DE4039716A1 - Verfahren zur aufbereitung von gewebeproben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung einer Gewebeprobe, bei dem die Gewebeprobe mit einer sie stabili­ sierenden Einbettung versehen wird.

Zur Herstellung von sehr dünnen Gewebeschnitten sind Verfah­ ren bekannt, bei denen nach einer Fixierung und Dehydrierung des Gewebes eine Einbettung in ein das Gewebe härtendes Material, beispielsweise Paraffin oder Kunststoff, erfolgt. Als Kunststoffe sind insbesondere Methacrylate, Epoxidharze und Polyester geeignet. Die herkömmliche Einbettung des Ge­ webes in verschiedenen Kunststoffen weist jedoch durch die stattfindenden Polymerisationsvorgänge den Nachteil auf, daß aufgrund der erheblichen exothermen Verläufe dieser Reaktio­ nen Wärmedenaturierungen eintreten. Darüber hinaus ist es möglich, daß Teile des Gewebes mit kurzzeitig auftretenden Radikalen chemische Reaktionen durchführen, die sowohl zu Veränderungen an Aminogruppen als auch zu Veränderungen im Bereich von Proteinseitenketten der Gewebesubstanzen führen können. Schließlich sind auch Veränderungen im Bereich von Peptidgruppen sowie im Bereich von Hauptketten möglich. Mit dem bekannten Verfahren aufbereitete Gewebeproben erlauben es in der Regel auch nicht, immun- und enzymhistochemische Reaktionen durchzuführen.

Darüber hinaus ist es auch möglich, daß aus der Durchführung der bislang bekannten Verfahren zur Fixation und Dehydrie­ rung zusätzliche Konformationsänderungen im Bereich der Gewebemoleküle resultieren. Insgesamt kommt es dann zu einem partiellen oder vollständigen Verlust der Antigenität und Enzymaktivität im Gewebe. Insbesondere erwies sich bei den bekannten Verfahren zur Aufbereitung von Gewebeproben nach Kunststoffeinbettung die Anwendung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern im Bereich der lichtmikroskopischen Immunhistochemie und von enzymhistochemischen Methoden somit als problematisch, d. h., die Methoden führten in der breiten Anwendung zu keinen reproduzierbaren Ergebnissen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfah­ ren zur Aufbereitung einer Gewebeprobe so zu verbessern, daß eine Beeinflussung von Gewebeeigenschaften weitgehend ausge­ schlossen wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Gewebeprobe mit einer mindestens ein Acrylat enthaltenden Substanz beaufschlagt und unter Verwendung eines Redoxsys­ tems eine Polymerisation bei einer Temperatur unterhalb von 0 Grad Celsius durchgeführt wird.

Die Einbettung der Gewebeprobe in eine acrylathaltige Substanz gewährleistet eine ausreichende Festigkeit des präparierten Gewebes und somit die Möglichkeit zur Erzeugung von dünnen Schnitten mit Schichtdicken im Bereich von etwa 0,5 bis 1 Micrometer (sogenannte Semidünnschnitte). Es ist aber weiterhin möglich, andere Schnittdicken zu realisieren und beispielsweise mit Hilfe eines üblichen Rotationsmikro­ toms unter Verwendung einer Hartschnitteinrichtung Schnitte mit Schnittdicken von etwa 4 Micrometern zu erzeugen (soge­ nannte Dünnschnitte). Die Durchführung des Polymerisations­ vorganges bei einer Temperatur unterhalb von 0 Grad Celsius führt zu einer wesentlichen Verlangsamung der Reaktionsge­ schwindigkeit und somit zu einer geringen Wärmeerzeugung je Zeiteinheit. Die in diesem Temperaturbereich erzeugte Wärme kann ohne eine wesentliche Beeinträchtigung der Gewebeprobe abgeführt werden. Durch den langsamen Ablauf der Polymeri­ sationsreaktion sind auch nur geringe Anteile von Reaktions­ produkten enthalten, deren Reaktionsfreudigkeit aufgrund der tiefen Temperaturen erheblich gedämpft ist. Somit wird auch die Gefahr einer Reaktion von Molekülen des Gewebes mit Reaktionsprodukten oder Zwischenprodukten erheblich herab­ gesetzt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung er­ folgt die Polymerisation bei einer Temperatur von etwa minus 10 bis minus 15 Grad Celsius. In diesem Temperaturbereich läuft der Polymerisationsvorgang zum einen noch so schnell ab, daß die Präparation des Gewebes innerhalb einer vertret­ baren Zeit erfolgen kann, zum anderen ist jedoch die Wärme­ erzeugung pro Zeiteinheit so weit herabgesetzt, daß eine merkliche Beeinträchtigung des Gewebes nicht zu befürchten ist.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfin­ dung besteht die Substanz aus einer Mischung von Methylme­ thacrylat und Butylmethacrylat. Diese Methacrylate eignen sich bei Anwesenheit eines geeigneten Redoxsystemes in be­ sonderer Weise zur Durchführung von Kältepolymerisationen in einem Temperaturbereich unterhalb von 0 Grad Celsius.

Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung, in der bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielsweise veranschau­ licht sind.

Zur Durchführung des Verfahrens wird ein zu präparierendes Gewebe zunächst auf eine geeignete Verarbeitungsdicke zuge­ schnitten. Beispielsweise werden aus einem Knochentumorge­ webe ca. 3 Millimeter dicke Scheiben mit einer als Diamant­ säge ausgebildeten Trennvorrichtung im Trennschleifverfahren herausgeschnitten. Der Zuschnitt von Tumorweichgewebe kann mit einem Messer erfolgen. In Abhängigkeit von der Größe einer zur nachfolgenden Polymerisation verwendeten Gelatine­ kapsel wird die Fläche der derart hergestellten Scheibe festgelegt. Bei einer Gelatinekapsel mit einem Durchmesser von 24 Millimetern ist eine Flächengröße der Einzelprobe von etwa 15 mal 15 Millimetern zweckmäßig. Bei langen dünnen Knochenbiopsien können mehrere Teilstücke nebeneinander beim Einbetten positioniert werden. Knochenbiopsien mit einem größeren Durchmesser können mittels einer Bohrlochschablone unter Benutzung einer Rasierklinge längsgeteilt werden. Weichgewebe ist problemlos auf die genannte Größe zuzuschneiden.

Als Fixationsflüssigkeit ist eine Substanz geeignet, die aus einer 1,6 prozentigen Paraformaldehydlösung besteht, die mit einem 0,02 molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 7,4 sowie einer 5 prozentigen Succroselösung kombiniert ist. Die Fixationslösung wird aus gekühlten Vorratslösungen in Dispensetten durch Mischung hergestellt. Je Probe werden etwa 20 Milliliter Fixationslösung benutzt. Die Fixation wird als Kältefixation bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius durchgeführt. Hieraus resultiert, daß die Osmolari­ tät der Fixationsflüssigkeit von Bedeutung ist. Der theore­ tische Wert liegt bei der oben angegebenen Fixationsflüssig­ keit bei etwa 680 mOsm/Kg und weist eine gewisse Schwankung auf. Eine achtprozentige Paraformaldehydlösung liegt in ihrer Osmolarität zwischen etwa 2200 und 2300 mOsm/Kg. Die Fixationslösung entsteht durch eine Mischung von 4 Millili­ tern achtprozentiger Paraformaldehydlösung, 6 Millilitern 0,04 molarem Phosphatpuffer mit einem zehnprozentigen Succrosegehalt bei einem pH-Wert von 7,4. Es werden 10 Milliliter destilliertes Wasser hinzugefügt. Die 0,04molare Phosphatpufferlösung wird aus einer Phosphatpufferstamm­ lösung aus Na2HPO4 mit einem Molargewicht von 142, sowie einem KH2PO4-Anteil mit einem Molargewicht von 136 mit einem molaren Verhältnis der beiden Substanzen im Ansatz 3,5 : 1 hergestellt. Die benötigte Menge wird bis zu ihrem Verbrauch kühl gelagert. Zur Konservierung der Puffer-Succrose-Lösung wird 0,1% Natriumazid zugegeben. Für die Durchführung der Fixation wird ein Zeitraum von etwa 24 Stunden benötigt. Diese Zeit kann verlängert werden, eine Verkürzung ist je­ doch von Nachteil auf die Fixationsergebnisse. Von besonde­ rer Bedeutung für die Qualität der Fixation ist auch die Einhaltung der Temperatur von etwa 4 Grad Celsius. Eine Erneuerung der Fixationsflüssigkeit sollte einmal nach etwa 1 bis 2 Stunden erfolgen, da bei der Fixation Formalin verbraucht wird und in der verwendeten Lösung nur geringe Konzentrationen vorliegen.

Nach einer Durchführung der Fixation wird das fixierte Ge­ webe in Abhängigkeit von der Probengröße ein- oder zweimal bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius in einem 0,2 molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 mit einem fünfprozentigen Succroselösungszusatz gespült, die aus der bereits erwähnten Vorratslösung durch eine Verdünnung mit destilliertem Wasser im Verhältnis von 1 : 1 hergestellt wird. Durch diese Gewebespülung wird das Formalin ausgewa­ schen. Nach der Durchführung dieser Auswaschung wird das Gewebe eingekapselt und die Gewebekapseln in einem Vorrats­ behälter, beispielsweise einer Kastenküvette, mit ca. 300 Kubikzentimetern der gleichen Pufferlösung für etwa 24 Stunden zu einer Demaskierung antigener Determinaten und einer Enzymaktivierung belassen.

Im Anschluß an diese Gewebespülung und Reaktivierung wird eine Dehydrierung durchgeführt. Der Dehyderierungsvorgang wird gleichfalls als Kaltdehyderierung durchlaufen. Hierzu wird sehr reines Azeton in einer aufsteigenden Konzentra­ tionsreihe verwendet. Als Intermedium ist Xylol geeignet. Die erforderlichen Arbeitsschritte können entweder manuell durch Umsetzen der Proben über Lösungen in Kastenküvetten oder über Einbettungsautomaten realisiert werden.

Nach der Dehydrierung der Proben erfolgt die Methacrylat­ einbettung. Das verwendete Methacrylatgemisch wird aus einem Methylmethacrylat und einem Butylmethacrylat hergestellt. Zunächst werden diese Komponenten jeweils isoliert voneinan­ der säulenchromatographisch mit Aluminiumoxid entstabili­ siert (Entfernung des Stabilisators Hydrochinon) und die dabei entstehenden entstabilisierten Monomere mit Kupfer­ sulfat nachgetrocknet. Die derart hergestellten Komponenten können verschlossen bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius aufbewahrt werden. Das entstabilisierte Methylmetha­ crylat wird zur Herstellung der einen Methacrylatkomponente gekühlt mit etwa 2 Gewichtsprozenten Benzozylperoxid ver­ setzt und durch Rühren gut gelöst. Das Benzozylperoxid wurde zuvor bei etwa 37 bis 40 Grad Celsius für einen Zeitraum von etwa 1 bis 2 Tagen getrocknet. Die fertiggestellte Methyl­ methacrylatkomponente kann bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius gelagert werden. Eine zweite, die Butylmetha­ crylatkomponente wird bezogen auf die Butylmethacrylatmenge mit zwei Volumenprozenten Polyethylenglykol (Molargewicht: 400) in ein Reagenzglas pipettiert und ein Volumenprozent N,N-Dimethyl-p-Toluidin hinzugegeben. Die Substanzen werden anschließend gut gemischt. Das Polyethylenglykol dient hier­ bei als Lösungsvermittler und als äußerer Weichmacher. Nach der Hinzugabe von 5 Volumenprozenten entstabilisiertem und auf eine Temperatur von 4 Grad Celsius gekühltem Butyl­ methacrylat wird wiederum gut gemischt und anschließend die gesamte Mischung in das gekühlte und entstabilisierte Bu­ tylmethacrylat gegeben. Das eine Funktion als innerer Weich­ macher ausübende Butylmethacrylat weist hierbei eine Menge von 92 Volumenprozenten auf. Die fertiggestellte Butymetha­ krylatkomponente kann bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius gelagert werden. Der geschilderte Lösungsvorgang von N,N-Dimethyl-p-Toluidin dient zur gleichmäßigen Verteilung in der Butylmethacrylatkomponente.

Vor der Methacrylateinbettung werden die fixierten und dehy­ drierten Gewebeproben bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius für 1 bis 2 Stunden mit einer Mischung von stabili­ siertem Methylmethacrylat und Xylol im Verhältnis 1 : 1 durchtränkt. Anschließend erfolgt eine weitere Durchtränkung der Gewebeproben für einen Zeitraum von etwa 12 Stunden bis zu 3 Tagen bei einer Temperatur von 4 Grad Celsius mit einem entstabilisierten Gemisch aus Methyl- und Butylmethacrylat im Verhältnis von 2 : 3 unter Zusatz von 1,5 Gewichtsprozen­ ten getrocknetem Benzozylperoxid sowie 2% Polyethylen­ glykol (Molargewicht : 400).

Die vorbehandelten Proben werden dann in eine Gelatinekapsel gegeben und mit einer frisch zubereiteten Mischung aus der Methylmethacrylatkomponente und der Butylmethacrylatkompo­ nente im Verhältnis von 2 : 3 überschichtet. Die Kapsel wird anschließend verschlossen und bei einer Temperatur von etwa minus 10 bis etwa minus 15 Grad Celsius für einen Zeitraum von etwa 12 bis 24 Stunden einem Polymerisierungsvorgang unterworfen. Anschließend erfolgt eine Nachpolymerisation für etwa 2 Stunden bei etwa plus 4 Grad Celsius, für einen Zeitraum von etwa einer Stunde bei Zimmertemperatur sowie für einen Zeitraum von etwa 12 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37 bis 40 Grad Celsius.

Die Entstabilisierung der Methacrylate mit Hilfe des Alumi­ niumoxides im Bereich der Chromatographiesäule erfolgt mit basischem Aluminiumoxid. Etwa 300 ccm Aluminiumoxidpulver werden benötigt, um etwa 1500 ccm Methacrylatflüssigkeit zu entstabilisieren. Die Entstabilisierung erfolgt durch die Entfernung des als Stabilisator wirkenden Hydrochinons aus der Flüssigkeit.

Die in der Mischung der Methylmethacrylatkomponente und der Butylmethacylatkomponente enthaltenen Anteile aus Benzozyl­ peroxid wirken als Katalysator und die Anteile von N,N- Dimethyl-p-Toluidin als Initiator der Polymerisationsreak­ tion (Redoxsystem). Nur diese angegebenen Konzentrationen beider Substanzen ermöglichen die gesteuerte Polymerisation bei der niedrigen Temperatur von minus 10 bis minus 15 Grad Celsius.

Bevor die vorbehandelten Proben in die Gelatinekapseln gege­ ben werden, wird in den etwa halbkugligen Boden der Kapseln ein monomeres entstabilisiertes Methylmethacrylat gegeben und unter Zusatz von etwa 3 Gewichtsprozenten getrocknetem Benzozylperoxid bei etwa 37 bis 40 Grad Celsius eine Polyme­ risation durchgeführt. Diese vorpolymerisierten Kapseln werden in einem Wärmeschrank bevorratet. Auf die vorpoly­ mersisierte Methacrylatschicht wird dann anschließend die Gewebeprobe aufgelegt und die Kapsel bis zum Kapselrand mit der Mischung aus der Methylkomponente und der Butylkompo­ nente gefüllt und gut verschlossen sowie zur Verhinderung von Sauerstoffzutritt mit einem farblosen Nagellack am Kapselverschluß umrandet (zusätzliche Abdichtung).

Nach der Durchführung der Nachpolymerisation bei etwa 4 Grad Celsius weisen die polymerisierten Gewebeproben einen schma­ len, zähelastischen bis zähflüssigen Überstand auf. Dieser resultiert aus verbleibenden und die Polymerisation stören­ den Luftresten in der Kapsel. Durch den aus der Anwesenheit von Luftresten resultierenden Sauerstoffzutritt wird die Polymerisation gestört und durch die leichte Volumen­ schrumpfung des Polymerisates kann bei schlechter Abdichtung zusätzlich Luft gezogen werden. Das obere Viertel des Poly­ merisates mit dem weichen Überstand wird deshalb mittels einer kleinen Kreissäge unter Wasserkühlung abgetrennt. Bei diesem Schneidvorgang, der auch mit anderen Schneidgeräten durchgeführt werden kann, wirkt das Wasser nicht nur als Kühlung, sondern auch als Gleitmittel. Von dem derart vorbe­ reiteten Block kann die Gelatinekapsel in kaltem Wasser abgeweicht werden. Eine Nachbearbeitung des Blockes an der Gewebeeinbettungsseite erfolgt mit einer Feile, ein soge­ nanntes Trimmen der Schnittfläche für die anschließende Schnittpräparation mittels Hartschnittmikrotom. Die Objekt­ trägerbeschichtung erfolgt mit Chromalaun-Gelatine. Das Pressen und Trocknen der Schnitte erfolgt nach bekannten Arbeitsgängen der Hartschnittpräparation. Als Schneid- und Streckflüssigkeit ist die Verwendung von siebzig- bis acht­ zigprozentigem Äthanol zweckmäßig. Im Gegensatz zur Ver­ wendung von Methylglykolazetat wird durch die Verwendung von Äthanol die Gefahr einer Freisetzung von Essigsäure durch Hydrolyse vermieden, wenn keine absolut wasserfreie Flüssig­ keit vorliegt. Diese kann zur Beeinträchtigung des Gewebes mit negativem Ausfall der angestrebten Untersuchungen in der Immun- und Enzymhystochemie führen.

Nach der Herstellung der dünnen Gewebeschnitte erfolgt eine Herauslösung des Polymethacrylates aus dem Gewebe (sog. Entakrylierung), um eine Demaskierung der Antigene durchzuführen und eine gegebenenfalls vorhandene unspezi­ fische Untergrundfärbung bei immunhistochemischen Nachweisen zu vermeiden. Zur restlosen Herauslösung des Polymethacry­ lates ist die kombinierte Verwendung von Xylol, wasserfreiem Methylglykolazetat und Azeton Voraussetzung. Nach der Herauslösung der Methacrylate erfolgt ein Nachspülen mit destilliertem Wasser zur Rehydrierung der Schnittpräparate und anschließend die Überführung in die gewünschte gepuffer­ te wäßrige Lösung.

Bei der Durchführung von immunhistochemischen Untersuchungen ist es vorteilhaft, die entacrylierten und gepufferten Schnittpräparate zur Reduktion der unspezifischen Unter­ grundfärbung mit einem zehnprozentigen Normalserum der Tier­ spezies zu behandeln, die zur Herstellung des Brückenanti­ körpers dient. Das Normalserum wird mit einem 0,01 molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 unter Zusatz von 4% BSA versetzt. Als Brückenantikörper kann beim Arbeiten im ABC-System (Avidin-Biotin-Komplex) mit monoklonalen Antikörpern von der Maus ein biotinylierter Antikörper vom Kaninchen-Anti-Mausglobulin bzw. bei der Verwendung von polyklonalen Antikörpern vom Kaninchen ein Immunserum vom Schwein-Anti-Kaninchenglobulin vorgesehen werden.

Eine Hemmung der endogenen Peroxidase kann mit einem frisch­ angesetzten 0,6 prozentigen Gemisch aus Methanol und Wasser erfolgen. Dieser Vorgang wird entgegengesetzt der üblichen Arbeitsvorschriften nach der Inkubation mit dem Primäranti­ körper durchgeführt. Der Brückenantikörper kommt in einer Verdünnung von etwa 1 : 300 sowohl für das monoklonale als auch für das poliklonale System zur Anwendung. Als Chromogen kann Diaminobenzidin verwendet werden, um die Präparate über die aufsteigende Alkoholreihe nach vorheriger Gegenfärbung mit Hämalaun bearbeiten zu können.

Bei der Aufbereitung von Gewebeproben für osteologische Untersuchungen, die nicht als Frischmaterial verfügbar sind, wird das Gewebe nach einer Formalinfixation für etwa 2 bis 3 Tage in dem zur Fixation verwendeten Puffer-Succrosegemisch belassen. Diese Lagerung erfolgt bei etwa 4 Grad Celsius und reduziert durch diesen Waschvorgang die Antigenmaskierung.

Eine Umbettung von zuvor in Paraffin eingebettetem Tumorge­ webe kann nach einem Herausschneiden eines interessierenden Blockgebietes und einer Entparaffinierung erfolgen. Nach einer Xylolbehandlung wird die Probe zur Durchtränkung in das Methacrylatgemisch oder zur Antigenreaktivierung nach vorheriger Rehydrierung über eine absteigende Konzentra­ tionsreihe von Äthanol in die gesamte Puffer-Succrose- Lösung eingebracht. Anschließend können die bereits be­ schriebenen Arbeitsschritte der Methacrylateinbettung er­ folgen.

Bei der Durchführung des Einbettungsverfahrens wird durch die Verwendung der entstabilisierten monomeren Methacrylate eine Herabsenkung der Dibenzozylperoxidkonzentration auf einen Anteil von unterhalb 1 Gewichtsprozent ermöglicht. Die bei höheren Benzozylperoxidkonzentrationen beobachteten Hem­ mungen von einigen Enzymen werden so vermieden. Aufgrund der vorgeschlagenen Konzentrationen und Reaktionstemperaturen läuft die Polymerisierung derart langsam ab, daß es bei einem Polymerisationsgemisch von etwa von 20 ccm nur zu einer Temperaturerhöhung von etwa 1 bis 2 Grad nach einer Latenzzeit von etwa 2 bis 3 Stunden kommt. Die geringe Temperaturerhöhung erfolgt für einen Zeitraum von etwa 1,5 Stunden.

In Fig. 1 ist skizzenhaft dargestellt, wie das Polymeri­ sationsgemisch hergestellt wird. Die Methylmethacrylatkom­ ponente (1) wird durch Mischung von entstabilisiertem und nachgetrocknetem monomeren Methylmethacrylat und zwei Gewichtsprozenten getrocknetem Benzozylperoxid bei vier Grad Celsius hergestellt. Die Methylmethacrylatkomponente (2) entsteht durch die Vermischung von entstabilisiertem nach­ getrockneten monomeren Butylmethacrylat sowie zwei Volumen­ prozenten Polyethylenglykol mit einem Molargewicht von vier­ hundert und einem Volumenprozent N,N-Dimethyl-p-Toluidin bei einer Temperatur von 4 Grad Celsius. Die Methylmethacry­ latkomponente (1) und die Butylmethacrylatkomponente (2) werden zu einem Polymerisationsgemisch (3) vermengt, das zwei Volumenteile der Methylmethacrylatkomponente (1) sowie drei Volumenteile der Butylmethacrylatkomponente (2) ent­ hält. Die Polymerisationstemperatur liegt im Bereich von minus 10 bis minus 15 Grad Celsius und die primäre Polymeri­ sationszeit beträgt etwa 12 bis 24 Stunden.

In Fig. 2 sind die wesentlichen Verfahrensschritte des Verfahrenslaufes zur Aufbereitung der Gewebeprobe darge­ stellt. Nach einem Gewebezuschnitt (4) erfolgt eine Fixation (5) mit Hilfe einer 1,6%igen Paraformaldehyd - 0,02molaren Phosphat-puffer - fünfprozentigen - Succroselösung bei einer Temperatur von etwa 5 Grad Celsius und einem pH-Wert von etwa 7,4. Die Fixation wird für einen Zeitraum von etwa 24 Stunden bis 3 Tagen durchgeführt. Nach der Fixation (5) erfolgt die Dehydrierung (6) zunächst mit siebzigprozentigem Azeton, anschließend mit neunzigprozentigem Azeton und danach 3-fach mit hundertprozentigem Azeton (reinst). Abschließend erfolgt eine weitere zweifache Beaufschlagung mit Xylol. Die Dehydrierung erfolgt bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius.

Nach der Dehydrierung (6) erfolgt eine Durchtränkung (7) mit entstabilisiertem monomeren Methyl- und Butylmethacrylat mit Benzozylperoxyd und Polyethylenglykol in zwei Stufen unter Benutzung von Xylol während der ersten Stufe bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius. Nach einer Einbringung (8) in eine vorpolymerisisierte Gelatinekapsel erfolgt eine Gewebepolymerisation (9) und eine Nachpolymerisation mit den Methacrylatkomponenten. Eine Dünnschnittherstellung (10) erfolgt mittels einer Hartschnittmikrotomie und abschließend wird eine Dünnschnittentakrylierung (11) sowie eine Rehy­ drierung durchgeführt.

Claims (34)

1. Verfahren zur Aufbereitung einer Gewebeprobe, bei dem die Gewebeprobe mit einer sie stabilisierenden Einbettung verse­ hen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe mit einer mindestens ein Acrylat enthaltenden Substanz beauf­ schlagt wird und unter Verwendung eines Redoxsystemes eine Polymerisation bei einer Temperatur unterhalb von 0 Grad Celsius durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerisation in einem Temperaturbereich von etwa minus 10 bis minus 15 Grad Celsius durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die die Gewebeprobe beaufschlagende Substanz aus einer Methylmethacrylatkomponente und einer Butylmethacrylatkom­ ponente gemischt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Redoxsystem aus einer Mischung von Benzozylperoxid und N,N-Dimethyl-p-Toluidin hergestellt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Methylmethacrylatkomponente aus einem mit Hilfe von Aluminiumoxid entstabilisierten Methylmethacrylat herge­ stellt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das entstabilisierte Methylmethacrylat mit Kupfersulfat nachgetrocknet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die nachgetrocknete Methylmethacrylatkomponente bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius gelagert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Butylmethacrylatkomponente aus einem mit Hilfe von Aluminiumoxid entstabilisierten Butylmethacrylat hergestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das entstabilisierte Butylmethacrylat mit Kupfersulfat nachgetrocknet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Butylmethacrylatkomponente bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius gelagert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeich­ net, daß das entstabilisierte und nachgetrocknete Methylme­ thacrylat gekühlt mit 2 Gewichtsprozenten Benzozylperoxid versetzt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeich­ net, daß das Benzozylperoxid vor einer Zugabe zum Methylme­ thacrylat bei einer Temperatur von etwa 37 bis 40 Grad Celsius für einer Zeitraum von etwa 1 bis 2 Tagen getrocknet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeich­ net, daß eine durch die Mischung des entstabilisierten Methylmethacrylates und des Benzozylperoxides hergestellte Methylmethacrylatkomponente bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius gelagert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeich­ net, daß das entstabilisierte und nachgetrocknete Butylme­ thacrylat mit 2 Volumenprozenten Polyethylenglykol (Molarge­ wicht : 400) versetzt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß 1 Volumenprozent N,N-Dimethyl-p-Toluidin hinzugegeben wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeich­ net, daß die 2 Volumenprozente Polyethylenglykol (Molarge­ wicht : 400) und das 1 Volumenprozent N,N-Dimethyl-p-Tolui­ din zunächst mit 5 Volumenprozenten entstabilisiertem und auf eine Temperatur von 4 Grad Celsius gekühlten Butylme­ thacrylat vermischt wird und anschließend die restlichen 92 Volumenprozent Butylmethacrylat hinzugegeben werden.

17. Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeich­ net, daß eine aus der Mischung von Polyethylenglykol, N,N- Dimethyl-p-Toluidin sowie Butylmethacrylat hergestellte Butylmethacrylatkomponente bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius aufbewahrt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17, dadurch gekennzeich­ net, daß eine Gewebeprobe vor ihrer Einbettung in wäßriger Lösung fixiert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 1 bis 18, dadurch gekennzeich­ net, daß die Fixierung unter Anwesenheit einer 1,6 prozenti­ gen Paraformaldehydlösung, eines 0,02 molaren Phosphatpuf­ fers mit einem pH-Wert von 7,4 sowie einer fünfprozentigen Succroselösung durchgeführt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeich­ net, daß die Fixierung bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius durchgeführt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 1 bis 20, dadurch gekennzeich­ net, daß die fixierte Gewebeprobe bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius in einem 0,02 molaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von etwa 7,4 und einer fünfprozentigen Succro­ selösung gespült wird.

22. Verfahren nach Anspruch 1 bis 21, dadurch gekennzeich­ net, daß die fixierte Gewebeprobe dehydriert wird.

23. Verfahren nach Anspruch 1 bis 22, dadurch gekennzeich­ net, daß die Dehydrierung unter Anwesenheit von Azeton sowie Xylol durchgeführt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 1 bis 23, dadurch gekennzeich­ net, daß die dehydrierte Gewebeprobe für einen Zeitraum von etwa 1 bis 2 Stunden bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius mit Hilfe einer Mischung von Methylmethacrylat und Xylol im Verhältnis von etwa 1 : 1 durchgetränkt wird (Imersion).

25. Verfahren nach Anspruch 1 bis 24, dadurch gekennzeich­ net, daß die dehydrierten und durchgetränkten Gewebeproben für einen Zeitraum von etwa 12 Stunden bis 3 Tagen bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius mit einem entstabilisier­ ten Gemisch aus Methyl- und Butylmethacrylat in einem Ver­ hältnis von etwa 2 : 3 unter Zusatz von 1,5 Gewichtsprozen­ ten Benzozylperoxid und 2 Prozent Polyethylenglykol durchtränkt wird.

26. Verfahren nach Anspruch 1 bis 25, dadurch gekennzeich­ net, daß eine die Gewebeprobe aufnehmende Gelatinekapsel mit Methylmethacrylat unter Zusatz von 3 Gewichtsprozent Ben­ zozylperoxid unter Ausfüllung des halbkugligen Bodens bei 37 bis 40 Grad Celsius vorpolymerisiert wird.

27. Verfahren nach Anspruch 1 bis 26, dadurch gekennzeich­ net, daß die vorpolymerisierte Gelatinekapsel nach einer Aufnahme der vorbehandelten Gewebeprobe mit einer Mischung der Methylmethacrylatkomponente und der Butylmethacrylatkom­ ponente im Verhältnis von 2 : 3 aufgefüllt wird.

28. Verfahren nach Anspruch 1 bis 27, dadurch gekennzeich­ net, daß die Polymerisierung bei etwa minus 10 Celsius bis etwa minus 15 Grad Celsius für einen Zeitraum von etwa 12 bis 24 Stunden durchgeführt wird.

29. Verfahren nach Anspruch 1 bis 28, dadurch gekennzeich­ net, daß eine Nachpolymerisation durchgeführt wird.

30. Verfahren nach Anspruch 1 bis 29, dadurch gekennzeich­ net, daß eine erste Nachpolymerisation für einen Zeitraum von etwa 2 Stunden bei einer Temperatur von etwa 4 Grad Celsius durchgeführt wird.

31. Verfahren nach Anspruch 1 bis 30, dadurch gekennzeich­ net, daß eine zweite Nachpolymerisation für einen Zeitraum von etwa einer Stunde bei Zimmertemperatur durchgeführt wird.

32. Verfahren nach Anspruch 1 bis 31, dadurch gekennzeich­ net, daß eine dritte Nachpolymerisation für einen Zeitraum von etwa 12 Stunden bei einer Temperatur von etwa 37 bis 40 Grad Celsius durchgeführt wird.

33. Verfahren nach Anspurch 1 bis 32, dadurch gekennzeich­ net, daß die mittels Hartschnittmikrotomie gewonnenen Dünn­ schnitte auf Chromalaun-Gelatine beschichteten Objektträgern mit siebzig- bis achtzigprozentigem Äthanol gestreckt und anschließend für 24 Stunden bei etwa 37 Grad Celsius gepreßt und getrocknet werden.

34. Verfahren nach Anspruch 1 bis 33, dadurch gekennzeich­ net, daß die Dünnschnitte durch Behandlung mit Xylol (2 × 20′), Methylglykolazetat absolut (20′) und Azeton reinst (2 × 5′) entakryliert, danach mit Aqua dest. (2 × 2′) rehydriert und anschließend ohne Zwischentrocknung in der gewünschten Pufferlösung für die immun- bzw. enzymhistochemische Bear­ beitung eingebracht werden.