem Azeton und
danach 3-fach mit hundertprozentigem Azeton (reinst).
Abschließend erfolgt eine weitere zweifache Beaufschlagung
mit Xylol. Die Dehydrierung erfolgt bei einer Temperatur von
etwa 4 Grad Celsius.
Nach der Dehydrierung (6) erfolgt eine Durchtränkung (7) mit
entstabilisiertem monomeren Methyl- und Butylmethacrylat mit
Benzozylperoxyd und Polyethylenglykol in zwei Stufen unter
Benutzung von Xylol während der ersten Stufe bei einer
Temperatur von etwa 4 Grad Celsius. Nach einer Einbringung
(8) in eine vorpolymerisisierte Gelatinekapsel erfolgt eine
Gewebepolymerisation (9) und eine Nachpolymerisation mit den
Methacrylatkomponenten. Eine Dünnschnittherstellung (10)
erfolgt mittels einer Hartschnittmikrotomie und abschließend
wird eine Dünnschnittentakrylierung (11) sowie eine Rehy
drierung durchgeführt.
Claims (34)
1. Verfahren zur Aufbereitung einer Gewebeprobe, bei dem die
Gewebeprobe mit einer sie stabilisierenden Einbettung verse
hen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe mit
einer mindestens ein Acrylat enthaltenden Substanz beauf
schlagt wird und unter Verwendung eines Redoxsystemes eine
Polymerisation bei einer Temperatur unterhalb von 0 Grad
Celsius durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die Polymerisation in einem Temperaturbereich von etwa minus
10 bis minus 15 Grad Celsius durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die die Gewebeprobe beaufschlagende Substanz aus einer
Methylmethacrylatkomponente und einer Butylmethacrylatkom
ponente gemischt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß das Redoxsystem aus einer Mischung von Benzozylperoxid
und N,N-Dimethyl-p-Toluidin hergestellt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die Methylmethacrylatkomponente aus einem mit Hilfe von
Aluminiumoxid entstabilisierten Methylmethacrylat herge
stellt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß das entstabilisierte Methylmethacrylat mit Kupfersulfat
nachgetrocknet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die nachgetrocknete Methylmethacrylatkomponente bei
einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius gelagert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die Butylmethacrylatkomponente aus einem mit Hilfe von
Aluminiumoxid entstabilisierten Butylmethacrylat hergestellt
wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß das entstabilisierte Butylmethacrylat mit Kupfersulfat
nachgetrocknet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die Butylmethacrylatkomponente bei einer Temperatur von
etwa 4 Grad Celsius gelagert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeich
net, daß das entstabilisierte und nachgetrocknete Methylme
thacrylat gekühlt mit 2 Gewichtsprozenten Benzozylperoxid
versetzt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeich
net, daß das Benzozylperoxid vor einer Zugabe zum Methylme
thacrylat bei einer Temperatur von etwa 37 bis 40 Grad
Celsius für einer Zeitraum von etwa 1 bis 2 Tagen getrocknet
wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeich
net, daß eine durch die Mischung des entstabilisierten
Methylmethacrylates und des Benzozylperoxides hergestellte
Methylmethacrylatkomponente bei einer Temperatur von etwa 4
Grad Celsius gelagert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeich
net, daß das entstabilisierte und nachgetrocknete Butylme
thacrylat mit 2 Volumenprozenten Polyethylenglykol (Molarge
wicht : 400) versetzt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß
1 Volumenprozent N,N-Dimethyl-p-Toluidin hinzugegeben wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeich
net, daß die 2 Volumenprozente Polyethylenglykol (Molarge
wicht : 400) und das 1 Volumenprozent N,N-Dimethyl-p-Tolui
din zunächst mit 5 Volumenprozenten entstabilisiertem und
auf eine Temperatur von 4 Grad Celsius gekühlten Butylme
thacrylat vermischt wird und anschließend die restlichen 92
Volumenprozent Butylmethacrylat hinzugegeben werden.
17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeich
net, daß eine aus der Mischung von Polyethylenglykol, N,N-
Dimethyl-p-Toluidin sowie Butylmethacrylat hergestellte
Butylmethacrylatkomponente bei einer Temperatur von etwa 4
Grad Celsius aufbewahrt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeich
net, daß eine Gewebeprobe vor ihrer Einbettung in wäßriger
Lösung fixiert wird.
19. Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeich
net, daß die Fixierung unter Anwesenheit einer 1,6 prozenti
gen Paraformaldehydlösung, eines 0,02 molaren Phosphatpuf
fers mit einem pH-Wert von 7,4 sowie einer fünfprozentigen
Succroselösung durchgeführt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeich
net, daß die Fixierung bei einer Temperatur von etwa 4 Grad
Celsius durchgeführt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeich
net, daß die fixierte Gewebeprobe bei einer Temperatur von
etwa 4 Grad Celsius in einem 0,02 molaren Phosphatpuffer mit
einem pH-Wert von etwa 7,4 und einer fünfprozentigen Succro
selösung gespült wird.
22. Verfahren nach Anspruch 1 bis 21, dadurch gekennzeich
net, daß die fixierte Gewebeprobe dehydriert wird.
23. Verfahren nach Anspruch 1 bis 22, dadurch gekennzeich
net, daß die Dehydrierung unter Anwesenheit von Azeton sowie
Xylol durchgeführt wird.
24. Verfahren nach Anspruch 1 bis 23, dadurch gekennzeich
net, daß die dehydrierte Gewebeprobe für einen Zeitraum von
etwa 1 bis 2 Stunden bei einer Temperatur von etwa 4 Grad
Celsius mit Hilfe einer Mischung von Methylmethacrylat und
Xylol im Verhältnis von etwa 1 : 1 durchgetränkt wird
(Imersion).
25. Verfahren nach Anspruch 1 bis 24, dadurch gekennzeich
net, daß die dehydrierten und durchgetränkten Gewebeproben
für einen Zeitraum von etwa 12 Stunden bis 3 Tagen bei einer
Temperatur von etwa 4 Grad Celsius mit einem entstabilisier
ten Gemisch aus Methyl- und Butylmethacrylat in einem Ver
hältnis von etwa 2 : 3 unter Zusatz von 1,5 Gewichtsprozen
ten Benzozylperoxid und 2 Prozent Polyethylenglykol
durchtränkt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 1 bis 25, dadurch gekennzeich
net, daß eine die Gewebeprobe aufnehmende Gelatinekapsel mit
Methylmethacrylat unter Zusatz von 3 Gewichtsprozent Ben
zozylperoxid unter Ausfüllung des halbkugligen Bodens bei 37
bis 40 Grad Celsius vorpolymerisiert wird.
27. Verfahren nach Anspruch 1 bis 26, dadurch gekennzeich
net, daß die vorpolymerisierte Gelatinekapsel nach einer
Aufnahme der vorbehandelten Gewebeprobe mit einer Mischung
der Methylmethacrylatkomponente und der Butylmethacrylatkom
ponente im Verhältnis von 2 : 3 aufgefüllt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 1 bis 27, dadurch gekennzeich
net, daß die Polymerisierung bei etwa minus 10 Celsius bis
etwa minus 15 Grad Celsius für einen Zeitraum von etwa 12
bis 24 Stunden durchgeführt wird.
29. Verfahren nach Anspruch 1 bis 28, dadurch gekennzeich
net, daß eine Nachpolymerisation durchgeführt wird.
30. Verfahren nach Anspruch 1 bis 29, dadurch gekennzeich
net, daß eine erste Nachpolymerisation für einen Zeitraum
von etwa 2 Stunden bei einer Temperatur von etwa 4 Grad
Celsius durchgeführt wird.
31. Verfahren nach Anspruch 1 bis 30, dadurch gekennzeich
net, daß eine zweite Nachpolymerisation für einen Zeitraum
von etwa einer Stunde bei Zimmertemperatur durchgeführt
wird.
32. Verfahren nach Anspruch 1 bis 31, dadurch gekennzeich
net, daß eine dritte Nachpolymerisation für einen Zeitraum
von etwa 12 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37 bis 40
Grad Celsius durchgeführt wird.
33. Verfahren nach Anspurch 1 bis 32, dadurch gekennzeich
net, daß die mittels Hartschnittmikrotomie gewonnenen Dünn
schnitte auf Chromalaun-Gelatine beschichteten Objektträgern
mit siebzig- bis achtzigprozentigem Äthanol gestreckt und
anschließend für 24 Stunden bei etwa 37 Grad Celsius gepreßt
und getrocknet werden.
34. Verfahren nach Anspruch 1 bis 33, dadurch gekennzeich
net, daß die Dünnschnitte durch Behandlung mit Xylol
(2 × 20′), Methylglykolazetat absolut (20′) und Azeton reinst
(2 × 5′) entakryliert, danach mit Aqua dest. (2 × 2′) rehydriert
und anschließend ohne Zwischentrocknung in der gewünschten
Pufferlösung für die immun- bzw. enzymhistochemische Bear
beitung eingebracht werden.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19904039716 DE4039716A1 (de) | 1990-12-13 | 1990-12-13 | Verfahren zur aufbereitung von gewebeproben |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19904039716 DE4039716A1 (de) | 1990-12-13 | 1990-12-13 | Verfahren zur aufbereitung von gewebeproben |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4039716A1 true DE4039716A1 (de) | 1992-06-17 |
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ID=6420170
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19904039716 Withdrawn DE4039716A1 (de) | 1990-12-13 | 1990-12-13 | Verfahren zur aufbereitung von gewebeproben |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4039716A1 (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10021390A1 (de) * | 2000-05-03 | 2001-11-15 | Juergen Olert | Protektionslösung und Fixierverfahren für die Paraffinschnitt-Technik |
DE102010012546A1 (de) * | 2010-02-25 | 2011-08-25 | Burkhardt, Arne, Prof. Dr., 72764 | Verfahren zur Aufarbeitung und Optimierung von Zell- oder Gewebematerial für die Zytologie bzw. Histologie |
EP4145105A1 (de) | 2021-09-06 | 2023-03-08 | Anacyte Laboratories GmbH | Lösung für die asservierung von zellen |
-
1990
- 1990-12-13 DE DE19904039716 patent/DE4039716A1/de not_active Withdrawn
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DE10021390A1 (de) * | 2000-05-03 | 2001-11-15 | Juergen Olert | Protektionslösung und Fixierverfahren für die Paraffinschnitt-Technik |
DE10021390C2 (de) * | 2000-05-03 | 2002-06-27 | Juergen Olert | Protektionslösung und Fixierverfahren für die Paraffinschnitt-Technik |
DE102010012546A1 (de) * | 2010-02-25 | 2011-08-25 | Burkhardt, Arne, Prof. Dr., 72764 | Verfahren zur Aufarbeitung und Optimierung von Zell- oder Gewebematerial für die Zytologie bzw. Histologie |
DE102010012546B4 (de) | 2010-02-25 | 2018-09-13 | Institut für Pathologie Kaufbeuren-Ravensburg GbR (Vertretungsberechtigter Gesellschafter: Herr PD Dr. med. Stephan Schwarz-Furlan, 87600 Kaufbeuren) | Verfahren zur Aufarbeitung und Optimierung von Zell- oder Gewebematerial für die Zytologie bzw. Histologie |
EP4145105A1 (de) | 2021-09-06 | 2023-03-08 | Anacyte Laboratories GmbH | Lösung für die asservierung von zellen |
WO2023031467A1 (de) | 2021-09-06 | 2023-03-09 | Anacyte Laboratories Gmbh | Lösung für die asservierung von zellen |
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