DE3940067A1

DE3940067A1 - Steroidogenese induzierendes protein (sip)

Info

Publication number: DE3940067A1
Application number: DE3940067A
Authority: DE
Inventors: Erfinder Wird Nachtraeglich Benannt Der
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Khan Shafig Ahmed Drmedsci Toronto Ontario
Priority date: 1989-12-04
Filing date: 1989-12-04
Publication date: 1991-06-06
Also published as: US5484767A; DE3940067C2

Description

Die Funktion der Geschlechtsorgane wird in Säugetieren durch Sekretion von hypophysären Gonadotropinen, dem luteinisieren den Hormon (LH) und dem Follikel stimulierenden Hormon (FSH) gesteuert. Zusätzlich gibt es noch parakrine und autokrine Regulationsfaktoren in den Geschlechtsorganen selbst, welche die Wirkung von FSH und LH entweder inhibieren oder stimulie ren (Sharpe (1986), Clin. Endocrinol. Metab. 15, 185-207; Hsueh (1986), Clin.Endocrinol.Metab. 15, 117-134).

Mehrere derartige Faktoren wurden in Hoden und Ovarien gefun den. So ist bekannt, daß Extrakte aus Rattenovarien minde stens zwei Faktoren enthalten, welche die Wirkung von LH beeinflussen. Einer dieser Faktoren hemmt die Bindung von LH an seinen Rezeptor und bewirkt somit eine Verringerung der Progesteron-Synthese, während der andere die Steroidprodukti on in Leydig-Zellen der Ratte stimuliert (Yang et al. (1979) Endocrinology 104, 552-558). Ein Faktor, der die Steroidpro duktion in Leydig-Zellen stimuliert, wurde auch in Follikel- Flüssigkeit aus Rindern gefunden (Risbridger et al. (1987), In Morphological Basis of Human Reproductive Function, Plenum Press, New York, Seite 63-64).

Khan et al. (1988), Acta Endocrinol. 118, 283-293 fanden auch in humaner Follikel-Flüssigkeit aus Ovarien eine biologische Aktivität (ICSA = Interstitial Cell Stimulating Aktivity), die in vitro eine starke Stimulation der Testosteron-Produk tion in Leydig-Zellen bewirkte. Dabei handelt es sich offen bar um ein Protein, da die Aktivität mit Ammoniumsulfat fällbar ist, durch Erhitzen auf 80 bis 100°C verloren geht und aufgrund einer gelchromatographischen Behandlung des Rohextrakts etwa ein Molekulargewicht von 30 bis 50 kDa be sitzt. Der aktive Faktor ist chemisch und immunologisch von LH, sowie von humanem Chorion-Gonadotropin (hCG) und humanem Menopausen-Gonadotropin (hMG) verschieden.

Verschiedene Gonadotropine werden in therapeutischen Verfah ren eingesetzt. So wird bei Männern hCG in Kombination mit hMG zu Initiation oder Aufrechterhaltung der Spermatogenese bei hypogonadotropem Hypogonadismus verwendet. hCG wird in Kombination mit hMG auch zur Behandlung von idiopathischer Oligozoospermie verwendet, wobei die Ergebnisse aber enttäu schend waren (Knuth et al. (1987) J.Clin.Endocrinol.Metab. 65, 1081-1087). Weiterhin werden unfruchtbare Frauen, die gegen das ovulationsauslösende Medikament Clomifen resistent sind, zur Bildung von multiplen Follikeln mit einer Kombina tion von hCG und hMG behandelt. Dieses Therapieverfahren ist jedoch unbefriedigend, da es schwierig, kostspielig und bei unsachgemäßer Durchführung sogar sehr gefährlich sein kann. Schließlich gibt es auch bei einer weiteren Krankheit, dem sogenannten "resistenten Ovarium-Syndrom", bei dem die Folli kel nicht auf FSH ansprechen, noch keine befriedigende Be handlungsmöglichkeit. Daher ist eine Bereitstellung neuer therapeutisch wirksamer Gonadotropin-Hormone dringend erfor derlich.

Aufgabe der Erfindung ist es demgemäß, ein neues (Protein-) Hormon bereitzustellen, das als therapeutische Alternative zu bekannten Hormonen wie LH, FSH, hCG und hMG bzw. in Kombina tion mit diesen Hormonen eingesetzt werden kann.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein humanes Steroidogenese induziernedes Protein (SIP), erhältlich aus menschlicher Follikel-Flüssigkeit, bei dem es sich um ein Hormon mit 60 kD Molekularge-wicht (SDS-PAGE) und einem isoelektrischen Punkt zwichen 4,7 und 4,9 handelt, das die Hormonproduktion von Geschlechtszellen und Adrenalzellen stimuliert, wobei diese Stimulierung über einen Mechanismus vermittelt wird, an dem der cAMP-Zyklus nicht beteiligt ist.

Das erfindungsgemäße Hormon ist sowohl in Testes als auch in Follikeln vorhanden. Sein scheinbares Molekulargewicht nach gelchromatographischer Messung beträgt zwischen 30 und 50 kD, während es in Puffern mit geringer Ionenstärke ein Molekular gewicht von 60 kD aufweist. SDS-PAGE-Analyse von hochgerei nigtem SIP zeigt ein Molekulargewicht von 60 kD sowohl unter reduzierenden wie auch nicht reduzierenden Bedingungen. Bei Dissoziation kann es in mehrere Teile zerfallen, von denen einer Albumin ist. Eine weitere Fraktion besitzt eine sehr hohe Aktivität, ergibt jedoch keine Bande im Chromatogramm. Hierbei handelt es sich wahrscheinlich um ein sehr kleines Protein. Eine Sequenzierung des N-terminalen Endes dieser Fraktion ergab Verwandtschaft mit Transferrin.

Bei SIP handelt es sich um das erste Proteinhormon, das die Steroidproduktion ohne Beteiligung des cAMP-Zyklus stimu liert. Es wirkt auf die Mitochondrien und vermag die Produk tion sowohl von Testosteron in Leydig-Zellen als auch von Progesteron in Granulosa-Zellen und die Corticoid-Bildung in Adrenalzellen zu stimulieren. Seine Aktivität ist sehr hoch und beträgt etwa das 10- bis 15fache von bisher bekannten Faktoren. Es kann weiterhin die Proliferation von unreifen Leydig-Zellen stimulieren. Außerdem stimuliert es die Spal tung von Cholesterinseitenketten in den Mitochondrien von Leydig-Zellen.

Ein Nachweis von SIP ist bei Frauen kurz vor dem Eisprung möglich. Dagegen kann das Hormon am Anfang des Zyklus nicht nachgewiesen werden.

Ein Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung des erfindungsgemäßen Hormons, wobei man menschli che Follikel-Flüssigkeit (hFF) sammelt und daraus das Hormon durch Anreicherung gewinnt. Beispielsweise geeignet ist hFF aus Frauen, die zuvor mit bekannten gonadotropen Hormonen behandelt wurden. Dabei werden vorzugsweise zunächst diezel lulären Bestandteile aus hFF abgetrennt und der Überstand, der das Hormon enthält, durch Ammoniumsulfatfällung bei 80% Sättigung und Dialyse vorgereinigt. Die weitere Reinigung des Hormons kann durch übliche biochemische Methoden, wie Gel chromatographie oder/und Gelfiltration, Konzentrierung, Affi nitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und erneute Gelchromatographie erfolgen. Die bioaktiven Frak tionen kann man nach jeder Reinigungsstufe durch geeignete Tests, z. B. die Stimulierung der Testosteronproduktion in Leydig-Zellen, bestimmen. So ist es möglich, das erfindungs gemäße Hormon bis zur Homogenität zu reinigen.

Das erfindungsgemäße Hormon SIP besitzt eine außerordentliche klinische Bedeutung. Weiterhin ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Arzneimittel, welches das erfindungsgemäße Hormon neben üblichen pharmazeutischen Träger- und Hilfsmit teln enthält. Insbesondere beinhaltet die Erfindung ein Arz neimittel, welches das erfindungsgemäße Hormon in Kombination mit anderen Hormonen, insbesondere mit gonadotropen Hormonen, enthält. Bevorzugt kann ein erfindungsgemäßes Arzneimittel dazu eingesetzt werden, die Proliferation von Leydig-Zellen in Männern zu stimulieren, deren Leydig-Zellen geschädigt sind, z. B. nach Chemo- oder Strahlentherapie von Tumoren und bei besonderen Hodentumoren, und die dadurch bedingt einen Mangel an Androgenen aufweisen. Eine Behandlung mit SIP könn te eine lebenslange Gabe von Testosteronen ersetzen.

Weiterhin kann ein erfindungsgemäßes Arzneimittel bevorzugt für die Behandlung von hypogonadotropem Hypogonadismus ein gesetzt werden, um eine Verbesserung der Spermatogenese zu erzielen. Bislang wurde dazu hCG in Kombination mit hMG ver wendet. Durch Verabreichen von SIP könnte eine schnelle Ini tiation der Spermatogenese erreicht werden, was die Zeitspan ne bis zur Empfängnis und somit auch die Zeitdauer der teuren und unbequemen Behandlung verkürzen könnte.

Weiterhin ist es möglich, SIP entweder alleine oder etwa in Kombination mit hMG zur Erhöhung der Spermienzahl bei Behand lung von idiopatischer Oligozoospermie zu verwenden.

Bei Frauen kann SIP das Follikelwachstum stimulieren und somit für Behandlungsverfahren verwendet werden, bei denen die Bildung multipler Follikeln stimuliert werden soll, z. B. künstliche Besamung oder in vitro Fertilisation. Weiterhin kann SIP als Ersatz für Clomifen bei einer Induzierung der Ovulation dienen. So gibt es unfruchtbare Frauen, die gegen eine clomifen-Behandlung resistent sind und gegenwärtig mit einer Kombination aus hMG und hCG behandelt werden müssen. Dieses Therapieverfahren ist jedoch schwierig durchzuführen, teuer und kann gefährlich sein, da eine Überstimulierung eintreten kann, die in wenigen Fällen bereits den Tod der Patientin hervorgerufen hat. In dieser Hinsicht könnte SIP ein sichereres Arzneimittel sei.

Im sogenannten "resistenten ovarium-Syndrom" ist eine Stimu lation der Follikel durch FSH nicht möglich. Die Ursache dieser Krankheit ist noch nicht genau bekannt, möglicherweise sind aber die FSH-Rezeptoren defekt. Hier könnte ebenfalls das erfindungsgemäße Hormon zur Behandlung verwendet werden, da seine Wirkung weder über FSH- noch LH-Rezeptoren vermit telt wird.

Diese Aufzählung möglicher therapeutischer Anwendungsmöglich keiten des erfindungsgemäßen Homrons SIP soll den Einsatz von SIP für weitere Therapieverfahren nicht ausschließen, bei denen die Hormonproduktion in Geschlechtszellen stimuliert werden soll.

Schließlich kann SIP auch für diagnostische Verfahren zum Nachweis von Funktionsstörungen in Geschlechtszellen verwen det werden. So kann man bei Frauen, bei denen ein Follikel zwar heranreift, aber keine Ovulation stattfindet, SIP nicht nachweisen. Auch könnten mit Untersuchungen zur Stimulierbar keit von Leydigzellen durch SIP unterschiedliche Ursachen von Defekten der Leydig-Zellen erkannt werden, z. B. Versagen der LH-Rezeptoren, des Adenylat-Zyklasesystems oder mitochondria le Defekte.

Folgende Beispiele sollen die Erfindung zusammen mit den Fig. 1 bis 6 erläutern.

Es zeigen:

Fig. 1 Isoelektrofokussierung der biologischen Aktivität aus menschlicher Follikel-Flüssigkeit im Bereich von pH 3,5 bis 7,0

Fig. 2 Vergleich der zeitlichen Wirkung von hCG und SIP auf die Testosteronproduktion in Leydig-Zellen von Ratten

Fig. 3 Vergleich der Wirkung von hCG, FSH und SIP auf die Progesteron-Produktion in menschlichen Granulosa- Zellen in vitro

Fig. 4 Stimulierung der proliferation von unreifen Leydig- Zellen der Ratte durch SIP

Fig. 5 Vergleich der Wirkung von hCG, SIP und 22-R-OH-Cho lesterin auf die Testosteron-Produktion in Leydig- Zellen von Ratten.

Fig. 6 Die Effekte von SIP auf die in vitro-Bildung von Corticosteron durch Ratten-Adrenalzellen

Beispiel 1 Isolierung und Reinigung von SIP 1.1 Sammeln von menschlicher Follikel-Flüssigkeit (hFF)

hFF wurde von Frauen gewonnen, die an einem in vitro-Verili sationsprogramm der Universität Münster teilnahmen. Die Frau en waren mit humanem Menopausal-Gonadotropin (hMG) und humanem Chorion-Gonadotropin (hCG) behandelt worden, um Fol likel-Entwicklung bzw. Ovulation zu induzieren. Zwischen 32 und 36 Stunden nach Verabreichung der Hormone wurden Oozyten und Follikel-Flüssigkeit gesammelt. Die einzelnen hFF-Proben wurden bei 1500 g 10 Minuten lang zentrifugiert, um zelluläre Bestandteile zu entfernen. Die Überstände wurden gesammelt und bei -20°C aufbewahrt.

1.2 Ammoniumsulfatfällung und Dialyse

Die hFF-Proteine wurden mit 80% Ammoniumsulfat bei 4°C über Nacht präzipitiert. Die Präzipitate wurden mit einer gleich konzentrierten Ammoniumsulfat-Lösung gewaschen und in destil liertem Wasser gelöst. Die Proteinlösungen wurden anschlie ßend gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) 48 Stunden bei 4°C dialysiert unter Verwendung von Dialysemembranen mit einer Durchlässigkeitsgrenze von 10 000 D (Sigma Chemi kalien). Das dialysierte Material wurde bei -80°C zur wei teren Reinigung der aktiven Substanzen aufbewahrt.

1.3 Gelfiltration mit Sephadex G-75 und Ultrogel AcA 54 bzw. Gelchromatographie mit Sephacryl S200

Zwei nacheinander geschaltete Säulen wurden verwendet, um die hFF-Proteine nach Ammoniumsulfatfällung und Dialyse zu frak tionieren. Die Probe (10 ml) wurde auf eine 2,5 × 90 cm große Sephadex G75-Säule (Pharmacia) aufgetragen und das Eluat durch eine 1,6 × 80 cm große Ultrogel ACA54-Säule (LKB) ge leitet. Die Elution mit 0,1 mol/l Tris/HCl pH 7.4 wurde mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/h durchgeführt und alle 20 Minuten wurden 2 ml Fraktionen gesammelt, bei denen die opti sche Dichte bei 280 nm bestimmt wurde. Biologische Aktivität (Stimulation der Testosteronproduktion in Leydig-Zellen der Ratte) wurde jeweils von 5 gesammelten Fraktionen bestimmt.

Alternativ dazu wurden 10 ml der dialysierten hFF-Proteine auf einer 2,5 × 80 cm großen Sephacryl S200-Säule unter Ver wendung von 20 mmol/l Tris/HCl-Puffer, pH 7,1, 0,15 mmol/l NaCl bei einer Flußgeschwindigkeit 1,0 ml/min aufgetrennt. Die optische Dichte wurde bei 280 nm gemessen und 3,0 ml- Fraktionen des Eluats wurden gesammelt. Die einzelnen Frakti onen wurden auf eine Stimulation der Steroidsynthese in Ley dig-Zellen untersucht.

1.4 Konzentrierung der aktiven Fraktionen

Die bioaktiven Fraktionen wurden durch Filtration mit Amicon- Filtern (CF3OA) mit einer Molekulargewichtsgrenze von 30 kD konzentriert. Die Überstände, die den größten Anteil der Bioaktivität enthielten, wurden für die weitere Reinigung verwendet. Hingegen hatte eine Lyophilisation den Verlust der Bioaktivität zur Folge.

1.5 Affinitätschromatographie mit Blue-Sepharose

Nach Konzentrierung wurden die vereinigten bioaktiven Frakti onen durch Affinitätschromatographie mit Blue-Sepharose (CL- 6B; Pharmacia) mit Hilfe einer Fast Protein Liquid Chromato graphy Apparatur (Pharmacia) gereinigt. 5 ml der Probe wurden auf eine 1,0 × 30 cm große Säule unter Verwendung einer Su perschleife (Pharmacia) aufgetragen. Die Säule wurde mit einer Geschwindigkeit von 1,5 ml/min unter Verwendung von Phosphatpuffer (50 mmol/l, pH 7,4) gespült. Nach Elution nicht gebundener Proteine wurden die gebundenen proteine unter Verwendung desselben Puffers eluiert, aber mit zusätz lich 2 mol/l NaCl. Die einzelnen Fraktionen (2,0 ml) wurden über kleine Sephadex G-25-Säulen (PD 10; Pharmacia) geleitet, um Salze zu entfernen. Alle Fraktionen wurden anschließend auf Bioaktivität getestet.

1.6 Ionenaustausch-Chromatographie mit Mono S

Die vereinigten bioaktiven Fraktionen nach der Sephacryl S- 200 Chromatographie wurden auch auf einer Kationenaustau schersäule (Mono S, HR 5/5; Pharmacia) gereinigt. Die Tren nungen wurden bei pH 5 durchgeführt unter Verwendung von 50 mmol/l Acetat als Puffer A und demselben Puffer mit 1,0 mol/l Natriumchlorid als Puffer B entsprechend den Angaben des Herstellers. Alle Fraktionen wurden auf Bioaktivität gete stet, die aktiven Fraktionen wurden vereinigt.

1.7 Ionenaustausch-Chromatographie mit Mono Q

Die aktiven Fraktionen nach Schritt 1.5 wurden auf einer Anionenaustauschersäule (Mono Q, HR 5/5; Pharmacia) unter Verwendung einer FPLC-Vorrichtung in zwei Schritten weiterge reinigt. Im ersten Schritt war entsprechend den Angaben des Herstellers der Puffer A 20 mmol/l Tris/HCl pH 7,1, 0,15 mol/l NaCl und Puffer B 20 mmol/l Tris/HCl pH 7,1, 1,0 mol/l NaCl.

Der zweite Reinigungsschritt wurde unter Verwendung der sel ben Puffer und des selben Programms durchgeführt, ausgenom men, daß der pH-Wert des Puffers 8,0 war. Die einzelnen Fraktionen (1,0 ml) aus diesen Reinigungsschritten wurden durch Sephadex G-25 Säulen geleitet, bevor sie in Bioassays getestet wurden.

1.8 Gelchromatographie mit Superose 12

Die aktiven Fraktionen der Mono Q Chromatographie (pH 8,0) wurden gelchromatographisch mit einer Superose 12 Säule (HR 10/30; Pharmacia) unter Verwendung einer FPLC-Vorrichtung und PBS als Elutionspuffer konzentriert und gereinigt. Die Elu tion wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min durch geführt und 1,0 ml Fraktionen wurden gesammelt, die an schließend auf Bioaktivität getestet wurden.

Beispiel 2 Charakterisierung von SIP 2.1 Isoelektrofokussierung der aktiven Fraktionen

Eine Isoelektrofokussierung auf Sucrose-Dichtegradienten wurde unter Verwendung einer 110 ml Glassäule (LKB) nach Robertson und Diczfalusy (1977), Mol.Cell.Endocrinol. 9, 57-67 durchgeführt. Ampholyte (Ampholine; LKB) wurden in einer Konzentration von 1% verwendet, um einen pH-Gradienten im Bereich von 3,5 bis 7,0 zu erzeugen. Nach einem 17stündigen Lauf bei 4°C wurden die Fraktionen (1,0 ml) vom Säulenboden gesammelt und der pH-Wert der einzelnen Fraktionen bestimmt. Die Fraktionen wurden dann über Sephadex G-25 Säulen geleitet (wie oben beschrieben), um Ampholyte und Sucrose zu entfer nen. Fig. 1 zeigt das Ergebnis dieser Isoelektrofokussie rung. Die bioaktiven Fraktionen liegen in einem pH-Bereich von 4,5 bis 5,5.

Weiterhin wurde eine Isoelektrofokussierung unter Verwendung eines Polyacrylamidgels (Phast-System, Pharmacia) durchge führt. Die Gele wurden mit Silver Stain gemäß der Vor schrift des Herstellers angefärbt.

2.2 SDS-PAGE

Um die Reinheit der bioaktiven Substanzen zu testen, wurde SDS-PAGE sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Die Gele wurden mit Silver Stain unter Verwendung des Phast-Systems gemäß der Vorschrift des Herstellers angefärbt. Die SDS-PAGE-Analyse von hochgereinigtem SIP sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht reduzierenden Bedingungen zeigte nur eine Bande mit einem Molekulargewicht von 60 kD.

Beispiel 3 Stimulierung der Testosteron-Produktion in Leydig-Zellen der Ratte 3.1 Kulturmedium

Alle Inkubationsreaktionen von testikulärem Gewebe oder iso lierten Zellen wurden in einem 1 : 1-Gemisch von Hams′s F-12 Wachstumsmedium und Dulbecco′s Modifizierung von Eagles mini malem essentiellen Medium (DMEM) durchgeführt. Zusätzlich enthielt das Medium 20 mmol/l HEPES, 20 mmol/l L-Glutamin und 0,2% Rinderserumalbumin.

3.2 Leydig-Zellen

Hoden von erwachsenen Ratten (60 Tage alt) wurden verwendet, um Leydig-Zellpräparationen zu erhalten. Von den Hoden wurde die Hülle entfernt, dann wurden sie 10 bis 12 Minuten im Inkubationsmedium unter Zusatz von 0,25 mg/ml Collagenase (Typ 1; Sigma Chemicals) inkubiert. Nach Absetzen des Rück standes wurde der Überstand, mit den Leydig-Zellen gesammelt. Die Leydig-Zellen wurden zweimal mit dem Medium gewaschen und 1 Stunde lang bei 32°C vorinkubiert. Danach wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 600 Upm zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und der Zellenrückstand in frischem Medium resuspendiert.

3.3 Test auf Bioaktivitä

200 µl dieser Zellsuspension (mit ca. 3 × 10⁴ lebenden Zel len) wurden in Gegenwart der Testsubstanzen 3 Stunden lang bei 32°C inkubiert. Der Testosterongehalt des Inkubationsme diums wurde nach üblichen Verfahren durch einen RIA bestimmt. Dieser Test wurde auch routinemäßig beim Reinigungsverfahren für SIP eingesetzt (Beispiel 1).

Um die zeitliche Wirkung von hCG und SIP zu bestimmen, wurden die Zellen wie oben beschrieben 1/2, 1, 2 bzw. 4 Stunden lang inkubiert und das Testosteron im Medium bestimmt. Fig. 2 zeigt einen Vergleich der zeitlichen Wirkung von hCG und SIP (bezeichnet als hFF-Protein). Eine Zugabe von hCG verursachte die Stimulierung der Testosteron-Produktion erst nach 2 Stun den. Dagegen trat die stimulierende Wirkung des hFF-Proteins bereits nach einer 30-minütigen Inkubationsdauer ein und war bei weitem höher als die von hGG. Daher ist anzunehmen, daß die beiden Hormone die Steroidsynthese über unterschiedliche Mechanismen stimulieren.

Inkubiert man die Zellen mit hFF-Proteinen in Gegenwart von maximalen Konzentrationen an hCG, Cholera-Toxin und cAMP bewirkt SIP eine weitere Stimulierung der Testosteron-Produk tion. Weiterhin bewirkte hCG eine Stimulierung der cAMP-Pro duktion durch Leydig-Zellen der Ratte, während SIP keinen Effekt auf die cAMP-Produktion unter gleichen Bedingungen hatte. Daraus läßt sich schließen, daß SIP die Steroidproduk tion ohne Beteiligung des cAMP-Zyklus stimuliert.

Weiterhin stimuliert SIP auch die Testosteron-Produktion in Leydig-Zellen von 10 Tage alten Ratten. Dabei wurden die Zellen 24 Stunden lang mit SIP inkubiert, bevor das Kulturme dium auf Testosteron getestet wurde.

Beispiel 4 Stimulierung der Progesteron-Produktion in Granulosa-Zellen 4.1 Kulturmedium

Für eine Langzeitkultivierung von menschlichen Granulosa- Lutein-Zellen wurde das in 3.1 beschriebene Medium verwendet, das 5% fötales Rinderserum anstelle von Rinderserumalbumin und zusätzlich Antibiotika (1300 mg/l Streptomycin, 600 mg/l Penicillin und 10 mg/l Gentamicin) enthielt.

4.2 Humane Granulosa-Lutein-Zellen

Bei der Gewinnung von Oozyten wurden auch weitere Zellen aus den Eierstöcken gewonnen, die von der Follikel-Flüssigkeit durch Zentrifugation abgetrennt wurden. Aus den Zellrückstan den wurden Granulosa-Lutein-Zellen durch Zentrifugation in 60% Percoll (Pharmacia) abgetrennt, wobei Erythrozyten ent fernt wurden. Nach Waschen wurden die Granulosa-Zellen durch Hyaluronidase-Behandlung (0,1%, 20 Minuten) isoliert und 6 × 10⁴ lebende Zellen in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml kulti viert (s. Wickings et al. (1986), J.Reprod.Fert. 76, 677-684). Das Medium wurde alle 48 Stunden gewechselt. Der Pro gesteron-Gehalt des Kulturmediums wurde nach üblichen Verfah ren durch einen RIA bestimmt unter Verwendung von Reagenzien, die aus dem WHO Matched Reagents programm bezogen wurden.

4.3 Test auf Bioaktivität

Hochgereinigtes SIP zeigte eine signifikante Stimulierung der Progesteron-Produktion in humanen Granulosa-Lutein-Zellen in vitro. Aus Fig. 3 wird ersichtlich, daß SIP alleine und insbesondere in Kombination mit hCG wirksam ist.

Beispiel 5 Proliferation von Leydig-Zellen

Leydig-Zellen wurden aus 20 Tage alten unreifen Ratten, wie in Beispiel 3 beschrieben, gewonnen. Etwa 0,25 × 10⁶ lebende Zellen wurden in 24 Kulturschalen mit 0,5 ml RPMI-Medium ausplattiert. Nach 24 Stunden Kultivierung wurde das Medium entfernt und frisches Medium zugegeben, das die Test substanzen enthielt. Nach 18stündiger Inkubation wurden 0,5 Ci ³H-Thymidin zugegeben und die Zellen für weitere 4 Tage kultiviert. Nach Entfernen des Mediums wurden die Zellen mit 0,4 ml Medium gewaschen und eingefroren. Zur Durchführung des Tests wurden die Zellen zunächst sonifiziert. Anschließend wurden die Extrakte durch ein DE81 Whatman Filterpapier fil triert. Die Radioaktivität der einzelnen Filterpapiere wurde dann in einem Szintilationszähler gemessen.

Aus Fig. 4 wird ersichtlich, daß gereinigte bioaktive hFF- Fraktionen nach Mono Q-Chromatographie (mit SIP als Wirk stoff) eine signifikante Stimulierung des Einbaus von ³H- Thymidin in unreife Leydig-Zellen bewirkten. Daraus kann man schließen, daß SIP die Proliferation von Ratten-Leydig-Zellen in vitro stimuliert. Diese Stimulierung ist spezifisch für Leydig-Zellen, da dieselben Fraktionen keine Proliferation von Granulosa-Zellen und Maus-Thymozyten bewirkten.

Beispiel 6 Stimulierung der Spaltung von Cholesterin-Seitenketten durch SIP

Fig. 5 zeigt, daß die Wirkung von 22-R-OH Cholesterin und SIP bezüglich der Stimulierung der Testosteron-Produktion in Leydig-Zellen von Ratten (vgl. Beispiel 3) sehr ähnlich ist. Bei Stimulierung der Steroid-Produktion durch 22-R-OH Chole sterin besitzt SIP sogar eine synergistische Aktivität.

Es ist bekannt, daß die Stimulierung der Testosteron-Produk tion durch 22-R-Hydroxy-Cholesterin durch Überbrücken der Cholesterin-Seitenkettenspaltung unter Beteiligung des mito chondrialen Cytochrom P450 geschieht (Rommerts et al. (1986) J.Endocrinol. 109, 111-117). Aus der vergleichbaren Wirkung von 22-R-Hydroxycholesterin und SIP kann man nun schließen, daß auch SIP auf Ebene der Mitochondrien die Stimulation der Testosteron-Synthese durch Stimulation der Cholesterin-Sei tenkettenspaltung bewirkt.

Beispiel 7 Adrenalzellen-Steroidogenese

Adrenalzellen wurden aus Drüsen erhalten, die aus männlichen Ratten nach dem Verfahren von Ray & Strott, in Endocrinology 103 : 1281 isoliert wurden. Ungefähr 5 × 10⁵ lebensfähige Zellen wurden mit und ohne Testmaterial bei 37°C 3 Stunden in einem metabolischen Schüttler inkubiert, und die Inkubations medien wurden dann auf Corticosteron analysiert unter Anwen dung eines Radioimmunassay-Kits (RSL¹²⁵I Corticosteron-Kit von ICN Biomedicals, Inc. Carson, CA, USA). Die Zellen wurden dabei entweder mit 40 µg SIP alleine oder in Kombination mit maximalen Konzentrationen von ACTH (25 mIU Synacthen) und einer db cAMP (25 µg) inkubiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Jeder Balken repräsentiert das Mittel von zwei unabhängigen Experimenten. Wie daraus zu entnehmen ist, indu ziert SIP sowohl basale als auch ACTH- oder cAMP-stimulierte Steroidproduktion und die Stimulation durch SIP ist auch in Gegenwart maximaler Konzentrationen von ACTH und cAMP deut lich.

Claims

1. Steroidogenese induzierendes Protein (SIP), dadurch gekennzeichnet, daß es ein aus menschlicher Follikelflüssigkeit erhält liches Hormon mit 60 kD Molekulargewicht (SDS-PAGE) und einem isoelektrischen Punkt zwischen 4,7 und 4,9 ist, das die Hormonproduktion von Geschlechtszellen und Adre nalzellen stimuliert, wobei diese Stimulierung über einen Mechanismus vermittelt wird, an dem der cAMP-Zyk lus nicht beteiligt ist.

2. Verfahren zur Gewinnung eines Hormons nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliche Follikelflüssigkeit sammelt und daraus das Hormon durch Anreicherung gewinnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zelluläre Bestandteile abtrennt und den Über stand durch 80%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat fällt und durch Dialyse vorreinigt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hormon weiterhin durch Gelchromatographie oder/und Gelfiltration, Konzentrierung, Affinitätschro matographie, Ionenaustausch-Chromatographie und erneute Gelchromatographie reinigt.

5. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Hormon nach Anspruch 1 neben üblichen pharma zeutischen Träger- und Hilfsmitteln enthält.

6. Arzneimittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich noch weitere gonadotrope Hormone ent hält.

7. Arzneimittel nach Anspruch 5 oder 6 zur Stimulation der Leydig-Zellen-Proliferation.

8. Arzneimittel nach Anspruch 5 oder 6 zur Verbesserung der Spermatogenese bei hypogonadotropischem Hypogonadismus.

9. Arzneimittel nach Anspruch 5 oder 6 zur Behandlung von idiopathischer Oligozoospermie.

10. Arzneimittel nach Anspruch 5 oder 6 zur Stimulierung des Follikelwachstums.

11. Arzneimittel nach Anspruch 5 oder 6 zur Induzierung der Ovulation.

12. Arzneimittel nach Anspruch 5 oder 6 zur Behandlung von FSH resistenten Follikeln.

13. Diagnostisches Verfahren zum Nachweis von Funktionsstö rungen in Geschlechtszellen oder/und Adrenalzellen unter Verwendung oder/und durch Bestimmung eines Hormons nach Anspruch 1.