DE3940009A1 - Mannose-spezifische lektine als diagnostikum und deren einsatz fuer diagnostische verfahren zum nachweis von onkogenen rna-viren oder bestandteilen von diesen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Diagnostikum zum direkten Nachweis onkogner RNA-Viren, insbesondere von menschlichen RNA-Viren (wie: human immunodeficiency virus HIV; human T-lymphotropic virus HTLV) besonders in Körperflüssigkeiten.

Seit dem pandemischen Auftreten der Krankheiten AIDS (acquired immune deficiency syndrome) und ATL (adult T- cell-leukaemia) besteht der dringende Wunsch ein Diagnostikum zu entwickeln, das onkognene RNA-Viren entweder im intakten Zustand oder als Teile besonders in Körperflüssigkeiten direkt erkennt. Diese Viren stellen wahrscheinlich die ätiologischen Agenzien dieser Krankheiten dar (Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F., Nugeyre, M.T., Chamaret, S., Gruest, J., Dauguet, C., Axler-Blin, C., Vezinet-Brun, F., Rouzioux, C., Rozenbaum, W., Montagnier, L.; Sience, 220: 868, 1983; Poiesz, B.J., Ruscetti, F.W., Gazdar, A.F., Bunn, P.A., Minna, J.D., Gallo, R.C.; Proc. Natl. Acad. Science USA, 77: 7415, 1980).

Mannose-spezifische Lektine sind Proteine, die hochspezifisch Mannose oder Mannoseproteinkomplexe erkennen. Sie sind geeignet zum spezifischen Nachweis von Zucker oder Zucker-Proteinkomplexen.

MANNOSE-SPEZIFISCHE LEKTINE, GEEIGNET ZUM EINSATZ FÜR DIAGNOSTISCHE VERFAHREN

Folgende Verfahren sind grundsätzlich anwendbar zum Nachweis von onkogenen RNA-Viren, speziell von HIV-1 und HTLV:

• 1. Der direkten Nachweis durch elektronenmikroskopische Darstellung;
• 2. Sichtbarmachung durch Immunfluoreszenz mittels spezi­ fischer Antikörper;
• 3. Nachweis der Bestandteile des Virus mittels Gensonden und Hybridisierung;
• 4. Anzüchtung der Viren in einer Zellkultur; sowie
• 5. Den "Antigen-Capture Assay" (ACA).

Bisher wurde nur ein Prinzip für einen "Antigen-Capture Assay" (ACA) beschrieben, der auf folgendem allgemeinen Prinzip beruht: Ein Antikörper, der das Virus oder einen Bestandteil des Virus erkennt, wird auf eine feste Phase, z. B. Plastik oder Glas fixiert. Anschließend wird menschliches Material, bevorzugt Serum oder Plasma mit dem fixierten Antikörper zusammengebracht. Nach ausreichender Inkubation wird der Komplex, der aus dem immobilisierten Antikörper und dem Virus (oder Bestandteile davon) besteht durch markierte virus­ spezifische Antikörper sichtbar gemacht.

Die bisherigen Verfahren, die oben in den Punkten 1-5 zusammengefaßt sind, sind häufig nicht präzise (Hartmann, M., Kühn, J., Näher, H., Doerr, H.W., Braun, R.; AIDS Forschung, 2: 447, 1987) und sind z. T. Zeit- und kostenaufwendig (bes. bei 1, 3 und 4).

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Mannose­ spezifische Lektine dazu geeignet sind, das Virus oder dessen Bestandteile empfindlich zu erkennen. Deshalb eignen sie sich zur Anwendung als Diagnostikum für onkogene RNA-Viren, wie HIV und HTLV.

Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommende Substanzgruppe (Lektine) werden vorzugsweise auf Kunststoffstreifen, Glaskugeln oder Plastik immobilisiert. Anschließend wird das immobilisierte Lektin mit definierten Volumina menschlichem Materials, bevorzugt Serum oder Medium, für eine ausreichende Zeit inkubiert. Nach erfolgter Waschung mittels einer pH-neutralen Lösung wird dann der Lektin- Virus (Virusteile)-Komplex z. B. durch Antikörper, die gegen das Virus (Virusteile) gerichtet sind einmal über das bekannte Verfahren "sandwich enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA)" (Walker, J.M.: Methods in Molecular Biology; Band 1, Humana Press, Clifton; 1984), quantifiziert.

Zum anderen können die Lektine u. a. auch direkt markiert werden. Folgende Markierungsverfahren können u. a. angewandt werden: Markierung mit radioaktivem Jod 125, mit Floreszein-Isothiozyanat, oder mit Enzymen z. B. Peroxidase (Nowotny, A.: Basic Exercises in Immunochemistry, Springer-Verlag, Berlin; 1979). Als Quantifizierungsmethode eignen sich bei diesen Nachweismethoden die üblichen Verfahren wie die Radioaktivitäsbestimmung (im Falle radiokativ-markierter Antikörper), die Bestimmung mittels eines Fluoreszensphotometers (bei Fluoreszein-Isothiozyanat­ markierten Antikörpern) oder die Enzymak­ tivitätsbestimmung mit den spezifischen Substraten (wie im obigen Falle das Wasserstoffperoxid).

Die erzielte Empfindlichkeit des neuen diagnostischen Verfahrens ist hoch. Es ist ein weiterer Vorteil, daß das erfindungsgemäße Ausgangsmaterial - Klasse der Lektine - billig ist.

BEISPIEL: Identifizierung des Lektins aus der Pflanze Narcissus pseudonarcissus als Diagnostikum

Das Lektin aus der Pflanze Narcissus pseudonarcissus kann z. B. nach dem beschriebenen Verfahren isoliert und gereinigt werden (Van Damme, E.J.M., Allen, A.K., Peumans, W.J.; Physioligia Plantarum, 73: 52, 1988 ). Dieses Lektin erkennt spezifisch D-Mannose (gleiche Literaturstelle).

Der Nachweis als Diagnostikum wurde z. B. in dem bekannten Ouchterlony-Test/doppelter Geldiffusion-Test (Ochterlony, O.; Acta Pathol. Microbiol. Scand., 26: 507, 1949) geführt werden. Hierzu wird 1%iger Agar-Agar in physiologischer Kochsalzlösung hergestellt und nach dem bekannten Verfahren in Glasschalen gegossen und darin erstarren lassen. Anschließend werden im Abstand von 7 mm Löcher mit einem Durchmesser von je 3 mm ausgestanzt. In ein ausgestanztes Loch werden 20 µl von Lektin (2 µg/ml) und in das angrenzende Loch 20 µl virales Protein (2 µg/ml) gegeben. Als virales Protein wurde das HIV-1 Glykoprotein (gp120) ausgewählt. Das gp120 wurde nach dem publizierten Verfahren isoliert (Matthews, T.J., Weinhold, K.J., Lyerly, H.K., Langlois, A.J., Wigzell, H., Bolognesi, D.P.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 5424, 1987). In einer feuchten Kammer wurde der Ansatz für 2 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach war eine klare Präzipitations-Linie erkennbar. Die Bildung einer solchen Präzipitation ist ein sicheres Zeichen für eine abgelaufene, spezifische Erkennungsreaktion.

BEISPIEL: Anwendung des Lektins aus Narcissus pseudonarcissus für ein diagnostisches Verfahren

Grundlage der Erfindung ist der o. g. Befund, daß onkogene RNA-Viren oder deren Bestandteile mit Lektinen im doppelten Gel-Diffusionstest spezifisch reagieren. An dem folgenden Beispiel, einem ACA, wird gezeigt, daß das Narcissus-Lektin für diagnostische Verfahren eingesetzt werden kann.

Die Löcher von Mikrotiterplatten aus Polystyrol (mit 96 Löchern und mit flachem Boden) werden beschickt mit 100 µl einer Narcissus-Lektin-Lösung (gelöst in einer Konzentration von 20 µg/ml in physiologischer Kochsalzlösung). Anschließend werden die Platten für 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Löcher mit einer 0,5%igen wäßrigen Tween 80 (= Polyoxyethylensorbitan - Monooleat)-Lösung (die weiterhin enthält: 0,1 M NaCl und 0,02 M Tris(hydroxymethyl) aminomethan, pH 7,4; Tween 80 wurde bezogen von Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA) ausreichend gewaschen um nichtgebundenes Lektin zu entfernen. Anschließend werden die Löcher mit 100 µl der zu testenden Lösung (siehe unten: Serum eines AIDS- Patienten, bzw. einer Lösung mit dem HIV-1 Protein gp120) beschickt. Nach Inkubation von 8 Stunden bei Raumtemperatur wird ausreichend (3×5 Minuten) mit oben genannter Tween 80-Lösung gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Anschließend wird in die Löcher 100 µl des polyklonalen Antikörpers gegen das HIV-1- spezifische pg120 (gezogen im Kaninchen; bezogen durch die Fa. Biochrome, Berlin) gegeben. Dieser Antikörper wurde nach den eingeführten Verfahren biotinyliert; bevorzugt wurde mit einer Konzentration von 10 ng/ml des Antikörpers gearbeitet. Nach durchgeführter Inkubation von 60 Minuten bei Zimmertemperatur werden dieLöcher wieder mit oben genannter Tweenlösung gewaschen (3×5 Minuten) und mit 100 l einer 1 : 500 verdünnten Avidin- Peroxidase-Lösung (bezogen von Fa. Sigma; siehe oben) 60 Minuten lang inkubiert (Raumtemperatur). Danach werden die Löcher wieder mit Tweenlösung (3×5 Minuten) gewaschen und mit 100 µl des Peroxidase-Substrates beschickt. Dieses setzt sich aus 0,03%iger wäßriger Hydrogenperoxid-Lösung und äthanolischer 8 mM 4-Chloro-1- naphthol-Lösung (Mischungsverhältnis: 1 : 1) zusammen. Nach erfolgter Inkubation (1 Stunde bei Raumtemperatur) wird die Extinktion in einem Photometer bei einer Wellenlänge von 414 nm bestimmt.

In nachfolgender Tabelle sind die Ergebnisse eines typischen Experimentes zusammengefaßt.

Tabelle

Die Extinktionen wurden gegen Leerwerte (Kontrollserum einer gesunden Person bzw. humanes Serumalbumin) gleicher Konzentration gemessen.

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß in dem beschriebenen ACA-Verfahren das HIV-1-Virus, bzw. eines seiner Antigene, das gp120, empfindlich nachgewiesen werden kann.

Claims (7)

1. Diagnostikum von onkogenen RNA-Viren oder deren Bestandteilen, insbesondere von menschlichen RNA- Viren (human immunodeficiency virus (HIV) und human T-lymphotropic virus (HTLV)) oder deren Bestandteile, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mannose-spezifisches Lektin enthält.

2. Diagnostikum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lektin das Lektin aus Narcissus pseudonarcissus eingesetzt wird.

3. Diagnostisches Verfahren, bei dem ein Lektin nach Anspruch 1 und 2 verwandt wird und das zu einem "Antigen-Capture Assay" eingesetzt wird.

4. Diagnostische Verfahren zum Nachweis onkogener RNA- Viren oder deren Bestandteilen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Diagnostikum gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 verwendet wird.

5. Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Lektin das Lektin aus Narcissus pseudonarcissus eingesetzt wird.

6. Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Untersuchung von Körperflüssigkeiten benutzt wird.

7. Test-Kit zum Nachweis von onkogenen RNA-Viren oder deren Bestandteilen, bestehend aus einem Lektin das z. B. an eine feste Phase gebunden ist.