DE4028689A1

DE4028689A1 - Verfahren zur enzymatischen herstellung optisch aktiver cyanhydrine

Info

Publication number: DE4028689A1
Application number: DE19904028689
Authority: DE
Inventors: Peter Miethe; Maria-Regina Kula; Ingeborg Maria Stuertz; Christian Wandrey; Udo Kragl
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Martin Luther Universitaet Halle Wittenberg
Priority date: 1990-09-10
Filing date: 1990-09-10
Publication date: 1992-03-12

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen durch enzymatische Umsetzung von Oxoverbindungen mit Blausäure in Gegenwart von (R)- bzw. (S)-Oxynitrilase (4.1.2.10) bzw. (4.1.2.11) unter derart sauren Bedingungen, daß die chemische Konkurrenzreaktion und die Racemisierung vernachlässigbar sind.

Optisch aktive Cyanhydrine sind für die Gewinnung von optisch aktiven α-Aminoalkoholen, α-Hydroxycarbonsäuren, Heterocyclen und Pyrethroid-Insektiziden von erheblichem Interesse. Dabei ist die Verfügbarkeit von leicht derivatisierbaren chiralen Synthesebausteinen, die kostengünstig in ausreichenden Mengen mit möglichst hohem Enantionmerenexzeß (ee) hergestellt werden können, von zentraler Bedeutung.

In Anbetracht der optischen Selektivität enzymatischer Reaktionen wurde die enzymkatalysierte Herstellung optisch aktiver Cyanhydrine schon seit langem untersucht: So wird in der DE-PS 13 00 111 die Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen mit an Ionenaustauschern gebundener (R)-Oxynitrilase bei pH 5,4 beschrieben. Die dabei erzielten ee-Werte lagen allerdings durchweg unter 90%. Von Effenberger et al. (Angew. Chem. 99 (1987) 491) wird daher die enzymatische Umsetzung von Oxoverbindungen mit Blausäure in organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln empfohlen, um die chemische Reaktion zu unterdrücken. Dabei wurde bevorzugt mit trägerfixiertem Enzym in Ethylacetat bei pH-Werten von 5,4 gearbeitet. Dabei wurden ee- Werte bis zu 99% erzielt.

Ein anderer Weg, die chemische Konkurrenzreaktion und Racemisierung zu unterdrücken, wird in der EP A 2 03 26 063 angegeben, nach der optisch aktive Cyanhydrine durch Umsetzung von Oxoverbindungen mit Blausäure in Gegenwart von Oxynitrilase erhalten werden sollen, indem unter derart sauren Bedingungen, insbesondere bei pH-Werten 4,5 und bei solchen Temperaturen gearbeitet wird, daß die chemische Konkurrenzreaktion und die Racemisierung gegenüber der enzymatischen Synthese vernachlässigbar sind. Auf die unter diesen Bedingungen erhöhten Aktivitätsverluste des Biokatalysators wird dabei hingewiesen und die Beispiele lassen eine Favorisierung niedriger Temperaturen im Bereich von 5 bis 8°C erkennen.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß die Bevorzugung der enzymatischen Synthese vor der chemischen Konkurrenzreaktion und Racemisierungen im sauren Bereich bei zum Neutralpunkt hin verschobenen pH-Werten (und auch bei Zimmertemperatur) erreicht werden kann, wenn der Biokatalysator in einem lyotropen Flüssigkristall solubilisiert vorliegt und die Substratzufuhr über eine organische Lösungsmittelphase erfolgt.

Das erfindungsgemäße Verfahren der eingangs genannten Art ist daher dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart von in einem lyotropen Flüssigkristall solubilisierter Oxynitrilase durchführt, wobei für die Flüssigkristallbildung solche Tenside ausgeschlossen werden, deren Hydrolyse zu einer Erhöhung des pH-Wertes führt.

Auf diese Weise können optisch aktive (R)-Cyanhydrine und (S)-Cyanhydrine durch Umsetzung von aliphatischen, aromatischen oder heteroaromatischen Aldehyden oder Ketonen mit Blausäure in Gegenwart der im lyotropen Flüssigkristall "immobilisierten" (R)- bzw. (S)-Oxynitrilase erhalten werden. Dabei wird für die Erzeugung der flüssigkristallinen Phase, insbesondere Pufferlösung verwendet, deren pH-Wert zwischen 3 und 6 liegt.

Als Tenside werden kationische oder nichtionische Amphiphile bevorzugt, wie Alkyltrimethylammoniumhalogenide, Alkylpyridiniumhalogenide, Polyoxyethylenether, Polyoxyethylenester, Polyoxyethylensorbitanester, Alkylphenolpolyethylenglykolether, entsprechende Polyoxypropylenderivate oder Copolyoxyethylenpolyoxypropylenderivate oder entsprechende Tensidgemische und als organische Lösungsmittel sind insbesondere Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dibutylether, Diisopropylether oder Toluol zweckmäßig. In der Praxis haben sich Dibutylether und Brÿ® 35 (Polyoxyethylenmonolaurylether) der Fa. Serva gut bewährt.

Zur Herstellung des flüssigkristallinen biokatalysatorhaltigen Systems geht man zweckmäßigerweise von einer 1- bis 30gew.-%igen, vorzugsweise 5- bis 10gew.-%igen Stammlösung bzw. Suspension eines Tensids in einem organischen Lösungsmittel aus. Zu dieser Stammlösung werden nachfolgend 1 bis 30 Gew.-%, insbesondere 5 bis 10 Gew.-% wäßrige biokatalysatorhaltige Pufferlösung hinzugegeben. Nach kurzem Schütteln entsteht daraus das biphasige System Flüssigkristall/organisches Lösungsmittel.

Die exakte Zusammensetzung eines solchen Systems muß in entsprechenden Vorversuchen ermittelt werden, sofern sie nicht der kolloidchemischen Literatur (ternäre Phasendiagramme Tensid/organisches Lösungsmittel/ Wasser) entnommen werden kann.

Die Erfindung eignet sich insbesondere für die Umsetzung wasserunlöslicher Oxoverbindungen. Im Falle, daß die Oxoverbindung nicht zu polar ist, kann diese selbst das organische Lösungsmittel bilden.

Die biokatalysatorhaltigen lyotropen Flüssigkristalle werden vorzugsweise in Mischung mit porösen Trägermaterialien, wie z. B. porösen Glassinterkörpern verwendet, wobei der Einsatz in Form einer damit gepackten Durchlaufsäule besonders zweckmäßig ist.

Verfahrenstechnisch besonders günstig ist auch ein Durchlaufreaktor, der dünne Schichten des biokatalysatorhaltigen Flüssigkeitskristalls angrenzend an schmale Strömungskanäle für substrathaltiges Lösungsmittel aufweist.

Zwar wird die enzymatische Umsetzung von organischen Verbindungen in Gegenwart von lyotropen Flüssigkristallen (vorzugsweise mit inverser Phasenstruktur), die das Enzym enthalten, bereits in der EP A 2 03 40 744 beschrieben, jedoch war danach nicht erkennbar, daß bei der Herstellung optisch aktiver Cyanhydrine auf enzymatischem Wege durch den Einsatz von lyotropen Flüssigkristallen eine pH-Verschiebung des optimalen Umsetzungsbereiches möglich sein würde, die eine erfolgreiche Umsetzung unter günstigen Bedingungen (insbesondere ohne die Notwendigkeit, Kühltemperaturen einzusetzen) und mit relativ geringen Enzymverlusten möglich machen würde. Selbstverständlich kann auch die erfindungsgemäße Umsetzung innerhalb eines relativ breiten Temperaturbereichs von etwa -10°C bis 70°C stattfinden.

Überraschenderweise können im Falle der Oxynitrilase neben den bisher vorzugsweise verwendeten Flüssigkristallen mit inverser Phasenstruktur gleichwertig auch solche mit normaler Phasenstruktur eingesetzt werden. Diese Tatsache vereinfacht die Auswahl und erweitert die Möglichkeiten, ein flüssigkristallines Reaktionsystem herzustellen, erheblich.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen beschrieben:

Beispiel 1

Es wurde eine Stammlösung von 10 Gew.-% Decaethylenglycoldodecylether in Dibutylether hergestellt. Zu 5 ml dieser Lösung wurden 280 µl einer wäßrigen R- Oxynitrilaselösung (Proteinkonzentration 10 mg/ml, 50 mM Citratpuffer pH=3,75) gegeben. Nach kurzem Schütteln entsteht ein das Enzym enthaltender Flüssigkristall im Gleichgewicht mit reinem Dibutylether. Das Volumenverhältnis der beiden Phasen beträgt etwa 1 : 1. In dieses System wurden anschließend 100 mg Benzaldehyd und 100 µl Blausäure gegeben, und die einsetzende Cyanhydrinsynthese wurde polarimetrisch im Dibutylether verfolgt. Nach 50 min stellte sich ein konstanter Drehwert ein, und die Reaktion war beendet. Dann wurde die organische Phase vom Flüssigkristall abgetrennt, und das Lösungsmittel wurde im Rotationsverdampfer abgezogen.
Chem. Ausbeute 115 mg (90% der Th.);
optische Reinheit 99% ee.

Die Bestimmung der optischen Reinheit erfolgte als N,0-Bis-(Pentafluorpropionyl)-2-amino-1-phenyl- ethanol-Derivat des R-Mandelsäurenitrils kapillar- gaschromatographisch nach H. Frank et al. (J. Chromatogr. 146, (1987), 197-206) auf einer chiralen Trennphase (FS-Chirasil-Val, 25 m×0,32 mm).

Die Derivatisierung wurde wie folgt vorgenommen: 1-2 mg des Mandelsäurenitrils wurden mit 250 µl einer 1 M Diboranlösung (in Tetrahydrofuran) in Dibutylether bei Zimmertemperatur in 30 min reduziert. Nach Hydrolyse des überschüssigen Diborans mit einigen Tropfen Ethanol und Abziehen des Lösungsmittels wurde der erhaltene Aminoalkohol direkt mit 20 µl Pentafluorpropionsäureanhydrid in Methylenchlorid bei Zimmertemperatur in 15 min acyliert. Schließlich wurde überschüssiges Anhydrid am Rotationsdampfer abgezogen, da der Rückstand mit Methylenchlorid wieder aufgenommen und gaschromatographisch analysiert.

Beispiel 2

Entsprechend Beispiel 1 wurden 100 mg 3-Phenoxybenzaldehyd umgesetzt. Nach etwa 90 min war die Reaktion beendet. Die Aufarbeitung des Cyanhydrins und die Bestimmung der optischen Reinheit erfolgte, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Chem. Ausbeute 90 mg (87% d. Th.);
optische Reinheit 99% ee.

Beispiel 3

Entsprechend Beispiel 1 wurden 100 mg 3-Fluorbenzaldehyd umgesetzt. Die Reaktion war nach 90 min beendet. Die Aufarbeitung erfolgte analog zu Beispiel 1.
Chem. Ausbeute 102 mg (83% d. Th.);
optische Reinheit 76% ee.

Beispiel 4

Entsprechend Beispiel 1 wurden 100 mg 2-Methylcyclohexanon umgesetzt. Die Reaktion war nach etwa 120 min beendet. Aufarbeitung und Analytik erfolgten analog zu Beispiel 1.
Chem. Ausbeute 111 mg (82% d. Th.);
optische Reinheit 92% ee.

Beispiel 5 Kontinuierliche Produktion von (R)-Mandelsäurenitril im Festbettreaktor

Es wurde eine Lösung von 10 Gew.-% Brÿ 35 (SIGMA) in Diisopropylether hergestellt. Zu 20 ml dieser Lösung wurden 700 µl einer wäßrigen (R)-Oxynitrilaselösung gegeben (Proteinkonzentration 10 mg/ml, Citratpuffer pH=4). Nach kurzem Schütteln entstehen daraus etwa 6 g lyotroper Flüssigkristall im Gleichgewicht mit Diisopropylether. 3 g von diesem flüssigkristallinen Biokatalysator wurden in den Innenraum von 10 Siran-Raschigringen (Innendurchmesser 5 mm, Länge 8 mm) gefüllt. Diese Siranringe wurden in eine 25 ml Chromatographiesäule gegeben, der Säulenausfluß wurde an eine Pumpe mit anschließender Blasenfalle und polarimetrischer Durchflußzelle angeschlossen, und das System wurde mit 30 ml Diisopropylether gefüllt. Nachdem der Säulenzufluß mit einer eisgekühlten Vorlage, die eine Diisopropyletherlösung mit 25 µl/ml Benzaldehyd und 25 µl/ml HCN enthielt, gekoppelt worden war, wurde die Reaktion in der Durchflußapparatur durch Einschalten der Pumpe gestartet. Nach etwa 140 min war der steady state erreicht. Die Apparatur wurde 2 Tage kontinuierlich betrieben, wobei kein Absinken des Drehwertes zu verzeichnen war.

Betriebsbedingungen:

Benzaldehyd: 250 mM
HCN: 1 M
Verweilzeit: 80 min
mittlerer Umsatz: 85%
Raumzeitausbeute: 550 g/(l d)
optische Reinheit: 99% ee

Beispiel 6 Kontinuierliche Produktion von (R)-Mandelsäurenitril im Festbettreaktor mit unterschiedlichen Verweilzeiten

Versuchsbeschreibung:

Ansatz:
2,5 g Brÿ 35
10 ml Dibutylether
3,5 ml R-Oxynitrilase in 50 mM Citratpuffer pH 3,75 (110 U/ml; 385 U im Ansatz)
70 g Glasperlen

Substratkonzentrationen:
90 mM Benzaldehyd
100 mM Blausäure

Temperatur: 25°C
Polarimeter: λ=436 nm
Reaktorvolumen:
gesamtes Volumen: 50 ml
durchströmbares Volumen: 7,0 ml

Es wurde eine Lösung von 25 Gew.-% Brÿ 35 (SIGMA) in Dibutylether hergestellt. zu 10 ml dieser Lösung wurden 3,5 ml einer wäßrigen (R)-Oxynitraselösung gegeben (Proteinkonzentration 10 mg/ml, Citratpuffer pH 3,75). Nach kurzem Schütteln entstehen daraus etwa 6 g lyotroper Flüssigkristall im Gleichgewicht mit Dibutylether. Der flüssigkristalline Biokatalysator wurde mit 70 g Glasperlen vermischt und in eine 50 ml Chromatographiesäule gegeben. Der Säulenausfluß wurde an eine Pumpe mit anschließender Blasenfalle und polarimetrischer Durchflußzelle angeschlossen, und das System wurde mit 50 ml Dibutylether gefüllt. Nachdem der Säulenzufluß mit einer eisgekühlten Vorlage, die eine Dibutyletherlösung mit 90 mM Benzaldehyd, und 200 mM Blausäure enthielt, gekoppelt worden war, wurde die Reaktion in der Durchflußapparatur durch Einschalten der Pumpe gestartet. Es wurden verschiedene Verweilzeiten eingestellt und jeweils gewartet, bis der steady state erreicht war. Die Apparatur wurde 3 Tage kontinuierlich betrieben, wobei kaum ein Absinken des Drehwertes zu verzeichnen war.

Für die Berechnung der Verweilzeit und der Raum-Zeit-Ausbeute wurde das durchströmende Volumen benutzt.

Es wurde der Umsatz und der Drehwert bei 10 verschiedenen Verweilzeiten bestimmt.

Wie die vorstehende Tabelle erkennen läßt, kann die Mandelsäurenitrilbildung optimiert werden: Bei der durchgeführten Versuchsreihe wurden bei Verweilzeiten zwischen 3 und 4 min. die höchsten Raum-Zeit-Ausbeuten bei praktisch unverminderter Enantiomeren-Reinheit erhalten.

Beispiel 7 Enzymstabilität

Es wurden 40 (R)-Oxynitrilase enthaltende flüssigkristalline Systeme entsprechend Beispiel 1 hergestellt und in 5 ml Reagenzgläsern mit Schliff gefüllt. In dieser Form wurde die Oxynitrilase bei Zimmertemperatur gelagert, und die Aktivität des Enzyms wurde jeweils nach einem Tag gemessen. Dazu wurden 100 µl Benzaldehyd und 100 µl HCN in jeweils eines dieser Gläser gegeben, und der Drehwert wurde diskontinuierlich nach 10, 20 und 40 min gemessen. Der Anstieg dieser Drehwert-Zeit-Kurve wurde als Maß für die Enzymaktivität verwendet. Innerhalb der ersten 4 Tage war ein Abfall von etwa 3% pro Tag zu verzeichnen. Danach war über einen Zeitraum von 40 Tagen kein weiterer Aktivitätsverlust zu verzeichnen, und die Enzymaktivität lag bei etwa 80% der Ausgangsaktivität. Im Citratpuffer bei pH= 3,75 und 20°C verliert die Oxynitrilase eine Aktivität etwa 8% pro Tag.

Beispiel 8 Synthese bei pH 4 bis 6,5

Es wurde verfahren wie in Beispiel 5 dargestellt, wobei verschiedene wäßrige enzymhaltige Lösungen bei pH=4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 eingesetzt wurden. Nach 24 h kontinuierlichem Betrieb wurde jeweils die optische Reinheit des gebildeten Mandelsäurenitrils bestimmt. In nachfolgender Tabelle sind die erhaltenen Werte zusammengefaßt:

Beispiel 9

Die Umsetzung wurde in einem 100 ml Zweihalskolben mit KPG Rührer ausgeführt. Um das Reaktionssystem in eine rührfähige Form zu überführen, bei dem insbesondere das Ankleben des Flüssigkristalls an den Rührerblättern vermieden werden kann, wurden folgende Varianten entwickelt:

a) 2 g Polyethylenglycol-20-dodecylether (Brÿ 35) werden bei 50°C mit 40 ml Dibutylether gemischt. Es entsteht eine Stammlösung von Tensid in Dibutylether. Nach Abkühlung auf 35°C werden 2,8 ml Enzymlösung (Proteinkonzentration 18 mg/ml) zugegeben. Durch kräftiges Schütteln erzeugt man etwa 2 ml Flüssigkristall. Zu diesem gibt man 50 ml nichtporöse Glaskugeln (d=2-4 mm).
b) Es wird verfahren wie unter a) beschrieben. An Stelle der nichtporösen Glaskugeln werden jedoch 40 ml poröse Siranglaskugeln (Schott d=0,2-0,6 mm, Poren 120 µm) zugegeben. Das System wird kurzzeitig evakuiert, um Luftblasen zu entfernen. Die Aufnahme der Flüssigkristallmasse in die Hohlräume des porösen Glases wird ggf. durch anschließende Druckanwendung (z. B. 2 bar) gefördert.
c) Es wird verfahren wie unter a) beschrieben. An Stelle von nichtporösen Glaskugeln werden jedoch 50 ml Seesand oder 50 ml Cellulosepulver (Avicell, FMC) oder 50 ml getrocknete Perlzellulose (Leipziger Arzneimittelwerk) zugegeben.
c) Bei Einsatz von porösen Materialien, d. h. Cellulosepulver, Perlcellulose, Siranglas kann auch wie folgt verfahren werden. Zu 10 g des Trägermaterials gibt man 3 ml der Enzymlösung. Dieses feuchte Trägermaterial gibt man anschließend in 40 ml der unter a) beschriebenen Stammlösung von Brÿ 35 in Dibutylether. Bei diesem Verfahren kann der Wassergehalt im Bereich von 2,6 bis 8 ml pro Ansatz variiert werden.
e) 40 g Eupergit® C 250 L (Röhm Pharma) werden mit 200 ml R-Oxynitrilaselösung (1,9 g/l; pH=7,5) versetzt und 72 h bei Zimmertemperatur stehen lassen. Anschließend wird mit dest. Wasser gewaschen und das Immobilisat 24 h bei Zimmertemperatur im Vakuum getrocknet. 40 g Immobilisat werden dann mit 6 ml Citratpuffer von pH 3,75 benetzt und anschließend in 50 ml der unter a) beschriebenen Stammlösung dispergiert. Der Wassergehalt des Systems kann in den Grenzen von 2 bis 10 ml pro Ansatz variiert werden.

In allen Fällen wurde bei einer Rührergeschwindigkeit von 150 rpm bei Zimmertemperatur gearbeitet. Es wurden jeweils 20 ml wassergesättigter Dibutylether, 2 ml Benzaldehyd und 2 ml Blausäure zugesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wurde mit Hilfe der HPLC (Säule RP-18, Laufmittel Acetonitril/Citratpuffer pH=4,2=30/70) der Umsatz und wie im Beispiel 1 beschrieben der ee-Wert bestimmt. Dabei wurde gefunden:

Variante a) Umsatz 90%; ee=97,2%
Variante b) Umsatz 86%; ee=96,0%
Variante c) Seesand: Umsatz 87%; ee=92,7%
Variante c) Avicell: Umsatz 75%; ee=91,0%
Variante c) Perlcellulose: Umsatz 78%; ee=88%
Variante d) Umsatz 66%; ee=81%
Variante e) Umsatz 56%; ee=78,8%

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven Cyanhydrinen durch enzymatische Umsetzung von Oxoverbindungen mit Blausäure in Gegenwart von (R)- bzw. (S)- Oxynitrilase (4.1.2.10) bzw. (4.1.2.11) unter derart sauren Bedingungen, daß die chemische Konkurrenzreaktion und die Racemisierung vernachlässigbar sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart von in einem lyotropen Flüssigkristall solubilisierter Oxynitrilase durchführt, wobei für die Flüssigkristallbildung solche Tenside ausgeschlossen werden, deren Hydrolyse zu einer Erhöhung des pH-Wertes führt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem solchen ternären System von Tensid/organischem Lösungsmittel/ wäßrigem Puffer durchführt, das unter Verwendung von Pufferlösungen mit pH-Werten zwischen 3 und 6 hergestellt worden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem Durchlaufreaktor mit an porösem Träger, insbesondere Glasträger fixiertem Flüssigkristall durchführt.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem Durchflußreaktor durchführt, der den Flüssigkristall in dünner Schichtung angrenzend an schmale, eine flüssigkeitsdurchlässige Begrenzung aufweisende Strömungskanäle enthält, durch die substrathaltiges Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemisch tangential zur Flüssigkristallschichtung strömend geschickt wird.