DE3922453A1

DE3922453A1 - Pharmakologisch wirksame produkte aus molkeproteinhydrolysaten und verfahren zu deren gewinnung

Info

Publication number: DE3922453A1
Application number: DE19893922453
Authority: DE
Inventors: Kailash Kumar Prof Dr Gauri
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-07-07
Filing date: 1989-07-07
Publication date: 1991-01-17

Description

Die Erfindung betrifft pharmakologisch wirksame Produkte aus Molkeproteinhydrolysaten und ein Verfahren zu deren Gewinnung.

Die EP-A-86 900 765 beschreibt die enzymatische Hydrolyse von Molkeproteinen und Proteinhydrolysate, die auf diese Weise gewonnen werden. Diese Proteinhydrolysate wirken analgetisch, antiphlogistisch, antimutagen und haben eine Antiglaukom-Wirkung. Sie können daher zur Behandlung von beispielsweise schmerzhaften Entzündungen aller Art, Neurodermitis, Arthritis, Rheuma und Glaukoma verwendet werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, weitere pharmazeutisch brauchbare Bestandteile aus Molke hydrolysaten zur Verfügung zu stellen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß sich aus Molkehydrolysaten Produkte isolieren lassen, welche anti-HSV-Aktivität aufweisen.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Gewinnung von pharmakologisch wirksamen Produkten aus Molkeproteinhydrolysaten, das dadurch gekennzeichnet, ist, daß man

A) das Molkehydrolysat mit einem unpolaren Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch bei Raumtemperatur bis 50°C extrahiert, filtriert und aus dem Filtrat durch Einengen zur Trockene das Produkt (PE) gewinnt, oder
B) den in dem unpolaren Lösungsmittel unlösli chen Anteil mit Ethanol extrahiert, filtriert und aus dem Filtrat durch Einengen zur Trockene das Produkt (AS) gewinnt.

Das erfindungsgemäß als Ausgangsprodukt eingesetzte Molke hydrolysat ist nach dem in der EP-A-86 900 765 beschrie benen Verfahren erhältlich. Auf den Offenbarungsgehalt dieser Publikation wird hiermit Bezug genommen. Dabei geht man aus von Molkeproteinen einzeln oder im Gemisch, z.B. einem Molkenproteingemisch, Lactalbumin, α-Lactalbumin, Lactoferrin, β-Lactoglobulin,Lysozym oder Serumalbumin. Man behandelt eine etwa 1 bis 10 gew.-%ige Suspension dieser Molkenproteine in Wasser bei 35 bis 38°C mehrere Stunden unter Rühren mit mindestens einer Protease und gegebenen falls einer Lipase. Diese Behandlung wird bei etwa 60°C einige Stunden fortgesetzt, anschließend wird auf 80 bis 90°C erwärmt. Man verweilt kurz bei dieser Temperatur (1 bis 10 Minuten), um die Enzyme zu inaktivieren, und läßt dann abkühlen. Nach dem Abkühlen engt man unter reduziertem Druck ein und erhält das als Ausgangsprodukt dienende Molkehydrolysat. Weitere Einzelheiten dieses Verfahrens sind in der EP-A-86 900 785 beschrieben.

Erfindungsgemäß geeignete unpolare Lösungsmittel sind Petroläther, Benzol, Toluol, Äther und dergleichen. Petroläther und Benzol sind bevorzugt. Die Extraktion wird bei Raumtemperatur bis etwa 50°C durchgeführt. Man verwendet die etwa 10 bis 50fache Gewichtsmenge, vorzugsweise die etwa 20 bis 40fache Gewichtsmenge, an unpolarem Lösungsmittel pro Teil Molkenhydrolysat.

Man filtriert dann von den ungelösten Bestandteilen ab und engt das Filtrat zur Trockene ein. Man erhält auf diese Weise das Produkt (PE), das anti-HSV-Aktivität be sitzt.

Das Produkt PE läßt sich durch Kristallisation aus einem polaren Lösungsmittel, vorzugsweise Petrolether oder Benzol, weiter reinigen. Man erhält auf diese Weise das Produkt (ES) in Form von Kristallen. Auch das Produkt ES besitzt anti-HSV-Aktivität.

Das Produkt ES kann weiter durch HPLC an einer RP-C18-Säule gereinigt werden. Die Eluierung erfolgt mit 95%igem Methanol. Man erhält dabei die Produkte ES1, ES2 und ES3, die alle anti-HSV-Aktivität besitzen.

Produkte mit anti-HSV-Aktivität lassen sich jedoch auch aus dem in den unpolaren Lösungsmitteln unlöslichen An teil der Molkehydrolysate gewinnen. Zu diesem Zweck extra hiert man den unpolaren Anteil mit Ethanol, filtriert von ungelösten Bestandteilen ab und engt das Filtrat zur Trockene ein, wobei man das Produkt AS erhält, das eben falls anti-HSV-Aktivität aufweist. Dieses Produkt kann weiter gereinigt werden, indem man es mit Isopropanol extrahiert, filtriert und das Filtrat zur Trockene ein engt. Anschließend nimmt man das erhaltene Produkt in Äther auf, filtriert und engt das Filtrat zur Trockene ein, wobei man das Produkt ES erhält. Den in Äther unlösli chen Anteil extrahiert man mit Ethanol, filtriert und engt das Filtrat zur Trockene ein. Man erhält das Produkt AS (Produkt F).

Das auf diese Weise erhaltene Produkt AS kann durch HPLC an einer RP-C18-Säule weiter gereinigt werden. Man eluiert mit einem linearen Gradienten von H₂O : CH₃OH 30 : 70; 50 : 50; 70 : 30; 0 : 100. Man erhält auf diese Weise ebenfalls das Produkt ES (M-100).

Extraktion des in Isopropanol unlöslichen Anteils mit 25%igem wäßrigem Ethanol, Filtrieren und Einengen der Lösung liefert ein weiteres Produkt mit anti-HSV-Aktivi tät.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Produkte besitzen wert volle pharmakologische Eigenschaften und sind insbeson dere zur Behandlung von Herpes-Infektionen brauchbar. So ist beim Produkt ES bei viermaliger topischer Verabrei chung als Salbe bereits bei 0,1% ein therapeutischer Effekt zu beobachten. Dabei besteht eine Dosis-Wirkung- Beziehung, wie der Fig. 1 zu entnehmen ist. Die Daten wurden an Meerschweinchen gewonnen, die am Rücken mit HERPES-Viren inokuliert wurden. Der Verlauf der Virus- Infektion wurde anhand einer Punkteskala bewertet. Die römischen Zahlen I bis III betreffen dabei die Virus replikationsphase und die arabischen Zahlen 1 bis 3 die Wundheilungsphase. Es ist ersichtlich, daß das Produkt ES den Verlauf der Virusinfektion vorteilhaft beeinflußt.

Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Mittel, welche wenigstens eines der erfindungsgemäßen Produkte enthalten, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Hilfsstoffen.

Die Mittel können beispielsweise oral, parenteral und insbesondere topisch angewendet werden. Bei topischer Anwendung liegt die Einzeldosis in der Regel bei 1 bis 100 mg (für einen erwachsenen Menschen mit einem Körper gewicht von etwa 70 bis 75 kg) und es werden etwa 3 bis 10 Dosen pro Tag (24 Stunden) verabreicht.

Ein Präparat für die topische Anwendung kann als wäßrige Lösung, Lotion, Gelee, ölige Lösung, Suspension, fett haltige oder Emulsions-Salbe vorliegen. Ein Präparat in Form einer wäßrigen Lösung erhält man beispielsweise dadurch, daß man die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in einer wäßrigen Pufferlösung von PH 4 bis 7,5 löst und gewünschten falls einen weiteren Wirkstoff und/oder ein polymeres Haftmittel, z.B. Polyvinylpyrrolidon, und/oder ein Konser vierungsmittel zufügt. Die Konzentration des Wirkstoffs beträgt etwa 1 bis 10 Gew.-%.

Eine ölige Applikationsform für die topische Verabrei chung erhält man beispielsweise durch Suspendieren der erfindungsgemäßen Wirkstoffe in einem Öl, gegebenenfalls unter Zusatz von Quellmitteln, wie Aluminiumstearat, und/oder grenzflächenaktiven Mitteln (Tensiden), deren HLB-Wert (hydrophilic-lipophilic-balance) unter 10 liegt, wie Fettsäuremonoester mehrwertiger Alkohole, z.B. Glyce rinmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonostearat oder Sorbitanmonooleat.

Eine fetthaltige Salbe erhält man z.B. durch Suspendie ren der erfindungsgemäßen Wirkstoffe in einer streichba ren Fettgrundlage, gegebenenfalls unter Zusatz eines Tensids mit einem HLB-Wert unter 10.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung des Molkehydrolysats

5 g einer denaturierten Milcheiweißfraktion aus Molke (im Handel als Lactalbumin, z.B. als Lactalbumin-Sigma er hältlich) werden in 95 ml Wasser suspendiert, unter Rühren gibt man 0,4 g eines Gemisches aus jeweils etwa gleichen Gewichtsanteilen Pankreatin, Papain und eine Bakte rien- oder Pilzprotease hinzu und erwärmt auf 35 bis 37°C. Bei dieser Temperatur rührt man mehrere Stunden bis das Reaktionsgemisch annähernd klar ist. Sodann wird auf 60°C erhitzt, nach ca. 1 Stunde langsam auf 80°C gesteigert, kurze Zeit bei dieser Temperatur gelassen, abgekühlt und im Vakuum eingeengt.

Weitere Herstellungsmöglichkeiten des Molkehydrolysats sind in der EP-A-86 900 765 beschrieben.

Beispiel 2

5 g des Molkehydrolysats des Beispiels 1 werden mit der 20fachen Gewichtsmenge Petroläther bei Zimmertemperatur extrahiert. Man filtriert oder zentrifugiert und engt die erhaltene Lösung zur Trockene ein, wobei man etwa 2 g des Produktes PE erhält.

Beispiel 3

Das Produkt PE löst man in der 10fachen Gewichtsmenge an Petroläther und läßt es über Nacht bei -10°C stehen. Die ausgefallenen Kristalle filtriert man ab, wobei die Tempera tur nicht über 3°C steigen darf. Die Kristalle werden mit kaltem Petroläther gewaschen, bis sie farblos sind. Man erhält 65% (bezogen auf Produkt PE) des Produktes ES. Das Produkt ist löslich in Äther, Chloroform und absolutem Ethanol. Zur Reinigung kann es aus 70%igem Ethanol um kristallisiert werden.

Beispiel 4

2,4 g des Produktes ES werden durch HPLC an einer RP-C18- Umkehrphasensäule gereinigt. Mit 70%igem Methanol werden 0,2 g einer Verbindung eluiert, die nicht weiter untersucht wird. Man eluiert die Säule anschließend mit 95%igem Methanol, wobei man bei linearer Eluierung drei Fraktionen erhält. Die erste Fraktion umfaßt 1,52 Gramm des Produktes ES1, die zweite Fraktion 0,21 g des Produktes ES2 und die dritte Fraktion 0,45 g des Produktes ES3.

Das Produkt ES2 hat sich als besonders wirksam erwiesen. Es ist Ninhydrin-negativ.

Beispiel 5

Der in Petroläther unlösliche Anteil des Molkehydrolysates wird mit der 20fachen seiner Gewichtsmenge an Ethanol bei Umgebungstemperatur extrahiert. Man filtriert und engt das Filtrat zur Trockene ein, wobei man das Produkt AS erhält.

Beispiel 6

Das Produkt AS wird mit der 10fachen seiner Gewichtsmenge Isopropanol bei Umgebungstemperatur extrahiert. Man filtriert, engt die Lösung zur Trockene ein und extrahiert den Rückstand mit Äther.

Man filtriert die unlöslichen Bestandteile ab und engt die Ätherlösung zur Trockene ein, wobei man das Produkt ES er hält. Die unlöslichen Bestandteile nimmt man in Ethanol auf, filtriert und engt zur Trockene ein, wobei man das Produkt AS (Produkt F) erhält.

Extraktion des in Isopropanol unlöslichen Anteils bei Umgebungstemperatur mit 25%igem Ethanol, Filtrieren und Einengen zur Trockene liefert ein weiteres pharmakologisch wirksames Produkt.

Beispiel 7

Das Produkt AS wird durch HPLC an einer RP-C18-Umkehrphasen säule weiter gereinigt. Man eluiert mit linearen Wasser- Methanolgradienten 70 : 30; 50 : 50; 30 : 70 und 100% Methanol. Mit reinem Methanol wird das Produkt ES eluiert (M-100).

Mit 50%igem Methanol wird ein Wasser- und Chloroform-lösli ches Produkt isoliert, das sich besonders wirksam gegen Glaukoma erwiesen hat.

Die Extraktionsstufen sind graphisch in Fig. 2 erläutert.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von pharmakologisch wirksa men Produkten aus Molkeproteinhydrolysaten, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) das Molkeproteinhydrolysat mit einem unpolaren Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch bei Raumtemperatur bis 50°C extrahiert, filtriert und aus dem Filtrat durch Einengen zur Trockene das Produkt (PE) gewinnt, oder
B) den in dem unpolaren Lösungsmittel unlösli chen Anteil mit Ethanol extrahiert, filtriert und aus dem Filtrat durch Einengen zur Trockene das Produkt (AS) gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das gemäß A) erhältliche Produkt (PE) aus einem unpolaren Lösungsmittel, insbesondere Petroläther umkristallisiert, wobei man das Produkt (ES) erhält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt (ES) mittels HPLC weiter reinigt, wobei man die Produkte (ES1), (ES2) und (ES3) erhält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das gemäß B) erhalte ne Produkt (AS) mit Isopropanol extrahiert, filtriert und zur Trockene einengt, den Rückstand mit Äther extrahiert, filtriert und aus dem Filtrat durch Einengen zur Trockene das Produkt (ES) gewinnt, oder den Äther-unlöslichen Anteil mit Ethanol extrahiert, filtriert und aus dem Filtrat durch Einengen zur Trockene das Produkt (AS) erhält.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt (AS) mittels HPLC weiter reinigt, wobei man das Produkt (ES) erhält.

6. Produkte, erhältlich nach den Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5.

7. Pharmazeutische Mittel, enthaltend wenigstens ein Produkt nach Anspruch 6.