DE3942579A1

DE3942579A1 - Neue proteine

Info

Publication number: DE3942579A1
Application number: DE19893942579
Authority: DE
Inventors: Anni Barbara Dr Endler-Jobst; Stefan Prof Dr Meuer; Burkhard Dr Schraven
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1989-12-22
Filing date: 1989-12-22
Publication date: 1991-06-27
Also published as: WO1991009873A1

Description

Ein zentraler Vorgang bei der Auslösung spezifischer immunologischer Reaktionen des Körpers ist die Aktivierung der Lymphozyten, insbesondere der T-Zellen, auch t-Lymphozyten genannt. Die T-Zellen vermitteln die zelluläre Zytotoxizität und stellen die regulatorischen Elemente für andere Effektorzellen des Immunsystems dar, wie antikörperproduzierende B-Zellen oder Phagozyten der myelo-monozyteren Zellreihe. In der letzten Zeit sind einige Strukturen identifiziert worden, die für die Aktivität der T-Zellen eine Rolle spielen: Der T-Zell-Rezeptor für Antigene (Ti-CD₃) (J. Immunol. 129, 2293 (1982)), das CD2-Molekül (Cell 36, 897 (1984)) sowie das CD45-Molekül (Eur. J. Immunol. 19, 337 (1989)).

Es wurden nun zwei weitere Proteine gefunden, die bei der T-Zell-Akti vierung eine Rolle spielen.

Gegenstand der Erfindung sind zwei neue Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß sie

1. ein Molekulargewicht von etwa 65 bzw. 150 kd besitzen,
2. an der Oberfläche von T-Zellen vorkommen,
3. die Aktivität der T-Zellen beeinflussen und
4. mit CD2 und CD45 kopräzipitieren.

Das Molekulargewicht der neuen Proteine wurde elektrophoretisch durch Vergleich mit Standardsubstanzen ermittelt.

Durch die radioaktive Markierung und anschließende Isolierung von T-Zell-Oberflächenproteinen konnte die Existenz dieser neuen Proteine nachgewiesen werden.

Zur Gewinnung der neuen Proteine geht man von T-Zellen aus, die sich aus menschlichem Blut isolieren lassen (Eur. J. Immunol. 19, 337 (1989)). Die Oberflächenproteine der T-Zellen werden mit ¹²⁵I markiert und dann mit dem Crosslinker DSP (= 3,3′-Dithiobissuccinimidylpropionat) behandelt. An schließend werden die Zellen lysiert. Die Zellkerne werden entfernt und ein Teil der unspezifisch bindenden Proteine durch Bindung an Prote in A-Sepharose® entfernt. Dann wird mit CD2- bzw. CD45-spezifischen Antikörpern immunpräzipiert und das Präzitat elektrophoretisch getrennt, Antikörpern immunpräzipiert und das Präzitat elektrophoretisch getrennt, wobei die neuen Proteine in reiner Form anfallen.

Gegenstand der Erfindung sind weiter Antikörper, die an die Proteine gemäß Anspruch 1 binden und auf die Aktivierung der T-Zellen einwirken.

Bevorzugt sind monoklonale Antikörper mit den genannten Eigenschaften.

Die Antikörper lassen sich in an sich bekannter Weise herstellen.

Bei einer dem Krebs wenigstens ebenbürtigen Krankheitsgruppe, den Auto immunaggressionserkrankungen, wie multiple Sklerose, juveniler Diabetis mellitus, Lupus erytemotodes, Sarkoidose, chronische Hepatitis und rheuma toide Arthritis, spielt die Regulation der T-Zell-Aktivierung eine zentra le Rolle. Durch die Beeinflussung der neuen Proteine, die an der Akti vierung der T-Lymphozyten beteiligt sind, bietet sich die Möglichkeit, in die Aktivierung einzugreifen. Dabei steht bei den oben genannten Krank heitsbildern die suppression des Immunsystems im Vordergrund. Das gleiche gilt für die prophy1aktische und therapeutische Intervention zur Verhin derung der Abstoßungsreaktion nach Organtransplantationen.

Beispiel

4×10⁷ aus menschlichtem Blut frisch präparierte T-Zellen wurden in 0,5 ml PBS pH 7,4 aufgenommen und die Oberflächenmoleküle der T-Zellen mit Hilfe der Glukose-Oxidase-Technik mit Na¹²⁵I markiert. Dazu wurden der Zellsuspension 5µl Glucose (50 mM), 7µl Lactoperoxidase (100 nM), 1µl Na¹²⁵I und 4 U Glukose-Oxidase (1300 U/ml) zugesetzt, die Mischung unter ständigem Schütteln 15 min inkubiert und anschließend einmal mit 10 ml PBS, dem 2% fötales Kälberserum und 0,1% Natriumazid zugesetzt worden war, gewaschen. Die Zellen wurden dann nochmals in PBS, pH 8,3, ohne Zusätze gewaschen. Für die "crosslinking" Experimente wurden die ¹²⁵Iod markierten T-Zellen in PBS, pH 8,3 mit einer Dichte von 5×10⁶ Zellen/ml resuspendiert. DSP, gelöst in DMSO, wurde den T-Zellen bis zur Endkonzen tration 50µg/ml zugesetzt. Es folgte eine Inkubationsphase von 60 min, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Danach wurden die T-Zellen zweimal mit PBS, pH 7,4 gewaschen und anschließend 60 min in 400 l RIPA-Puffer (0,01 M NaH₂PO₄, 10 m MEDTA, 10 mM EGTA und 1mM NaF), der zusätzlich 1% Triton® X-100, 0,15 M NaCl, 0,5%, Na-Desoxycholat, 1 mM PMSF, 20 mM Iodacetamide und 2µg/ml Trypsininhibitor enthielt, lysiert.

Die Zellkerne wurden dann durch einen Zentrifugationsschritt (10 min, 15 000 g) abgetrennt und das restliche Zell-Lysat mit 50µl Protein A-Sepharose® beads inkubiert, um unspezifische Immunkomplexe abzutrennen.

Dieser Inkubationsvorgang wurde dreimal wiederholt. Anschließend wurden die Zell-Lysate einmal mit 25µl Protein A-Sepharose® und 25µl CNBr akti vierter Sepharose® 4 B gereinigt. Ober Nacht erfolgte die Immunpräzipi tation der spezifischen Antigene bei 4°C mit den entsprechenden mono klonalen Antikörpern, die an CNBr aktivierte Sepharose® 4B gebunden waren.

Hierzu wurde als CD2-spezifischer Antikörper der TII-Antikörper und als CD45-spezifischer Antikörper der KCS6-Antikörper (beide erhältlich von der Firma Coulter, Krefeld) eingesetzt. Diese antikörpertragenden Beads, die spezifisch die entsprechenden Antigene, die radioaktiv markiert waren, gebunden hatten, wurden dann viermal mit folgenden Puffern gewaschen: Puffer 1: RIPA-Puffer mit 0,5% NaDOC, 0,5 NaCl, 1% Triton® X-100; Puffer 2 und 3: RIPA mit 0,05% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NaDOC, Puffer 4: RIPA mit 0,15 M NaCl, 1% Triton® X-100.

Die radioaktiven Immunkomplexe wurden anschließend auf ein SDS-Gradi enten-Flachgel aufgetragen und nach ihrem Molekulargewicht in der Elektro phorese unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Das Molekulargewicht der präzipitierten Proteine wurde mit Hilfe der Technik der Autoradio grafie von den getrockneten Gelen bestimmt.

Als Kontrolle wurden die markierten T-Zellen mit CD3-spezifischen Antikörpern (monoklonaler Antikörper OKT3 von der Firma Ortho Diagnostics) immunpräzipitiert, um die Spezifität der Kopräzipitation der neuen Proteine mit CD2 und CD45 zu zeigen.

Die Abbildung zeigt Immunpräzipitate von Transmembranmolekülen, die auf der Oberfläche von ruhenden humanen T-Lymphozyten exprimiert werden. In den Spuren A, C und D der Abbildung sind die Immunpräzipitate dargestellt, die unter mock crosslinking (den nicht zu crosslinkenden T-Lymphozyten wird DMSO zugesetzt, um bei der Immunpräzipitation Artefakte zu vermeiden) Bedingungen mit Hilfe monoklonaler Antikörper gewonnen wurden, die spezifisch mit DC2 (Spur A), CD3 (Spur C) und CD45 (Spur D) reagieren. Man erkennt, daß der CD2 Antikörper unter mock crosslinking Bedingungen (Spur A) das CD2 Protein mit einem Molekulargewicht von 50 Kilodalton (kd) präzipitiert. Der CD3 Antikörper (Spur C) erkennt drei Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 20-26 kd (den CD3 Komplex, der aus einer Gamma-, einer Delta- und einer Epsilon-Kette besteht), während der CD45 Antikörper (Spur D) die vier Isoformen des CD45 Moleküls mit Molekulargewichten von 180, 190, 200 und 220 kd präzipitiert. Unter mock crosslinking Bedingungen wurden keine weiteren Proteine nachgewiesen. Dies verdeutlicht einerseits die Spezifität der Antikörper für die zu erkennenden Antigene und andererseits die qualität der Immunpräzipitation. Die Spuren B, E und F zeigen die Proteinmuster die bei gleichem Versuchsansatz unter cross linking Bedingungen (CD2 Spur B; CD3 Spur E; CD45 Spur F) präzipitiert wurden. Der CD2 Antikörper präzipitierte unter crosslinking Bedingungen das CD2 Molekül (Spur B, unterer großer Pfeil, die Isoformen des CD45 Moleküls (Spur B, oberer großer Pfeil), sowie die drei zusätzlichen Proteine mit Molekulargewichten von 150, 65 und 43 kDa (Spur B, kleine Pfeile). Es fällt auf, daß das Proteinmuster in qualitativer Hinsicht dem gleicht, welches von dem CD45 Antikörper unter crosslinking Bedingungen präzipitiert wurde. Der obere große Pfeil in Spur F markiert die Isoformen des CD45 Moleküls, der untere große Pfeil das 50 kDa CD2 Molekül und die kleinen Pfeile die drei zusätzlichen Proteine. Im Gegensatz zu dem CD2 bzw. dem CD45 Antikörper präzipitierte der CD3 Antikörper unter cross linking Bedingungen neben den CD3 Molekülen zwei weitere Proteine mit Molekulargewichten von ca. 45 kd (Spur E). Diese zwei Proteine stellen die beiden Ketten (Alpha und Beta) des T-Zellrezeptors dar, der in nicht kovalenter Form mit den CD3 Molekülen assoziiert ist. Neben dem T-Zell rezeptor wurden von dem D3 Antikörper keine weiteren Proteine copräzisiert, im speziellen nicht CD2, CD45 oder die drei zusätzlichen Proteine. Das Ergebnis dieses Versuches läßt sich also in folgender Weise interpretieren: Unter Verwendung eines chemischen crosslinkers läßt sich auf dem ruhenden T-Lymphozyten ein Proteinkomplex nachweisen, der aus CD2, CD45, sowie drei weiteren Proteinen und Molekulargewichten von 150, 65 und 43 kD besteht. Das 43 kD-Protein repräsentiert dabei MHC Klasse I Mole küle. Die Entfernung zwischen den einzelnen Proteinen dieses Komplexes beträgt < 1,2 nm. Der Komplex befindet sich in größerer räumlicher Ent fernung (< 1,2 nm) von dem CD3 Molekül und dem hiermit assoziierten T-Zellrezeptor. Die Proteine mit den Molekulargewichten 65 und 150 stellen die neuen Proteine dar.

Claims

1. Körpereigene Proteine dadurch gekennzeichnet, daß sie

1. ein Molekulargewicht von etwa 65 bzw. 150 kd besitzen,
2. an der Oberfläche von T-Zellen vorkommen,
3. die Aktivität der T-Zellen beeinflussen, und
4. mit CD2 und CD45 kopräzipitieren.

2. Antikörper, die an die Proteine gemäß Anspruch 1 binden und auf die Aktivierung der T-Zellen einwirken.