DE4001098A1

DE4001098A1 - Traegergebundene dialkoxyphosphorverbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE4001098A1
Application number: DE4001098A
Authority: DE
Inventors: Henrich Hasko Prof Dr Paradies; Horst Dr Schwinn
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 1990-01-17
Filing date: 1990-01-17
Publication date: 1991-07-18
Also published as: WO1991010507A1; DE4001098C2

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind trägergebun dene Dialkoxyphosphorverbindungen, insbesondere trägerge bundene Alkylphosphate und Alkylphosphonate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendungen.

Di- oder Trialkylphosphate sind Substanzen, die unter anderem verwendet worden sind, um phospholipid-umhüllte Viren zu inaktivieren, wobei man von der Annahme ausging, daß diese Phosphorverbindungen die Membran dieser Viren zerstören. So beschreibt beispielsweise die EP-A-01 31 740 Verfahren zur Herstellung von proteinhaltigen Zubereitun gen, die praktisch frei sind von phospholipid-haltigen Viren, bei dem die Zubereitungen ausreichend lange mit einer wirksamen Menge von Di- oder Trialkylphosphaten in Berührung gebracht werden. Dieses Verfahren ist auf die verschiedensten biologischen Flüssigkeiten anwendbar, ins besondere jedoch zur Entfernung von Viren in Blut- und Plasmapräparaten, in denen die Proteine nicht oder nur möglichst geringfügig denaturiert werden sollen. Gerade bei derartigen Verfahren ist es jedoch nötig, an schließend die Di- oder Trialkylphosphate wieder aus der Lösung zu entfernen, was mit erheblichem Aufwand und meist auch erheblichen Verlusten an Proteinen verbunden ist.

Die Erfindung hat sich somit zunächst die Aufgabe ge stellt, Di- und Trialkylphosphate aus biologischen Flüs sigkeiten, insbesondere aus proteinhaltigen biologischen Flüssigkeiten abzutrennen, ohne dabei die Proteine zu denaturieren und relativ hohe Ausbeuteverluste an Pro teinen in Kauf nehmen zu müssen.

Es wurde jetzt gefunden, daß diese Aufgabe überraschend einfach gelöst werden kann durch trägergebundene Dialk oxyphosphorverbindungen, nämlich Alkylphosphate und Al kylphosphonate der allgemeinen Formel I

Tr-Spac(-O)_nPO(-OAlk)₂ (I)

in der Tr einen inerten Träger, Spac einen Spacer, n die Zahlen 0 und 1 und Alk Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlen stoffatomen bedeuten.

Als Träger kommen insbesondere anorganische oder organi sche Festkörper oder Gele in Frage, welche durch kova lente Bindungen mit einem Spacer verknüpft werden können. Als anorganische Träger kommen beispielsweise in Frage Gläser, Kieselsäuren, Aluminiumhydroxide und sonstige inerte anorganische Träger, wie sie auch für trägergebun dene Enzyme zur Anwendung kommen. Als organische Träger kommen wiederum alle üblicherweise eingesetzten inerten Träger in Frage insbesondere vernetzte und unvernetzte polymere Kohlehydrate, wie Oellulosen, Dextrane, Agaro sen, Polyacrylate und Copolymerisate. Besonders bevorzugt sind Sepharose^R, Sephacel, Fractogel^R und Sephadex^R, und deren bereits aktivierte Abkömmlinge, die bereits einen Spacer enthalten, wie z. B. Brom-acetamido-alkyl-derivate, CNBr-Sepharose oder O-Bromacetyl-N-Hydroxy-Succinimid.

Als Spacer werden im allgemeinen geradkettige Alkylgrup pen gewählt mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, die an beiden Enden kovalente Bindungen eingehen können. Besonders bevorzugt werden Spacer mit 6 Kohlenstoffatomen; darüber hinaus können auch alle übrigen bekannten Spacer einge setzt werden, die insbesondere für trägergebundene Enzyme entwickelt worden sind.

Die Alkylgruppen der Phosphorverbindungen können je nach Verwendungszweck zwischen 1 und 10 Kohlenstoffatomen auf weisen. Bevorzugt werden solche mit 3 bis 6 Kohlenstoff atomen. Für die Entfernung von Viren mit einer Phospho lipidhülle, wie Hepatitis B hat sich insbesondere eine Kettenlänge von 4 Kohlenstoffatomen besonders bewährt.

Ein Verfahren zur Entfernung von Viren aus biologischen Flüssigkeiten ist von der Anmelderin als Patentanmeldung mit gleichem Anmeldetag beim DPA eingereicht worden.

Die weiteren Untersuchungen dieser neuen trägergebundenen Dialkoxyphosphorverbindungen hat ergeben, daß durch Vari ationen des Trägers, des Spacers und der Länge der Alkyl gruppen durchaus unterschiedliche Ergebnisse erzielt werden können. So ist einerseits darauf zu achten, daß der Träger nicht nur gegenüber den Proteinen inert ist, sondern auch nicht dazu neigt, diese unverhältnismäßig hoch zu adsorbieren, wodurch es zu unerwünschten Verlu sten kommen kann. Das gleiche gilt für die Länge des Spacers. Zur Auf- und Abtrennung von lipophilen Substan zen können vielfach schon sehr kurze Spacer ausreichen. Insbesondere um die Phospholipidhülle von Hepatitis B Viren zu zerstören, ist eine Mindestlänge des Spacers er forderlich. Zu lange Spacer wiederum führen zu geringerer Effizienz der trägergebundenen Dialkoxyphosphorverbin dungen. Für diesen Zweck haben sich daher Spacer-Längen von 6 Kohlenstoffatomen als optimal erwiesen.

Die kovalente Kupplung des Phosphoratoms mit dem Spacer kann unter Zuhilfenahme übliche Kupplungsreagentien er folgen, wie beispielsweise Oxiranen, Epoxiden, Carbodi imiden. Während bei der Verwendung von Di- und Trialkyl phosphaten nach dem Stand der Technik bisher nur Ester der Phosphorsäure zur Anwendung gekommen sind, können erfindungsgemäß auch die Alkylphosphonate über einen Spacer an Träger gebunden werden. Diese trägergebundenen Alkylphosphonate weisen ebenfalls hervorragende Eigen schaften auf bezüglich der Auf- und Abtrennung von lipo philen Substanzen sowie der Inaktivierung und der Ent fernung von Viren mit einer Phospholipidhülle.

Es hat sich weiterhin gezeigt, daß es mit Hilfe der trä gergebundenen Dialkoxyphosphorverbindungen möglich ist, aus biologischen Flüssigkeiten mit hoher Effizienz Viren zu entfernen, ohne die gewünschten Proteine zu denatu rieren. Bei Auswahl geeigneter Träger und Spacer ist es sogar möglich, die Ausbeuteverluste an gewünschten Pro teinen extrem gering zu halten. Weiterhin wurde gefunden, daß es mit Hilfe der erfindungsgemäßen trägergebundenen Dialkoxyphosphorverbindungen möglich ist, lipophile Sub stanzen von hydrophilen Substanzen abzutrennen und sogar Substanzen mit gradueller Abstufung der Lipophilität chromatographisch aufzutrennen, so daß mit ihnen neue Formen der Affinitätschromatographie möglich sind.

Zur Herstellung der Di-n-butyl aktivierten Matrix wird zunächst beispielhaft N-ethyl-N′-(3-dimethyl-aminopro pyl) -carbodiimid Hydrochlorid oder auch N-cyclo-hexyl- N′-2-(4′-methylmorpholinium)-ethyl carbodiimid-p-Toluol sulfonat mit Di-n-butylphosphat in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. 1,2 Dimethoxy-Ethan bei 0-8°C umge setzt. Die Kopplung an die Gel-Matrix, die entweder eine Hydroxyl- oder eine Amino-Gruppe als funktionelle Gruppe enthält, wird durch Einrühren der jeweiligen Gelmatrix bei pH 6,0-7,0 unter ständigem weiteren Rühren bei 4°C erreicht. Die oftmals zu beobachtende pH-Absenkung in der ersten Stunde wird vorzugsweise verhindert durch Zugabe von Thionyl- oder Sulfurylchlorid (SOCl₂, SO₂Cl₂) in Gegenwart von Pyridin. Das Reaktionsgemisch wird unter ständiger Kontrolle des pH-Wertes für weitere 3 Stunden bei einem pH-Wert von 6,0 und einer Temperatur von 4°C gerührt. Das so erhaltene Produkt wird bei derselben Temperatur ausgiebig mit 0,1 M NaOH, dann mit Wasser und anschließend mit 0,1 M HCl gewaschen. Organische Lösungs mittel, wie 1,4-Dioxan, Ethylen-Glykole, Aceton etc. werden durch extensives Waschen mit Wasser bei 4°C oder durch Dialyse entfernt.

Um den Spacerarm zu verlängern und je nach den experi mentellen Erfordernissen variabel zu halten, wird durch Carbodiimid-Kupplung die freie Amino- oder Hydroxyl-Grup pe, z. B. an der Sepharose (Agarose-Bett) oder Dextran gelen (Sephadex) sowie vernetzten (cross-linked) Dextran- Gelen, z. B. Sephacryl, Fractogel entsprechend verlängert. Die Matrix enthält einen Spacerarm von 6-CH₂-Gruppen, am freien endständigen Ende eine primäre Aminogruppe, welche dann mit dem entsprechenden Carbodiimid (EDC) gekoppelt wird, so daß die Di-n-butylphosphat-Gruppe frei und end ständig vorliegt.

Eine vorzugsweise Ausführung zur Herstellung der akti vierten Agarose oder eines Dextrangeles besteht in der üblichen Form der CNBr-aktivierten Matrizen und deren an schließendem Umsatz mit 1,4 bis 1,10 Di-aminen nach der Cyanbromid-Methode.

Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, daß bei Aga rose-Gelen im Durchschnitt 20 µmol Di-n-butylphosphat pro gl geschwollenem Gel kovalent gebunden sind, während bei Dextrangelen im Durchschnitt 0,1 bis 0,15 mmol Di-n-butyl phosphat-Gruppen pro gl hydratisiertem Gel gefunden wur den. Für vernetzte Dextrangele, z. B. Sephacryl, wurden im Durchschnitt 0,12 mmol Di-n-butylphosphat-Gruppen pro g geschwollenem Gel bestimmt.

Eine weitere Möglichkeit zur kovalenten Bindung von Di-n- butylphosphat an eine Säulenmatrix liefert die Reaktion von epoxy-aktivierten Agarose-Gelen oder Dextranen mit Di-n-butylphosphat. Zu diesem Zwecke werden Agarose- oder Dextrangele mit 1,4- bis -(2,3-epoxypropoxy-)-butan umge setzt. Dabei werden, wie bekannt, freie Oxiran-Gruppen mit hydroxylgruppen-haltigen Reagenzien umgesetzt. Durch Reaktion der freien Oxiran-Gruppierung mit Di-n-butyl phosphat entsteht die durch Di-n-butylphosphat-Gruppen beladene, erfindungsgemäß gewünschte neue Säulenmatrix zur Inaktivierung von PL-Viren. Für Agarose-Gele wurde eine kovalente Besetzungsdichte von 25 µmol pro g hydratisiertem Gel bestimmt. Die entsprechende Bestimmung für nicht-vernetztes Dextrangel ergaben Werte zwischen 80 und 150 µmol pro g, für Fractogel im Durchschnitt von 10-100 µmol und für Sephacryl im Durchschnitt 90 µmol pro g geschwollenem Gel.

Zur quantitativen Bestimmung der reaktiven Di-n-butyl phosphat-Gruppe wird das Gel zunächst hydrolisiert, an schließend mit konzentrierter Salzsäure erwärmt und die freie Phosphorsäure titrimetrisch bestimmt.

Eine andere Methode zu quantitativen Bestimmung der Di-n- butylphosphat-Gruppe besteht in der Hydrolyse durch Natri ummethylat in Methanol mit anschließender Absenkung des pH-Wertes durch Salzsäure und Bestimmung der Phosphor säure als auch des freigesetzten Diamins (NH₂-(CH₂)_n-NH₂) durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC).

In den nachfolgenden Beispielen sind einige bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen trägergebundenen Dialkoxyphosphorverbindungen bei ihrer Herstellung und ihrer Verwendung beschrieben:

Beispiel 1

21,0 g Di-n-butylphosphat werden in 100 ml 1,2-Dimeth oxyethan bei 4°C gelöst. Unter stetigem Rühren werden 18,0 g N-ethyl-N′-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimid, das in 75 bis 100 ml Wasser gelöst ist, tropfenweise zu der Lösung gegeben, bis eine Konzentration von 0,1 mol/l Carbodiimid erreicht ist. Der pH-Wert wird auf pH 5,1 bis 5,5 konstant gehalten. Die milchige Suspension wird mit 1,4-Dioxan (10% w/w) versetzt, um die Löslichkeit von Di-n-butylphosphat zu erhöhen.

Es empfiehlt sich, das Gel, z. B. Fractogel, Agarose oder Sephadex unter kräftigem Rühren, vorzugsweise in einem Volumenverhältnis von Flüssigkeit (Suspension) zu Gel wie 2 : 1 (4°C, pH 5,5-6,0, maximal 6,0) mit Thionylchlorid in Pyridin (Gewichtsverhältnis 1 : 1) zu versetzen, um den pH-Wert während der Kupplungsreaktion möglichst kon stant auf pH = 6,0 zu halten. Die Lösung von Di-n-butyl phosphat und N-ethyl-N′-(3-dimethyl-aminopropyl) carbo diimid wird dann unter stetem Rühren tropfenweise zur Suspension zugegeben. Der beobachtbare pH-Abfall wird in den ersten 30 Minuten durch Pyridin/SOCl₂ korrigiert (pH = 6,0, 4°C). Die Reaktion ist nach vier Stunden bei 4°C beendet.

Beispiel 2

Um aktivierte Sepharose 6 B mit einem hydrophoben Spacer arm an (CH₂) ₄ herzustellen, verfährt man wie unter 1 beschrieben, läßt jedoch zuerst das Gel mit z. B. 1,4 bis (2,3-epoxypropyloxy) butan, bei 20°C mit einem 10%igen (w/w) Überschuß des Epoxides reagieren. Die Aufarbeitung gestaltet sich ebenso wie unter 1 ausgeführt.

Im Unterschied zum mehr hydrophoben Spacerarm liegt in diesem Fall ein Gemisch von hydrophilen in hydrophoben Bereichen innerhalb des Spacerarms vor:

Die Verlängerung der (CH₂)_n-Gruppe kann u. a. durch Kon densation mit n-Dialkyl-diolen geschehen, die am Ende eine Epoxy-Gruppe enthalten. Die Beladungsdichte liegt bei einer Kettenlänge von n = 6 bei 120 µmol/g geschwol lenem Gel im Fall von Sephadex G 100, oder 25 bis 30 µmol/g geschwollenem Gel bei Sepharose 6 B und 15 bis 18 µmol/g geschwollenem Gel bei Fractogel.

Eine Erhöhung der Beladung um das fünffache, bis zu 150 µmol/g geschwollenem Gel kann durch Hinzunahme des Kupplungsreagenzes erreicht werden.

Das Gel wird in einer Bowl-Zentrifuge oder in einer RC5B (Dupont) bei 2000 UpM abzentrifugiert, und der Überstand verworfen. Der Rückstand wird mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, abgenutscht und anschließend lyophi lisiert.

Die Beladungsdichte des Gels mit dem Ligand einschließ lich der Di-n-butylphosphat-Gruppe wurde durch Titration der o-Phosphorsäure nach Hydrolyse mit konzentrierter Salzsäure bestimmt. Alternativ dazu ist auch eine direkte Bestimmung durch HPLC-Chromatographie (Bondepak I 75, isotaktisch) des mit Di-n-butylphosphat beladenen Spacer arms, z. B. Tr-Spac(-O)_nPO(OC₄H₉)₂ möglich.

Die Beladungsdichte liegt bei Sephadex G 100 oder Agarose-Gelen in der Größenordnung von 25 µmol/g hydra tisiertem Gel oder 25 µmol/g hydratisiertem Gel im Falle von Agarose A 1,5 m. Fractogel-Präparationen haben im Durchschnitt eine Beladungsdichte von 25 bis 30 µmol/g geschwollenem Gel.

Beispiel 3 Herstellung von Di-n-butylphosphorshrechlorid ((RO)₂P(O)CL)

168 g Phosphoroxychlorid und 175 g n-Butanol (p.a) werden in einem 1 Liter Rundkolben mit Rückflußkühler und Ther mometer gemischt und mittels eines Heizpilzes auf 130 bis 140°C erwärmt. Die entstehende Salzsäure wird mit NaOH aufgefangen. Die Reaktion ist nach 1 1/2 bis 2 Stunden beendet. Der Kolbeninhalt wird im Vakuum bei 0,8 bis 1,0 T fraktioniert und die entsprechende Fraktion bei Kp 95 bis 97°C und 1,5 T aufgefangen und redestilliert. Kp : 93-95°C / 1,5 T. Die Ausbeute beträgt ca. 190 g entsprechend 80%.

Erwähnenswert ist, daß durch entsprechende Variation der Molverhältnisse auch das n-Butylphosphorsäure-dichlorid (Kp : 130°C, 760 T) erhalten werden kann.

Die CNBT aktivierte Agarose 2B wird wie unter 2 be schrieben mit einem entsprechenden Spacerarm, z. B. mit 1,4-(2,3-epoxybutoxy)-Butan versehen und anschließend in 1 Liter Pyridin unter stetem Rühren die molare Menge von Di-n-butylphosphorsäurechlorid gelöst und 22,6 g Dicyc lohexylcarbodiimid hinzugesetzt werden. Nach 60 Stunden bei 35°C wird vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, zunächst mit reichlich Wasser, dann mit reichlich Ether gewaschen und anschließend mit 2 Liter 0,01 M Kalium Phosphat-Pufferlösung vom pH 7,5 und 20°C gewaschen. Das so hergestellte Gel bzw. die Gelmatrix wird in 0,001 M Kalium-Phosphat-Pufferlösung bei pH 7,5 und 4°C in Gegen wart von Natriumazid aufbewahrt.

Beispiel 4 Herstellung von Di-n-butylphosphonat und Di-n-butylphos phorsäurechlorid

Zu einer eisgekühlten Lösung von 15,0 g Phosphortrichlo rid in 100 ml Benzol (Toluol) wird unter stetem Rühren innerhalb von 3 Stunden eine Mischung von 24,5 g Di methylanilin und 22 g n-Butylakohol zugetropft. Unter Fortsetzen des Rührens werden nach weiteren 20 Minuten 12 g n-Butylalkohol (p.a.) in derselben Weise zugetropft. Die Reaktionsmischung läßt man über Nacht bei 20°C stehen, fügt 75 ml Wasser hinzu und wäscht die Benzol- (Toluol-) Phase im Scheidetrichter mehrmals mit 50 ml H₂O, dann mit 5 M Ammoniak und anschließend mit 500 ml Wasser aus. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natrium sulfat bzw. Molekularsieben wird das Benzol (Toluol) im Vakuum abgezogen. Das im Rückstand verbliebene Öl wird im Hochvakuum bei 10^-2 T und 70°C unter Stickstoffatmosphäre destilliert. Zur Destillation wird das Produkt zunächst mit Ammoniakgas gesättigt und in Gegenwart von 1% N- methyl-morpholin destilliert. Das Di-n-butylphosphonat destilliert bei 78°und 10^-1 T über. 15 g Di-n-butyl phosphonat werden in 100 ml Tetrachlorkohlenstoff gelöst und bei -20°C langsam eine 1,0N Lösung von Chlor in Tetrachlorkohlenstoff hinzugegeben. Es wird unter stetem Rühren bei -20°C trockenes Stickstoffgas eingeleitet bis keine Salzsäure mehr entweicht. Nach Verdampfen des Tetra chlorkohlenstoffs bei 20°C destilliert das Säurechlorid als hellgelbe Flüssigkeit bei 0,5 T über. Es wird sofort in die Kopplungsreaktion eingesetzt.

2,5 g Di-n-butylphosphorsäurechlorid werden in 50 ml Pyridin (90%) unter stetem Rühren bei 40°C in Gegenwart von 6-Chlorhexanol und 10 ml Tri-butylamin gelöst. Unter stetem Rühren und Herabsetzung der Temperatur auf 20°C wird 1 g Gel (Fractogel, Sepharose 6B) eingerührt, und der Brei 60 Stunden bei 20°C stehen gelassen. Danach wird das Gel auf einer Nutsche mit mindestens 1 Liter Wasser gewaschen, danach mit 2 Liter 0,001 M Kalium-Phosphat- Pufferlösung bei pH 7,5 gespült. Das fertige Gel mit der Phosphorsäure-Matrix wird in Gegenwart von Natriumazid in 0,001 M Kalium-Phosphat-Pufferlösung bei 4°C aufbewahrt.

Beispiel 5 1-Chloroctyl-di-n-butylphosphonat

Eine Mischung von 25 g 1,8-Chloroctan und 25,5 g Tri-n- butylphosphit werden für 6 Stunden auf 100°C erhitzt. Anschließend wird bei 150 bis 160°C und 10 T destilliert und das übergehende 1-Chloroctyl-di-n-butylphosphonat in 70%iger Ausbeute aufgefangen.

Der Ester wird in 25 ml Pyridin (90%) in Gegenwart von 1 g Fractogel (Agarose 6B) bei 20°C unter stetem Rühren an das Gel gekoppelt. Die Mischung wird 60 Stunden ste hengelassen und anschließend auf der Nutsche mit 1 Liter Wasser, dann mit 2 Litern 0,01 M Di-Kaliumhydrogenphosphat bei pH 7,5 gewaschen. Das Gel wird in 0,001 M Di-Kalium hydrogenphosphat bei pH 7,5 in Gegenwart von Natriumazid bei 4°C aufbewahrt.

Bezugsbeispiel 1

5 l Fractogel, beladen mit chemisch fixiertem Dibutyl phosphat (50-1000 µmol/ml) werden in 0,15 mol/l NaCl suspendiert und in eine Chromatographiesäule gefüllt, so daß die Höhe des Gelbettes etwa gleich groß ist wie der Durchmesser der Säule.

5 l Human-Citrat-Plasma werden filtriert (Porengröße 1 µm) und mit Herpes-Simplex-Viren (HSV) versetzt.

Das Plasma passiert anschließend bei Raumtemperatur das Gelbett im Verlauf von 8 Stunden.

Danach ist kein virulentes HSV mehr nachweisbar.

Bezugsbeispiel 2

Eine Chromatographiesäule mit Dibutylphosphat-beladenem Fractogel wird vorbereitet wie unter 1 beschrieben.

50 l einer Faktor VIII-haltigen Lösung, die 120 µmol/l NaCl, 10 mmol/l Na₃-Citrat, 1 mmol/l CaCl₂ und 120 mmol/l Glycin enthält, werden filtriert (1 µm) und wie unter 1 mit HSV versetzt. Die Faktor VIII-Lösung passiert das Gelbett im Verlaufe von 12 Stunden bei Raumtemperatur.

Danach ist kein virulentes HSV mehr nachweisbar.

Die im 1-Phasentest bestimmte Faktor VIII-Aktivität wird durch diese Behandlung nicht beeinträchtigt.

Bezugsbeispiel 3

5 l Fractogel, an dessen Oberfläche Dibutylphosphonat über Spacer chemisch fixiert wurde (50-1000 µmol/ml werden in einer temperierbaren Chromatographie-Säule vorbereitet wie unter 1 beschrieben. Das Gelbett wir mittels eines Ultrathermostaten auf +30°C gehalten.

5 l Human-Citrat-Plasma werden filtriert (Porengröße 1 µm) und mit Polioviren versetzt.

Das Plasma passiert anschließend das Gelbett im Verlaufe von 6 Std. bei +30°C.

Danach ist kein virulentes Polio-Virus mehr nachweisbar.

Bezugsbeispiel 4

5 l Dibutylphosphat-beladenes Fractogel werden vorbe reitet wie unter 1.

50 l Human-Citrat Plasma werden filtriert (Porengröße 1 µm) und mit HSV versetzt.

Das Plasma passiert anschließend das Gelbett im Verlaufe von 24 Std. bei Raumtemperatur.

Danach ist kein virulentes HSV mehr nachweisbar.

Claims

1. Trägergebundene Dialkoxyphosphorverbindungen der all gemeinen Formel I Tr-Spac(-O)_n-PO(OAlk)₂ (I)in der Tr einen inerten Träger, Spac einen Spacer, n die Zahlen 0 und 1 und Alk Alkylgruppen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeuten.

2. Trägergebundene Dialkoxyphosphorverbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als inerter Träger anorganische oder organische Festkörper oder Gele verwendet werden, welche durch kovalente Bindun gen mit einem Spacer verknüpft werden können.

3. Trägergebundene Dialkoxyphosphorverbindungen gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Spacer geradkettige Alkylgruppen mit 3 bis 8 Kohlen stoffatomen verwendet werden, die an beiden Enden ko valent gebunden sind.

4. Trägergebundene Dialkoxyphosphorverbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylgruppen geradkettig sind und 3 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen.

5. Verfahren zur Herstellung von trägergebundenen Dialk oxyphosphorverbindungen der allgemeinen Formel I, in der Tr einen inerten Träger, Spac einen Spacer, n die Zahlen 0 und 1 und Alk Alkylgruppen mit 1 bis 10 Koh lenstoffatomen bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst der Träger mit einem Ende des Spacers umge setzt wird und dann das zweite Ende des Spacers mit einer Dialkoxyphosphorverbindung verknüpft wird.

6. Verwendung von trägergebundenen Dialkoxyphosphorver bindungen der allgemeinen Formel I zur Auftrennung und/oder Abtrennung von lipophilen Komponenten einer Lösung, insbesondere zur Inaktivierung und/oder Ent fernung von Viren, insbesondere phospholipid-umhüll ten Viren aus biologischen Flüssigkeiten, insbeson dere proteinhaltigen Lösungen.