DE3935580C2

DE3935580C2 - Verwendung eines pharmazeutischen Wirkstoffes zur Behandlung von HIV-Infektionen

Info

Publication number: DE3935580C2
Application number: DE19893935580
Authority: DE
Inventors: Eberhard Prof Dr Med Wecker; Anneliese Prof Dr Phil Schiml; Rabbe Dr Med Nordstroem
Original assignee: MedMark Pharma GmbH
Current assignee: MedMark Pharma GmbH
Priority date: 1989-10-25
Filing date: 1989-10-25
Publication date: 1998-05-28
Anticipated expiration: 2009-10-26
Also published as: DE3935580A1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer pharmazeutisch wirksamen Verbindung zur Behandlung von HIV-Infektionen und die Verwendung dieser Verbindung zur Verhinderung von HIV-Infek tionen in vitro.

Es ist bekannt, daß synthetische Lysolecithin-Verbindungen eine biologische Wirkung aufweisen. So ist es z. B. aus der DE-OS 20 09 342 und der DE-OS 20 09 343 bekannt, daß solche synthetischen Stoffe zur Steigerung der Resistenz und auch als immunologisches Adjuvans verwendet werden können. Deswei teren ist es aus der DE-OS 26 19 683 bekannt, daß solche Verbindungen auch als Antitumormittel wirksam sind. Schließ lich ist in der DE-OS 25 30 767 beschrieben, daß solche Lyso lecithinanaloga eine Wirksamkeit bei der Behandlung von Multipler Sklerose zeigen, einer Erkrankung, bei der die Myelin-Scheidezellen der Nervenleitungen zerstört werden. Schließlich ist es auch bekannt, daß es nach der Applikation von Lysophosphatiden zur Bildung von aktivierten Zellen kommt, die die Resistenz des Körpers steigern.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß ein besonderes Lysolecithin-Analogont nämlich das 1-Octadecyl-2-methyl-gly cero-3-phosphocholin, welches im folgenden als ET-18-OCH₃ bezeichnet wird, den Verlauf einer HIV-Erkrankung günstig beeinflußt.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung von ET-18-OCH₃ zur Behandlung von HIV-Infekti onen. Es hat sich nämlich gezeigt, daß bei HIV-infizierten Per sonen die Anzahl der mit diesem Virus befallenen Zellen, insbesondere der T-Zellen, abnimmt, wenn diese Personen mit ET-18-OCH₃ behandelt wurden.

Bei der Behandlung hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Patienten mit einer Dosis behandelt werden, die einen Blutspiegel von 2 bis 16 µg/ml, insbesondere von 4 bis 8 µg/ml ergibt. Das Lysophosphatid wird vorzugsweise iV appliziert. Dabei hat es sich gezeigt, daß bei Gaben bis zu 900 mg ET-18-OCH₃ keine Nebenwirkungen auftre ten. Die Herstellung der erfindungsgemäß zu verwendenden Substanz von 1-Octadecyl-2-methyl-glycero-3-phosphocho lin ist bekannt und z. B. in D. Arnold et al., Liebigs Ann. Chem. 709, 234-239 (1967); H.U. Weltzien und O. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709, 240-243 (1967); und H. Eibl und O. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709, 244-247 (1967) beschrieben.

An in vitro Versuchen konnte gezeigt werden, daß ET-18- OCH₃ während einer zweistündigen Vorinkubation bei Raumtemperatur die Infektiösität von HIV1 nicht verän dert.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, eine HIV-In fektion in vitro zu verhindern. Dies ist insbesondere dann von großem Vorteil, wenn die Gefahr besteht, daß isolierte Blutbestandteile, wie z. B. Blutkonserven, mit HIV-Viren infiziert werden können. HIV-Infektionen in vitro sind z. B. auch in Kulturen von T-Lymphozyten un erwünscht.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von ET-18-OCH₃ zur Verhinderung von HIV-Infektionen in vitro, insbesondere in Blutkonserven und in Kulturen von T-Lymphozy ten.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung werden die großen teilungsaktiven Zellen in ihrer Anzahl kaum beeinträchtigt, jedoch nimmt die Zahl der HIV-infizierten P24-positiven Zellen deutlich ab. Erfindungsgemäß läßt sich somit die HIV-Vermehrung spezifisch beeinflussen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispielenäher erläu tert.

Beispiele 1. Herstellung der ET-18-OCH₃-Vorratslösung

20 mg ET-18-OCH₃ wurden in 20 ml Medium gelöst, wobei zu nächst eine trübe Emulsion entsteht, die durch kurzzeitiges Erhitzen (15 Sekunden) im Mikrowellenherd in eine klare Lö sung überführt wird.

2. Infektion von Lymphozyten mit HIV und anschließender Kul tivierung der Zellen in ET-18-OCH₃-haltigem Medium

Die Lymphozyten wurden aus dem Lymphozytenfilm eines HIV- negativen Spenders isoliert, wobei die CD8⁺-Zellen mittels dynabeads (Fa. Dynal, Norwegen) entfernt wurden, die mit monoklonalen Antikörpern gegen menschliches CD8 gekoppelt waren. Die restlichen CD8⁻-Zellen wurden 2 Tage lang mit PHA (Phytohämaglutinin) (2 µg/ml) in Abwesenheit von rekombinan tem Interleukin-2 (40 µg/ml) stimuliert. Nach 48 Stunden wurde das PHA dreimal mit PBS (phosphate buffered saline) entfernt und jeweils 1 × 10⁶ Zellen wurden mit einer 0,1 mit HIV-1 (HTLV-III B) infiziert. Anschließend wurden die infi zierten Zellen in einem ET-18-OCH₃-haltigen Medium in unter schiedlicher Konzentration unter weiterer Anwesenheit von Interleukin-2 kultiviert. 4 Tage nach Infektion wurden die Zellen aus der Kultur genommen und wie folgt gefärbt:
Die Fixierung der Zellen erfolgte mit 3,5% Formaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur, worauf die Zellen einmal mit PBS gewaschen und anschließend mit 0,25% Triton X-100 für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Nach weiterem zweimaligem Waschen mit PBS folgte eine Inkubation in 10%igem hitzeinaktiviertem Ziegenserum für 30 Minuten bei Raum temperatur, gefolgt von zweimaligem Waschen mit PBS und Inku bieren der Zellen mit einer 1 : 25 Verdünnung eines monoklona len Maus-Anti-P24 (HIV) Antikörpers (Dianova) für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der Inkubationszeit wur den die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und dann mit einer 1 : 50 Verdünnung eines FTC-konjugierten monoklonalen Ziege- Anti-Maus-Antikörpers (ZYMED) für eine Stunde bei Raumtempe ratur inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt wurden die Zellen im FAC-SCAN (Becton-Dickinson, USA) analysiert.

3. Vorinkubation von HIV mit ET-18-OCH₃, Infektion von Lym phozyten mit diesen vorbehandelten Viruspräparaten und an schließender Kultivierung der Zellen in ET-18-OCH₃ freiem Medium

Die Lymphozyten wurden, wie in Beispiel 2 beschrieben, iso liert und angefärbt. Im Gegensatz zu Beispiel 2 wurde HIV jedoch mit ET-18-OCH₃ unterschiedlicher Konzentration von 2 bis 16 µg/ml für zwei Stunden bei Raumtemperatur vorinku biert. Nach Beendigung der Vorinkubation wurden die Zellen mit den so vorbehandelten HIV-Präparaten infiziert und in ET- 18-OCH₃-freiem Medium für weitere 4 Tage kultiviert.

4. Kultivierung von nicht infizierten Lymphozyten in ET-18-OCH₃-haltigem Medium unterschiedlicher Konzentration und Wirkung einer Vorbehandlung mit ET-18-OCH₃

a) Der Versuchsablauf entspricht dem Beispiel 2, jedoch mit dem Unterschied, daß die Lymphozyten nicht mit HIV infi ziert waren. Sie waren unmittelbar nach dem Herauswa schen des PHA in ET-18-OCH₃-haltigem Medium kultiviert worden.
Kulturen von HIV-infizierten und nicht-infizierten peri pheren CD4⁺ T-Lymphozyten des Menschen wurden auf die Anzahl P24-positiver Zellen im FAC-SCAN getestet. Dabei wurde ein Basiswert von 4,2% bei den nicht-infizierten Kulturen und ein Wert von 21,3% bei den infizierten Kulturen gefunden (Fig. 1). Die schraffierten Bereiche zeigen die deutlich positiven Populationsanteile an.
b) Anschließend wurde ein HIV1-Präparat für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit unterschiedlichen Konzentrationen mit ET-18-OCH₃ vorinkubiert. Mit den verschiedenen Pro ben wurden dann periphere CD4-positive T-Zellkulturen des Menschen infiziert und nach 4 Tagen die Zahl der P24 T-Zellen bestimmt. Dabei hat sich gezeigt, daß eine Vorbehandlung von freiem HIV1 mit ET-18-OCH₃ selbst bei hohen Kon zentrationen keinerlei Einfluß auf die Infek tiösität der Viren hatte (Fig. 2).
c) In weiteren Versuchen wurden dann HIV-infizierte Kulturen von peripherem CD4⁺ T-Lymphozyten mit un terschiedlichen Konzentrationen von ET-18-OCH₃ für 4 Tage inkubiert. Im FAC-SCAN wurde dann der je weilige Anteil der P 24 positiven Zellen und der jeweilige Anteil an großen, also teilungsaktiven Zellen ermittelt. Dabei hat sich gezeigt, daß 1 µg/ml ET-18-OCH₃ die Zahl der P 24-positiven Zellen nicht beeinflußt (Fig. 3 im Vergleich mit Fig. 1 und 2). Bei Konzentrationen von 2 und 4 µg/ml verringert sich der Anteil der P 24-posi tiven Zellen zunehmend. Ab 8 µg/ml ET-18 bleiben praktisch nur noch die unspezifischen Basiswerte übrig. Es wurde auch gefunden, daß ET-18-OCH₃ in ähnlicher Weise auch die Zahl der teilungsaktiven großen Zellen verringert (Fig. 3A längs schraf fiert), während die kleinen, ruhenden Zellen bis 8 µg/ml nicht betroffen sind. Bei 16 µg/ml findet jedoch auch eine teilweise Zerstörung der ruhenden Zellen statt, wie durch das Auftreten von toten Zellen und Zelltrümmern ersichtlich ist (quer schraffiert).

Um zu überprüfen, ob die deutliche Wirkung von ET-18-OCH₃ auf große, teilungsaktive Lymphozyten von deren Infektion mit HIV abhängt, wurden Kontrollversuche mit nicht-infizierten Kulturen unter sonst gleichen Bedin gungen durchgeführt. Dabei wurde, wie in Fig. 4 darge stellt gefunden, daß fast vollkommen analog zu Fig. 3, die Population großer Lymphozyten bei einer ET-18-CH₃- Konzentration ab 8 µg/ml verschwindet und daß bei 16 µg/ml ebenfalls eine ausgeprägte Zerstörung der ru henden Zellen auftritt.

Es wurde auch gefunden, daß ET-18-OCH₃ bei Konzentra tionen von 8 µg/ml eine weitgehend selektive Zerstörung von großen, teilungsaktiven Lymphozyten bewirkt, während ruhende Zellen erst bei höheren Konzentrationen ab 16 µg/ml geschädigt werden. Dies ist unabhängig von der Infektion mit HIV.

Claims

1. Verwendung von ET-18-OOH₃ zur Behandlung von HIV-Infektio nen.

2. Verwendung von ET-18-OCH₃ zur Verhinderung von HIV-Infek tionen in vitro.