DE3926881C2 - Spektralphotometer zur Messung schneller zeitlicher Veränderungen von Absorptions-Differenzspektren - Google Patents

Spektralphotometer zur Messung schneller zeitlicher Veränderungen von Absorptions-Differenzspektren

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Spektralphotometer zur Messung schneller zeitlicher Veränderungen von Absorptions-Differenzspektren mit ausreichender Auflösung und Selektivität zur Trennung der sich überlagernden Cytochrom- Absorptionsänderungen in grünen Blättern und isolierten Organellen.
Eine derartige Einrichtung ist als "Optical Multichannel Analyser" (OMA) im Prinzip bekannt. Bei dieser bekannten Einrichtung wird das Untersuchungsobjekt mit polychroma­ tischem Licht durchstrahlt und das transmittierte Licht mit Hilfe eines Gitters (bzw. Prismas) zunächst in seine spek­ tralen Anteile zerlegt, bevor diese dann von einer Vielzahl räumlich getrennter Photodioden (Dioden-Array) erfaßt und zu separaten Meßsignalen verarbeitet werden, aus welchen Absorptions- und Differenzspektren abgeleitet werden können. Diese bekannte Einrichtung ist jedoch nicht zur Untersuchung besonders lichtempfindlicher und stark streuender biologischer Untersuchungsobjekte geeignet. Da alle interessierenden Wellenlängen gleichzeitig eingestrahlt werden, ist die Meßlichtintensität hoch. Durch Streuung des Meßlichts am Objekt wird eine parallele Strahlenführung zwischen Objekt, Gitter und Photodetektor verhindert, so daß eine effiziente Abbildung des Meßlicht-Spektrums auf dem Dioden-Array nicht möglich ist.
In der photobiologischen Forschung sind Blitzlicht- Relaxationsspektralphotometer bekannt, welche mit einem starken Entladungsblitz eine photochemische Veränderung im Untersuchungsobjekt herbeiführen und dann mit einem schwäch­ eren monochromatischen Meßblitz bei variablen Verzöger­ ungszeiten die Kinetik der spektralen Veränderungen ab­ tasten. Um mit derartigen Meßeinrichtungen Differenzspektren und deren zeitliche Veränderungen zu erfassen, muß eine Vielzahl von Einzelmessungen mit entsprechendem Zeitaufwand durchgeführt werden. ln der Praxis kommt es jedoch oft zu zeitabhängigen Veränderungen des biologischen Untersuchungs­ materials, wodurch ein direkter Vergleich der zu verschie­ denen Zeitpunkten gemessenen Einzelwellenlängen-Änderungen nicht möglich ist.
Andere bekannte spektralphotometrische Einrichtungen, welche sich zwar grundsätzlich nicht zur Messung von Cytochrom- Absorptionsänderungen eignen, weisen einzelne Elemente auf, die dem allgemeinen Stand der Technik entsprechend, für das Konzept eines Simultan-Spektralphotometers von Bedeutung sind. So wird in der DE 34 18 839 A1 ein Kolorimeter zur Bestimmung der Konzentration von in Flüssigkeiten gelösten Stoffen beschrieben, bei welchem verschiedenfarbige licht-emittierende Dioden (bzw. eine Miniatur- Gasentladungslampe) als gepulste Meßlichtquellen und eine verzweigte Fiberoptik zur effizienten Übertragung des Meßlichtes auf die zu untersuchende Probe dienen. Diese bekannte Einrichtung ist aber nicht in der Lage, Simultanmessungen bei den verschiedenen Wellenlängen durchzuführen und es besteht keine Möglichkeit zur Registrierung von Spektren oder Differenzspektren und deren Zeitabhängigkeit.
In der DE-OS 20 49 716 wird ein Oximeter zur in vivo Bestimmung der Oxihämoglobin-Konzentration im Blute beschrieben, bei welchem mehrere, verschiedenfarbige lichtemittierende Dioden im zyklischen, zeitgeteilten Folgebetrieb als Meßlichtquellen eingesetzt werden, wobei eine einzige Detektorvorrichtung in Verbindung mit einem synchronen Demodulationsverfahren verwandt wird. Aufgrund der zeitgeteilten Einstrahlung verschiedener Wellenlängenbereiche und der Verwendung eines mischenden Strahlungs- Diffusors bzw. von verzweigter Fiberoptik zwischen Meßlicht-Quellen und Objekt, können mit dieser bekannten Einrichtung praktisch simultan die Konzentrationen mehrerer Substanzen im lebenden Objekt gemessen werden. Eine wesentliche Voraussetzung für das Funktionsprinzip dieser Einrichtung ist jedoch, daß der Beitrag der verschiedenen Substanzen zur Gesamtabsorption in einem bestimmten Wellenlängenbereich bei bestimmten Konzentrationsverhältnissen bekannt ist. Diese Voraussetzung mag für Oxihämoglobin und Hämoglobin gegeben sein, trifft aber nicht für die Vielzahl der verschiedenen Cytochrome und anderer Komponenten im Chloroplasten zu, deren Beiträge und Eigenschaften noch Gegenstand der Forschung sind. So können mit der bekannten Einrichtung nach DE-OS 20 49 716 keine Spektren oder Differenzspektren und deren zeitliche Veränderungen gemessen werden, welche für derartige Untersuchungen essentiell sind.
Zum Stand der Technik gehört die Anwendung von Fiberoptiken bei Spektralphotometern (US-Z Applied Optics 10, 1971, S. 1141), die Verwendung von Mischstrecken zur Homogenisierung verschiedener Lichtqualitäten durch reflektierende Rohre und dgl. (DE-AS 12 24 528), der Einsatz von licht-konzentrierenden Elementen, wie sie z. B. in LED-Zeiten auftreten (DE 84 00 710 U1), sowie die Anwendung von Steuerschaltungen zum strom-geregelten Impulsbetrieb mehrerer licht-emittierender Dioden (DE 25 12 561 A1). Mit der Schaltung der letztgenannten Veröfffentlichung ist es jedoch nicht möglich, eine Vielzahl von licht-emittierenden Dioden nach einem vorprogrammierten, gespeicherten Intensitätsmuster derart anzusteuern und zu regeln, daß die verschiedenen, das Objekt durchdrigenden monochromatischen Lichtanteile am Detektor gleiche Signale erzeugen, was für einen effektiven Nullabgleich und die Festlegung der Basislinie zur Erfassung von Spektren und Differenzspektren bei kleinen Absorptionsänderungen unerläßlich ist.
Bei der Untersuchung von spektralen Veränderungen an besonders lichtempfindlichen und zeitlich veränderlichen biologischen Organellen muß gewährleistet sein, daß einerseits die Meßlichtintensität nicht so hoch ist, daß sie eine Veränderung des Objekts bedingt und daß andererseits die gesamte relevante spektrale Information möglichst gleichzeitig erfaßt wird. Dabei wird oft gefordert, daß noch Absorptionsänderungen in der Größenordnung von 10-4 Absorptions-Einheiten bei Millisekunden-Zeitauflösung erfaßt werden. Ein Beispiel aus der Photosynthese-Forschung ist die Erfassung von blitzinduzierten Redoxveränderungen der Cytochrome in isolierten Chloroplasten durch Messung von Absorptionsveränderungen im grünen Spektralbereich. Dabei ist problematisch, daß der Redox-Zustand der Cytochrome in Chloroplasten schon durch relativ schwaches Licht verändert wird und daß sich die photochemischen und biochemischen Eigenschaften der Chloroplasten im Anschluß an ihre lsolierung aus Blättern verändern. Weiterhin interessieren auch die Absorptionsänderungen, die durch chemische Zusätze induziert werden, wobei sich jedoch vielfach größere, unspezifische Signaländerungen überlagern, welche durch das erforderliche Rühren der Chloroplasten-Suspension und den unvermeidlichen Verdünnungseffekt bei Lösungszugaben hervorgerufen werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Spektralphotometer zu schaffen, das genügend schwaches Meßlicht verwendet, welches selbst lichtempfindliche Untersuchungsobjekte nicht verändert und das trotzdem in der Lage ist, mit hoher Empfindlichkeit praktisch gleichzeitig bei einer Vielzahl von Wellenlängen die Absorptionsänderungen stark streuender Untersuchungs­ objekte zu erfassen, wobei zusätzlich gefordert wird, daß wellenlängen-unspezifische Signalstörungen effektiv eliminiert werden.
Bei Anwendung extrem kurzer, monochromatischer Meßlicht­ pulse welche in schneller Folge hintereinander periodisch das Objekt durchstrahlen, wird gewährleistet, daß zu jedem Zeitpunkt die effektive Meßlichtintensität niedrig ist und dennoch im zeitlichen Mittel das Untersuchungsobjekt von polychromatischem Licht durchstrahlt wird. Auf diese Weise liegt praktisch gleichzeitig spektrale lnformation bei einer Vielzahl von Wellenlängen vor, welche mit Hilfe synchron angesteuerter, zeitlich selektiver Verstärker getrennt und zu zeitaufgelösten Differenzspektren verarbeitet werden kön­ nen.
Dadurch daß die Trennung der Signale bei den einzelnen Wellenlängen auf elektronischem Wege erfolgt, ist eine spektrale Zerlegung des das Untersuchungsobjekt durchdring­ enden Meßlichtes auf optischem Wege mittels Gitter oder Prisma nicht erforderlich, so daß der Photodetektor dicht hinter dem Objekt angebracht und damit auch ein Großteil des gestreuten Meßlichtes erfaßt werden kann. Auf diese Weise wird selbst bei schwachem Meßlicht ein gutes Signal/Rausch- Verhältnis gewährleistet. Aufgrund der schnellen zeitlichen Folge der verschiedenen Wellenlängen betreffen die wellen­ längen-unspezifischen, langsameren Änderungen des transmit­ tierten Lichtes, wie sie z.B. durch Rühren hervorgerufen werden, alle Wellenlängen gleichermaßen, so daß solche Änderungen sich mittels Differenzbildung mit einem Referenz­ meßsignal eliminieren lassen.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen geschildert.
Die Verwendung von licht-emittierenden Dioden als Impuls- Lampen gemäß Anspruch 2 ist vorteilhaft wegen deren träg­ heitslosen Ansteuerbarkeit, hohen Leuchtdichte, geringen Größe, günstigen spektralen Eigenschaften, guten Stabilität und Regelbarkeit.
Gemäß Anspruch 3 Blitzentladungslampen als Impuls-Lampen zu verwenden bietet sich vor allem für Messungen im blauen und ultravioletten Spektralbereich an, wofür noch keine geeigneten licht-emittierenden Dioden verfügbar sind.
Durch die Verwendung von konisch zusammenlaufenden Glas­ faser-Leitstäben gemäß Anspruch 4 wird eine kompakte und effiziente Ankopplung der Fiberoptik an die einzelnen lmpuls-Lampen erreicht.
Nachfolgend wird anhand der Zeichnungen eine Ausführungs­ form des erfindungsgemäßen kinetischen Spektralphotometers auf lmpulsbasis beschrieben. In den Zeichnungen zeigt
Abb. 1 ein Funktions-Blockschema des kinetischen Spektralphotometers auf lmpulsbasis,
Abb. 2 ein Diagramm, das für eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Spektralphotometers mit LED-Pulslichtquellen die zeitliche Beziehung zwischen einem einzelnen Meßlichtpuls, Meßsignal und Steuersignalen zeigt.
Abb. 3 ein Funktions-Blockschema einer Ausführungs­ form des kinetischen Spektralphotometers auf Impulsbasis, bei welcher als Impuls-Lampen licht-emittierende Dioden verwendet werden und bei welcher über verzweigte Fiberoptik eine lntegration mit anderen Lichtquellen und optischen Meßeinrichtungen verwirklicht ist.
Abb. 4 ein Meßbeispiel einer chemisch induzierten Absorptions-Änderung einer gerührten Suspension isolierter Chloroplasten.
Das in Abb. 1 in einem Funktions-Blockschema darge­ stellte Spektralphotometer besteht aus einer polychroma­ tischen Meßlichtquelle PMQ, einer Detektor-Einheit DE, einer Vorrichtung zur Trennung und Speicherung VTS und einer Steuer- und Signalverarbeitungseinheit SSVE. Die polychroma­ tische Meßlichtquelle setzt sich zusammen aus einer Vielzahl von separaten Treibern Ti, Lichtquellen Li und Interferenz­ filtern Ii, mit deren Hilfe in schneller Folge monochroma­ tische Meßlichtpulse MLi erzeugt werden, welche über sepa­ rate Fokussiereinrichtungen Fi und Lichtleiterbündel LLi zusammengeführt und über eine gemeinsame Mischstrecke 1 statistisch vermischt werden, so daß am Ausgang im zeit­ lichen Mittel polychromatisches Meßlicht 2 gegeben ist, dessen spektrale und zeitliche Feinstruktur genau definiert ist. Das polychromatische Meßlicht 2 tritt in optische Wechselwirkung mit dem Untersuchungsobjekt 3 und der trans­ mittierte Teil dieses Lichtes wird von der Detektor-Einheit DE empfangen. Ein optisches Filter 4 vor dem Photodetektor 5 läßt das spektrale Band des gewählten Meßlichtbereiches passieren. Der Photodetektor 5 hat eine ausreichend hohe zeitliche Auflösung um die den einzelnen Meßlichtpulsen MLi entsprechenden Transmissionssignale zu trennen. Die resul­ tierenden elektrischen Impulssignale Si werden in einem AC- Vorverstärker 6 mit Hochpaßeigenschaften verarbeitet, wobei um Null symmetrische AC-Impulssignalsequenz SSi erzeugt werden, welche an die Vorrichtung zur Trennung und Speicherung VTS weitergeleitet und dort unter der Kontrolle der Steuer- und Signalverarbeitungseinheit SSVE weiter verarbeitet werden.
In der Vorrichtung zur Trennung und Speicherung VTS erfolgt zunächst mittels eines Synchrongleichrichters (7) die Gleichrichtung der AC-Impulssignale SSi, wobei die Invertier-Phasen über Invertiersignale ISi gesteuert werden, welche durch die Steuer- und Signalverarbeitungseinheit SSVE bestimmt sind. Sodann wird das gleichgerichtete Signal auf null kompensiert, ebenfalls unter der Kontrolle der Steuer- und Signalverarbeitungseinheit SSVE, mittels eines DC- Kompensationssignals KS. Schließlich dienen eine Vielzahl von Abtast-Haltegliedern AH1 . . . AHn dazu, die den einzelnen monochromatischen Meßlichtpulsen MLi zugeordneten, gleichgerichteten und kompensierten Meßsignale GKi zwischenzuspeichern, wobei die Zuordnung unter der Kontrolle von Ausschnittssignalen AS aus der Steuer- und Signalverarbeitungseinheit SSVE erfolgt. Damit liegen nun der Vielzahl der monochromatischen Meßlichtpulse ML1 . . . MLn entsprechende, beständige Meßsignale MS1 . . . MSn vor, welche nacheinander mit Hilfe eines Analogmultiplexers 9 abgerufen werden und in Form von analog-gemultiplexten Signalen AMSi einen Analog-Digital Wandler 16 in der Steuer- und Signalverarbeitungseinheit SSVE zugeführt werden. Die resultierenden digitalen Meßsignale DMSi werden von einem Mikrocomputer 17 übernommen, gespeichert, weiterverarbeitet und dargestellt.
Der Mikrocomputer 17 erfüllt neben der Signalspeicherung und Verarbeitung die zentrale Aufgabe der koordinierten Steuerung der Funktionen der polychromatischen Lichtquelle PMQ und der Vorrichtung zur Trennung und Speicherung VTS:
  • - Zur Steuerung der polychromatischen Lichtquelle PMQ lädt der Mikrocomputer ein Intensitätswertmuster IW1 . . . IWn in einen ersten digitalen RAM-Speicherbaustein 14. Ein einzelner Intensitätswert IWi wird über einen Digital- Analogwandler 15 in ein entsprechendes analoges Intensitätssignal ISi überführt, welches dann mittels des zugehörigen Treibers Ti die geforderte Leistung der Impulslampe Li bestimmt. Die zeitlich synchronisierte Selektion eines einzelnen Intensitätwertes IWi aus der Vielzahl der möglichen Intensitätswerte IW1 . . . IWn erfolgt mit Hilfe eines Binärcodemusters BC1 . . . BCn welches ein Mikrocomputer 17 festgelegt und in einem zweiten digitalen RAM-Speicherbaustein 11 unter der Adresse Ai gespeichert wird. Ein ebenfalls vom Mikrocomputer 17 erzeugtes Taktsignal TS steuert einen Zähler 10 an, der zu dem Zeitpunkt die Adresse Ai im Speicherbaustein 11 ansteuert, und damit den Binärcode BCi freigibt, an welchem der Intensitätswert IWi gefordert ist. Ein einzelner Binärcode BCi enthält die digitale Information zur synchronisierten Ansteuerung der monochromatischen Pulslichtquelle PMQ, der Detektoreinheit DE und der Vorrichtung zur Trennung und Speicherung VTS. Diese Code-Information gliedert sich in drei Abschnitte, einen Auswahlcode ACi, einen Freigabecode FCi und ein lnvertiersignal ISi. Der Auswahlcode ACi, als Abschnitt eines Binärcodes BCi, bedingt die Selektion des Intensitätswertes IWi aus dem Speicherbaustein 14. Der gleiche Auswahlcode bedingt die synchrone Selektion eines bestimmten Treibers Ti mittels eines Decoderbausteins 12, wobei die Freigabe des eigentlichen Treibersteuersignals TSSi zeitlich durch den Freigabecode FC kontrolliert wird.
  • - Die Steuerung der Vorrichtung zur Trennung und Speiche­ rung erfolgt ebenfalls mit Hilfe des Binärcodemusters BC1 . . . BCn, welches im Mikrocomputer 17 festgelegt und unter den Adressen A1 . . . A2 im digitalen Speicherbaustein 11 ge­ speichert wird. Der gleiche Binärcode BCi, welcher die Ansteuerung eines bestimmten Impuls-Lampen Treibers Ti kon­ trolliert, bewirkt mittels des Auswahlcodes ACi, des Frei­ gabecodes FCi und des Invertiersignals ISi die synchrone Trennung und Speicherung eines zugehörigen Meßsignals. Das Invertiersignal ISi führt zur Gleichrichtung eines AC- Impulssignals SSi im Synchrongleichrichter 7. Der Auswahlcode ACi in Verbindung mit dem Freigabecode FCi steuert einen zweiten Decoderbaustein 13 an, der ein Ausschnittssignal ASi freigibt, das zeitlich synchronisiert mit der Ansteuerung eines bestimmten Impuls-Lampen Treibers Ti das zugehörige Abtast-Halteglied AHi aktiviert, so daß dort die entsprechende Meßsignal MSi beständig gespeichert wird. Außerdem führt der Mikrocomputer 17 der Vorrichtung zur Trennung und Steuerung VTS ein Kompensationssignal KS zu, das mit Hilfe des Kompensators 8 die gleichgerichteten Impulssignale zu Beginn einer Messung auf null kompensiert. Dadurch kann die Speicherkapazität der digitalen Bauteile optimal genutzt werden.
In Abb. 2 zeigt ein Zeit-Diagramm die zeitliche Beziehung zwischen einem einzelnen Meßlichtpuls, dem Meß­ signal und verschiedenen Steuersignalen. Die Darstellung betrifft eine erfindungsgemäße Ausführungsform des kine­ tischen Spektralphotometers auf Impulsbasis bei Verwendung von lichtemittierenden Dioden (LED) als Impulslampen. Die einem einzelnen Meßlichtpuls MLi zugeordnete Gesamtzeit beträgt in dieser Ausführungsform 16 µsec, welche in 16 Teilschritte zu 1 µsec aufgeteilt sind. Während der eigentliche LED-Meßlichtpuls MLi im sec-Bereich steile Schaltflanken aufweist, ist das AC-lmpulssignal SSi in der dargestellten Weise verschliffen. Das lnvertiersignal ISi ist nur während des 2. Teils der Gesamtzeit eingeschaltet, so daß aus dem um null symmetrischen AC-Impulssignal SSi ein positives Meßsignal erzeugt wird, welches durch das Kompen­ sationssignal KS im zeitlichen Mittel auf null gebracht wird. Die Lage der Ausschnittssignale AS ist so gewählt, daß die jeweiligen Spitzenwerte im Abtast-Halteglied AHi gespeichert werden.
In Abb. 3 ist eine verwirklichte Ausführungsform des kinetischen Spektralphotometers auf Impulsbasis als Funk­ tions-Blockschema dargestellt. 16 verschiedene lichtemit­ tierende Dioden (LED) werden von 16 verschiedenen Impuls- Treibern T1 . . . T16 getrieben, unter der Kontrolle der im digitalen BAM-Speicherbaustein 11 gespeicherten Binärcodes BC1 . . . BC16. Die LEDs sind dicht an kreisrunde Interferenz­ filter I1 . . . I16 gedrückt. Das transmittierte monochroma­ tische Licht, mit einer Bandbreite von ca. 2 nm, fällt auf die Basis von 16 konisch zusammenlaufenden Glasfaser-Leit­ stäben 18 und wird am Ausgang dieser Leitstäbe auf die einzelnen Lichtleiterbündel LL1 . . . LL16 fokussiert. Die Fibern der verschiedenen Lichtleiterbündel sind statistisch vermischt. Zusätzlich sorgt ein Quarzglasstab 20 zwischen Lichtleitbündel und Untersuchungsobjekt 3 für Mischung der verschiedenen monochromatischen Meßlichtpulse. Das Unter­ suchungsobjekt 3 befindet sich in einer temperierbaren Küvette 21, in welcher über weitere Quarzglasstäbe 20 und mehrarmige Lichtleiterbündel 22 die optische Verbindung zu der Detektor-Einheit DE und wahlweise zuschaltbaren Licht­ quellen 23, 24 und weiteren Detektor-Einheiten 25, 26 gegeben ist. In der verwirklichten Ausführungsform ist die Lichtquelle 23 eine Halogenlampe zur Applizierung von konti­ nuierlichem Licht hoher Intensität, die Lichtquelle 24 ein Farbstoff-Laser, die Detektor-Einheit 25 eine Vorrichtung zur Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz und die Detektor- Einheit 26 eine Vorrichtung zur Messung von Absorptions­ änderungen von P700, dem Reaktionszentrum des photosynthe­ tischen System I. In der Detektoreinheit DE, welche das transmittierte Meßlicht empfängt, verhindert das optische Filter 4 die Transmission der von den Lichtquellen 23 und 24 erzeugten Strahlung. Bei dem Photodetektor 5 handelt es sich um eine PIN-Photodiode, welche die Meßlichtpulse mit hoher Zeitauflösung registriert. Der AC-Vorverstärker mit Hoch­ paßeigenschaften 6 befindet sich in unmittelbarer Nähe der PIN-Diode. Das resultierende, niederohmige Signal wird der Vorrichtung zur Trennung und Steuerung VTS zugeführt, welche unter der Kontrolle eines von RAM-Speicherbaustein 11 ausge­ gebenen Binärcodemusters steht. Innerhalb der Steuer- und Signalverarbeitungseinheit SSVE nimmt der Mikrocomputer 17 eine zentrale Stellung ein, indem er die vom Analog- Digitalwandler digitalisierten Meßwerte übernimmt, speichert und darstellt, sowie den gesamten Meßvorgang, einschließlich der Ansteuerung der Impulstreiber T1 . . . T16 und der Vorrichtung zur Trennung und Speicherung der Meßsignale VTS koordiniert, wobei das in den RAM-Speicherbaustein 11 über­ tragene Binärcodemuster eine wesentliche Rolle spielt.
Abb. 4 zeigt das Ergebnis einer Messung von Absorptionsänderungen im grünen Spektralbereich mit einer Ausführungsform des kinetischen Spektralphotometers auf Impulsbasis gemäß den Ansprüchen 1, 2 und 4. Dargestellt sind die Absorptionsänderungen welche durch Injektion von Adenosintriphosphat (ATP) in einer gerührten Suspension isolierter Spinatchloroplasten induziert werden. Abb. 4A zeigt eine Auswahl von 7 aus 16 Einzelkinetiken. In Abb. 4B sind die zugehörigen Absorptions- Differenzspektren für 4 verschiedene Zeitpunkte nach ATP- Zugabe dargestellt. In diesem Meßbeispiel beträgt die integrierte Meßlichtintensität 10 mW m-2. Bei wesentlich höheren Meßlichtintensitäten, wie sie z.B. bei Verwendung eines Diodenarray-Spektralphotometers gegeben wären, würde schon das Meßlicht einen Teil der Absorptionsänderungen bewirken, die im Dunkeln erst durch ATP induziert werden.

Claims (4)

1. Spektralphotometer zur Messung schneller zeitlicher Veränderungen von Absorptions-Differenzspektren mit ausreichender Auflösung und Selektivität zur Trennung der sich überlagernden Cytochrom-Absorptionsänderungen in grünen Blättern und isolierten Organellen, bestehend aus einer polychromatischen Meßlichtquelle, einer Detektor- Einheit, einer Vorrichtung zur Trennung und Speicherung der Meßsignale (VTS) und einer Steuer- und Signalverarbeitungseinheit (SSVE), wobei
  • a) die polychromatische Meßlichtquelle (PMQ) aus einer Vielzahl unabhängiger Impuls-Lampen (L1 . . . Ln) zusammengesetzt ist, aus deren Gesamtemission mit Hilfe von engbandigen Interferenzfiltern (I1 . . . In) monochromatisches Licht selektiert wird, und welche von Impuls-Treibern (T1 . . . Tn) getrieben nacheinander in schneller Folge periodisch monochromatische Meßlichtpulse (ML1 . . . MLn) im µsec-Bereich liefern, wobei die Ansteuerung der Impuls-Treiber (T1 . . . Tn) durch die Steuer- und Signalverarbeitungseinheit (SSVE) kontrolliert wird,
  • b) die Vielzahl der monochromatischen Meßlichtpulse (ML1 . . . MLn) mit Hilfe von optischen Fokussier- Einrichtungen (F1 . . . Fn) auf einzelne Lichtleiterbündel (LL1 . . . LLn) gerichtet, welche zusammengeführt und über eine gemeinsame Mischstrecke (1) statistisch vermischt sind, so daß am Ausgang dieser Mischstrecke im zeitlichen Mittel polychromatisches Meßlicht (2) erzeugt wird,
  • c) der nicht absorbierte bzw. gestreute Anteil des polychromatischen Meßlichts das Untersuchungsobjekt (3) durchdringt, und von der Detektor-Einheit (DE) empfangen wird, in welcher er nach Passieren eines optischen Filters (4) auf einen Photodetektor (5) mit hoher zeitlicher Auflösung im µsec-Bereich fällt, der ein einem monochromatischen Meßlichtpuls (MLi) entsprechendes positives Impuls-Signal (Si) erzeugt, welches in einem AC-Vorverstärker mit Hochpaßeigenschaften (6) verstärkt, geformt, und als ein um Null symmetrisches AC-Impulssignal (SSi) an die Vorrichtung zur Trennung und Speicherung (VTS) weitergegeben wird,
  • d) in der Vorrichtung zur Trennung und Speicherung (VTS) mittels eines Synchrongleichrichters (7) die durch die Steuer- und Signalverarbeitungseinrichtung (SSVE) über ein Invertiersignal (ISi) gesteuerte, periodisch synchrone Invertierung erfolgt und damit die Gleichrichtung der einzelnen Impulssignale (SSi), und wobei ferner mittels des Kompensators (8) die Addition eines von der SSVE über ein Kompensationssignal (KS) bestimmten, für einen Meßvorgang konstanten DC-Kompensationssignals, sowie mittels der Abtast-Halteglieder (AH1 . . . AHn) die Trennung und Zwischenspeicherung der gleichgerichteten und kompensierten Impulssignale (GKi) bewerkstelligt wird und die Trennung und Zwischenspeicherung unter der Kontrolle der SSVE mit Hilfe von Ausschnittssignalen (ASi) für die Abtast-Halteglieder (AH1 . . . AHn) erfolgen, und diese Ausschnittssignale mit Treibersteuersignalen (TSSi) für die Impulstreiber (T1 . . . Tn) der Impulslampen (L1 . . . Ln) synchronisiert sind, wobei an den Ausgängen der Abtast-Halteglieder (AH1 . . . AHn) die beständigen Meßsignale (MS1 . . . MSn) anstehen, die der Analogmultiplexer (9) zeitlich nacheinander in Form von analogen, gemultiplexten Signalen (AMS) der SSVE zuführt.
  • e) in der Steuer- und Signalverarbeitungseinheit (SSVE) ein Digitalzähler (10) entsprechend einem Taktsignal (TS) in zeitlicher Abfolge die digital kodierten Adressen (A1 . . . An) erzeugt, unter denen in einem ersten digitalen RAM-Speicherbaustein (11) die Binärcodes (BC1 . . . BCn) abgespeichert sind, so daß der Digitalzähler (10) die Ausgabe eines unter der Adresse (Ai) abgespeicherten Binärcodes (BCi) aus dem Speicherbaustein (11) bestimmt, wobei ein Binärcode sich zusammensetzt aus dem Invertiersignal (ISi) für den Synchrongleichrichter (7) der VTS, einem Auswahlcode (ACi), der einen einzelnen Treiber (Ti) durch einen Decoderbaustein (12) und das entsprechende Abtast-Halteglied (AHi) durch einen weiteren Decoderbaustein (13) selektiert, sowie dem Freigabecode (FCi), der die Decoderbausteine (12) und (13) kurzzeitig freigibt und über ein Treibersteuersignal (TSSi) Zeitpunkt und Dauer eines individuellen monochromatischen Lichtpulses (MLi), und über das Ausschnittsignal ASi Zeitpunkt und Dauer der Abtastzeit des zugehörigen Abtast-Haltegliedes (AHi) bestimmt, und mittels eines weiteren digitalen RAM-Speicherbausteins (14) die Intensitätswerte (IW1 . . . IWn) digital gespeichert werden, von welchen durch den Auswahlcode (ACi) der Intensitätswert (IWi) für die Zeitspanne ausgewählt wird, während der der Impulstreiber (Ti) über den Dekoder (12) selektiert ist, woraufhin ein DA-Wandler (15) ein dem Intensitätswert (IWi) entsprechendes analoges Intensitätssignal (ISi) erzeugt, welches er dem Impulstreiber (T1 . . . Tn) der polychromatischen Meßlichtquelle (PMQ) zuführt, so daß der selektierte Impulstreiber Ti in der Impulslampe (Li) einen dem Intensitätssignal (ISi) proportionalen Meßlichtpuls (MLi) erzeugt,
  • f) in der Steuer- und Signalverarbeitungseinheit (SSVE) ein Mikrocomputer (17) folgende koordinierte Aufgaben erfüllt:
    • - Erzeugung des Taktsignals (TS) für den elektronischen Zählerbaustein (10);
    • - Laden des elektronischen Speicherbausteins (11) mit einem Binärcodemuster (BC1 . . . BCn), das den zeitlichen Ablauf des Meßvorgangs festlegt;
    • - Laden des elektronischen Speicherbausteins (14) mit dem Intensitätswertmuster (IW1 . . . IWn), das jeder Impulslampe (Li) einen Helligkeitswert zuordnet;
    • - Übernahme, Speicherung und Darstellung der durch den Analog-Digitalwandler (16) digitalisierten Meßsignale (DMSi);
    • - Vorgabe eines konstanten Kompensationssignals (KS) vor Beginn einer Messung;
    • - Regelung der einzelnen Meßsignale (MSi) auf Null vor Beginn einer Messung durch Veränderung des Intensitätswerts (IWi) im elektronischen Speicherbaustein (14) und anschließendem Vergleich des momentan anliegenden digitalen Meßsignals (DMSi) mit Null.
2. Spektralphotometer nach Anspruch 1, bei dem die Impuls-Lampen (L1 . . . Ln) lichtemittierende Dioden sind, welche bei geringer Leistungsaufnahme ausreichend intensive Lichtpulse mit steilen Schaltflanken liefern.
3. Spektralphotometer nach Anspruch 1, bei dem die Impuls-Lampen (L1 . . . Ln) Blitzentladungslampen sind, welche auch im blauen und ultravioletten Spektralbereich hohe Meßlichtintensitäten liefern.
4. Spektralphotometer nach Ansprüchen 1 bis 3, bei dem die optischen Fokussier-Einrichtungen (F1 . . . Fn) aus konisch zusammenlaufenden Glasfaser-Leitstäben (18) bestehen, welche mit ihren großen Querschnitten gegen die Interferenzfilter (I1 . . . In) und mit ihren kleinen Querschnitten gegen die einzelnen Lichtleiterbündel (LL1 . . . LLn) angedrückt sind.
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