DE3907192A1

DE3907192A1 - Verfahren zur durchfuehrung einer enzymatischen reaktion und vorrichtung zur durchfuehrung derselben

Info

Publication number: DE3907192A1
Application number: DE19893907192
Authority: DE
Inventors: Joji Takahashi
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1988-03-07
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1989-09-21
Also published as: JPH01225477A; JPH088857B2; GB2217345B; GB8904882D0; GB2217345A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, insbesondere auf die Durchführung einer neuen enzymatischen Reaktion derart, daß das Wachstum von mikrobiellen verunreinigenden Substan zen im weitestgehenden Ausmaß unterdrückt wird.

Eine enzymatische Reaktion ist im Vergleich mit einer übli chen chemischen Reaktion gekennzeichnet durch eine ausge zeichnete katalytische Aktivität unter milden Bedingungen, durch eine exakte Substratspezifizität und eine Spezifizität sowohl bezüglich der lokalen Stelle, an der die Reaktion an greift, als auch bezüglich der Stereochemie der betreffenden Reaktion,und eine solche enzymatische Reaktion findet in einer Vielzahl von Industrien Anwendung, beispielsweise in der Lebensmittelchemie und in der chemischen Industrie.

Eines der wesentlichen, bei der Durchführung enzymatischer Reaktionen auftretenden und daher zu lösenden Probleme betrifft die Verschmutzung der Reaktionslösung und der Reaktionsvor richtung durch mikrobielle Verunreinigungen. Da nämlich eine enzymatische Reaktion üblicherweise unter milden Bedingungen durchgeführt wird, zeigt die Reaktionslösung eine große Nei gung dazu, durch mikrobielles Wachstum verunreinigt zu werden. Sobald aber einmal eine Reaktionslösung durch Mikroorganismen verunreinigt ist, treten viele zusätzliche Probleme auf, wie z.B. die Inaktivierung des betreffenden Enzyms, eine Zersetzung der Reaktionslösung, eine Verringerung der Ausbeute an dem ge wünschten Reaktionsprodukt und ähnliche Probleme.

Bisher sind folgende Maßnahmen zur Lösung der vorstehend er läuterten Probleme empfohlen worden:

(1) Physikalische Methoden, wie eine Wärmesterilisierung und ein Abfiltrieren von mikrobiellen verunreinigenden Substan zen (übliche Methode Nr. 1); (2) der Einsatz von Bakteriziden oder bakteriostatisch wirkenden Stoffen (übliche Methode Nr. 2); und (3) Anwendung solcher enzymatischer Reaktionsbedingungen, daß die betreffenden mikrobiellen verunreinigenden Substanzen nicht wachsen können (übliche Methode Nr. 3).

Bei der üblichen Methode Nr. 1 ist es jedoch schwierig, ein weiteres Wachstum der mikrobiell verunreinigenden Stoffe zu unterdrücken, wenn erst einmal eine mikrobielle Verschmutzung der Reaktionslösung im Verlauf der Durchführung der enzymati schen Reaktion stattgefunden hat.

Auch die übliche Methode Nr. 2 ist nicht unter allen Umständen befriedigend, da gerade vom Verbraucherstandpunkt die Sicher heit des Verbrauchs von Produkten in der Nahrungsmittelin dustrie nicht immer gewährleistet ist.

Die übliche Methode Nr. 3 macht den Einsatz spezieller Enzyme erforderlich, beispielsweise von hitzebeständigen Enzymen, von alkalibeständigen Enzymen oder von säurebeständigen Enzy men, wobei solche Enzyme meist nur extrem schwierig zu beschaf fen sind.

Aufgrund der vorstehenden Darlegungen ist ersichtlich, daß die üblichen Methoden nicht immer zu zufriedenstellenden Ergebnis sen führen und daher besteht ein dringender Bedarf an einer Methode, welche sich auf allen industriellen Einsatzgebieten anwenden läßt und mittels einfacher Maßnahmen das Wachstum der unterschiedlichsten, mikrobielle Verschmutzung verursachen den Substanzen unterdrückt.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion zur Verfügung zu stellen, bei dem das Wachstum von mikrobiellen verunreinigenden Stoffen in extremem Ausmaß unterdrückt wird.

Der Erfinder hat Untersuchungen bezüglich des Wachstums eines Bakteriums (Pseudomonas aeruginosa), einer Hefeart (Candida tropicalis) und eines Pilzes (Aspergillus niger) unter den Bedingungen einer hohen Konzentration an gelöstem Sauerstoff durchgeführt. Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde gefun den, daß das Zellwachstum jeder der genannten Mikroorganismen in hohem Ausmaß unterdrückt wurde, wenn die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Bereich von etwa 50 bis 90 ppm lag (vgl."J. Ferment. Technol.", 62, 71-75 (1984); "Agric.Biol. Chem.", 51, 257-258 (1987); Hakkokogaku Kaisi (Bulletin of The Society of Fermentation Technology, Japan), 65, 501-506 (1987)).

Der Erfinder hat weiterhin Untersuchungen durchgeführt, um praktische Anwendungsmöglichkeiten seiner Forschungsergebnisse aufzufinden, insbesondere bezüglich der Anwendbarkeit zur Ver hinderung einer mikrobiellen Verschmutzung bei enzymatischen Reaktionen. Er hat dabei gefunden, daß das Wachstum von mikrobiellen verunreinigenden Substanzen unterdrückt werden kann, ohne daß gleichzeitig die Wirksamkeit der enzymatischen Aktivität beeinträchtigt wird, wenn man die enzymatische Reaktion unter solchen Bedingungen durchführt, daß die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in einer Reaktionslösung mindestens auf einem bestimmten Wert oder darüber gehalten wird. Die vorliegende Erfindung beruht auf den vorstehenden Überlegungen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung einer enzyma tischen Reaktion ist demgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration des in der Reaktionslösung gelösten Sauer stoffs auf einen Wert von mindestens 40 ppm einstellt und während der Umsetzung auf einem Wert von mindestens 40 ppm hält.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des vor stehend charakterisierten Verfahrens umfaßt einen Reaktor, in welchem die enzymatische Reaktion abläuft, und eine Vor richtung zur Aufrechterhaltung des erforderlichen Wertes für die Konzentration an dem in der Reaktionslösung gelöst vorlie genden Sauerstoff.

Nachstehend werden die Zeichnungen kurz erläutert.

Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen in Form schematischer Diagramme einige Beispiele für Vorrichtungen, in denen die erfindungs gemäße enzymatische Reaktion durchgeführt werden kann.

Fig. 4 zeigt in Form eines Diagramms die in Ausführungsbeispiel 1 eingesetzte Vorrichtung.

Die Fig. 5, 6 und 7 sind graphische Darstellungen, welche die Veränderungen im Hinblick auf die Aminosäurekonzentration (-○-, -⚫-) und der Anzahl an lebensfähigen Zellen der verunreinigenden mikrobiellen Substanz während der Hydrolyse aufzeigen [Anzahl der lebensfähigen Zellen in der Reaktionslösung (--, -∎-) und auf dem immobilisierten Enzym (-∆-, -▲-)].

Fig. 8 erläutert in Form eines Fließdiagramms eine Vorrichtung zur Durchführung einer kontinuierlichen Hydrolyse, wie sie in Ausführungsbeispiel 2 zur Anwendung kommt.

In der nachfolgenden Beschreibung und in den Ansprüchen haben die verwendeten technischen Ausdrücke die folgende Bedeutung:

Der Ausdruck "Kultur" bedeutet ein Züchtungsprodukt in Form einer Mischung aus einem Züchtungsmedium und darauf oder da rin gewachsenen Zellen, welche durch das Züchten eines Mikro organismus in üblicher Weise entstanden sind.

Der Ausdruck "intakte Zellen eines Mikroorganismus" bedeutet isolierte Zellen, welche unter Anwendung üblicher Trennmetho den, wie Zentrifugieren, Sedimentationstrennung, agglomerie rende Trennung oder dergleichen erhalten worden sind,oder gewaschene Zellen, welche durch Waschen der isolierten Zellen mit Wasser, einer Pufferlösung oder dergleichen, erhalten wur den.

Der Ausdruck "Modifizierung von Zellen eines Mikroorganismus" bedeutet getrocknete Zellen, Zellen mit einer denaturierten Zellmembran und/oder Zellwand, zerkleinerte Zellen, welche dadurch erhalten wurden, daß man die intakten Zellen eines Mikroorganismus einer physikalischen Behandlung unterworfen hatte, beispielsweise einer Ausfrier-Auftaubehandlung, einer Lyophilisierung, einer Belüftungs-Trocknungsbehandlung, einer Trocknungsbehandlung mit Aceton, einer Wärmebehandlung unter sauren oder alkalischen Bedingungen, einer Zerkleinerungs behandlung mit Ultraschall, einer osmotischen Schockbehand lung und dergleichen. Außerdem werden darunter Zellen ver standen, welche zusätzlich oder allein einer chemischen oder biochemischen Behandlung unterworfen worden sind, beispiels weise einer enzymatischen Behandlung mit Lysozym oder ande ren lytischen Enzymen oder einer Behandlung mit einem organi schen Lösungsmittel, wie mit Toluol, Xylol, Aceton oder der gleichen.

Unter dem Ausdruck "Proteinfraktion mit enzymatischer Aktivi tät" wird ein rohes Enzym verstanden, ein gereinigtes Enzym oder dergleichen, welche dadurch erhalten worden sind, daß man die intakten Zellen eines Mikroorganismus, eine Modifikation von Zellen eines Mikroorganismus oder ein Kulturmedium nach Durchführung der Züchtung üblichen Behandlungen der Enzymex traktion und Enzymreinigung unterworfen hat, beispielsweise einem Aussalzen, einer Ionenaustauschchromatographie, einer Gelfiltration, einer Affinitätschromatographie, einer Elek trophorese oder dergleichen.

Im Rahmen des Verfahrens der Erfindung können als Enzyme be liebige Klassen von Enzymen eingesetzt werden, beispielsweise Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomera sen und Synthetasen.

Der Reinigungsgrad eines für die enzymatische Reaktion einge setzten Enzyms und die Art seines Einsatzes sind nicht kri tisch, und es kann jede enzymhaltige Substanz verwendet wer den, welche ein oder mehrere Enzyme enthält, welche die in Betracht gezogene Reaktion katalysieren, beispielsweise eine Kultur, intakte Zellen eines Mikroorganismus, eine Modifika tion von Zellen eines Mikroorganismus, eine Proteinfraktion mit Enzymaktivität und dergleichen, sofern sie sich für die Durchführung enzymatischer Reaktionen im Sinne der vorlie genden Erfindung eignen. Darüber hinaus können die zum Ein satz kommenden enzymhaltigen Substanzen auch in Form immobili sierter Produkte vorliegen, wie sie erhalten werden, indem man die betreffenden Substanzen auf einem Trägermaterial immo bilisiert, wie es üblicherweise für die Herstellung eines im mobilisierten Enzyms oder eines immobilisierten Mikroorganis mus eingesetzt wird.

Derartige immobilisierte Produkte können unter Anwendung übli cher Methoden hergestellt werden, beispielsweise mittels Ver netzung, einer Bindung oder einer einschließenden Behandlung oder einer Adsorptionsbehandlung. Derartige Behandlungsmög lichkeiten sind in der Literatur beschrieben, beispielsweise in "KOTEIKA KOSO (Immobilized Enzymes)", ed. Ichiro Chibata, 9-85, (März 1975, veröffentlicht durch KODANSHA K.K.) oder "KOSO KOGAKU (Enzyme Technology)", 153-202 (18. September 1981, veröffentlicht durch TOKYO KAGAKU DOJIN). Dieser Stand der Technik wird mit in die vorliegende Erfindung bezüglich des Offenbarungsgehaltes aufgenommen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung enzymatischer Reaktionen ist dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, daß die Konzentration des in einer Reaktionslösung gelösten Sauer stoffs auf einen Wert von mindestens 40 ppm oder höher und vorzugsweise auf einen Wert von mindestens 60 ppm oder höher eingestellt und während der Umsetzung auf einem solchen Wert gehalten wird. Wenn die Konzentration an gelöstem Sauerstoff unterhalb 40 ppm liegt, dann ist es schwierig, ein Wachstum von mikrobiellen verunreinigenden Substanzen zu unterdrücken. Die obere Grenze der Konzentration an gelöstem Sauerstoff ist hingegen nicht kritisch, wenn es auch aus betriebstechnischen Gründen vorgezogen wird, einen Wert bis zu etwa 400 ppm zu wählen.

Um die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Reaktions lösung auf den vorher erwähnten Mindestwert einzustellen und auf diesem Wert zu halten, kann jede beliebige Methode ver wendet werden, welche es ermöglicht, die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in einer Reaktionslösung aufrecht zu er halten. Beispiele für solche Arbeitsmethoden sind (1) eine Methode, bei der man ein sauerstoffhaltiges Gas, wie Luft, ein Gas mit einem höheren Partialdruck als dem von Luft oder reinen Sauerstoff, unter atmosphärischen oder höheren Drücken durch die Reaktionslösung fließen läßt. Eine weitere Methode (2) be steht darin, eine Substratlösung zu verwenden, in welcher der Sauerstoff vorher aufgelöst worden ist und in welcher die Sauerstoffkonzentration unter Anwendung von Druck auf 40 ppm oder höher gehalten wird (diese Arbeitsmethode ist besonders vorteilhaft für ein kontinuierliches Durchführen der enzyma tischen Reaktion unter Verwendung einer Reaktionskolonne). Eine dritte Arbeitsweise (3) besteht darin, den oberen freien Raum eines dicht verschlossenen Reaktionskessels (wobei es sich um den Bereich zwischen dem oberen Flüssigkeitsspiegel einer Reaktionslösung und der Innenfläche des oberen Teils des Reaktionskessels handelt) unter atmosphärischen Druckbedin gungen oder höheren Drücken mit einem sauerstoffhaltigen Gas zu füllen.

Außer daß die Konzentration an in der Reaktionslösung gelös tem Sauerstoff den vorstehend genannten erfindungsgemäßen Be dingungen entsprechen muß, können die übrigen Reaktionsbedin gungen beliebig innerhalb des Bereiches ausgewählt werden, wie sie auch sonst üblicherweise für Enzymreaktionen Anwendung finden. Das gilt auch dann, wenn die Konzentration an gelöstem Sauerstoff einen Wert von 60 ppm oder höher annimmt. Falls die Konzentration an gelöstem Sauerstoff im Bereich von 40 bis 60 ppm liegt, wird die Reaktion vorzugsweise bei entsprechend eingestellten Bedingungen in bezug auf den pH-Wert, die Tempe ratur und die Salzkonzentration durchgeführt. Besonders ge eignete Bedingungen sind unter solchen Umständen diejenigen, bei denen der pH-Wert 5 oder weniger beträgt (saure Bedingun gen) oder bei denen der pH-Wert 9 oder mehr beträgt (alkali sche Bedingungen). Die Reaktionstemperatur liegt dann zweck mäßig bei 40°C oder höher und die Salzkonzentrationen betra gen 5% oder mehr, da sich dann das Wachstum von mikrobiell verunreinigenden Substanzen bei einer Kombination aller die ser Bedingungen und bei einer Konzentration an gelöstem Sauer stoff im Bereich von 40 bis 60 ppm besonders wirksam unter drücken läßt.

Die erfindungsgemäße enzymatische Reaktion kann entweder ab satzweise oder kontinuierlich durchgeführt werden. Die Vor richtungen und die Substrate, welche für die enzymatische Um setzung eingesetzt werden, werden vorzugsweise vorher steri lisiert oder pasteurisiert. Auf diese Weise läßt sich schon im Anfangsstudium der Umsetzung das Wachstum von mikrobiellen verunreinigenden Substanzen in bemerkenswertem Umfang unter drücken.

Wenn nach Beendigung der enzymatischen Umsetzung eine Isolie rung und Reinigung des gebildeten Produktes erforderlich ist, so kann das mittels an sich bekannter Methoden geschehen, die auch sonst bei enzymatischen Reaktionen zur Anwendung kommen.

Als Reaktionsvorrichtung zur Durchführung der enzymatischen Reaktion gemäß der Erfindung eignet sich jede beliebige Vor richtung, sofern sie einen Reaktor zur Durchführung der enzy matischen Reaktion und eine Vorrichtung aufweist, welche es ermöglicht, die Konzentration des gelösten Sauerstoffs in der Reaktionslösung auf den gewünschten Wert einzustellen und ihn auf einem solchen Wert zu halten.

Als Reaktoren für die Durchführung enzymatischer Reaktionen eignen sich beispielsweise eine Kolonne, ein Turm, ein ge rührter Tank, ein fluidisiertes Bett, eine Membran oder ein Film, doch wird vorzugsweise ein Reaktor verwendet, welcher unter Überdruck gesetzt werden kann.

Als Vorrichtung zur Aufrechterhaltung der gewünschten Konzen tration an gelöstem Sauerstoff kann ein Aerator verwendet werden, durch den Sauerstoff in den Reaktor einströmt, oder es kann eine Sauerstoff lösende Vorrichtung zur Anwendung kom men, welche den Sauerstoff in der Substratlösung auflöst.

Beispiele für geeignete Reaktionsvorrichtungen sind in den Fig. 1, 2 und 3 schematisch dargestellt. Gemäß der Ausfüh rungsform von Fig. 1 kann die gewünschte Konzentration an ge löstem Sauerstoff in der Reaktionslösung aufrecht erhalten werden, indem man Luft und/oder Sauerstoffgas unter Druck über den Aerator B in den Reaktor A einspeist.

Bei der in Fig. 2 dargestellten Ausführungsform kann die ge wünschte Konzentration an in der Reaktionslösung gelöstem Sauerstoff aufrecht erhalten werden, indem man den freien Raum innerhalb des Reaktors A kontinuierlich oder absatzweise unter Druck aus dem Aerator B mit einem sauerstoffhaltigen Gas beschickt.

Bei der in Fig. 3 dargestellten Ausführungsform kann die ge wünschte Konzentration an in der Reaktionslösung gelöstem Sauerstoff dadurch aufrecht erhalten werden, daß man die Substratlösung einer Sauerstoff auflösenden Vorrichtung C zuführt , so daß dann eine Substratlösung gebildet wird, die einen höheren Gehalt an gelöstem Sauerstoff aufweist, welche schließlich in den Reaktor A eingespeist wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich demgemäß um ein neues Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, bei dem das Wachstum von mikrobiell verunreinigen den Substanzen durch Aufrechterhaltung einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff in einer Reaktionslösung auf einem Wert von 40 ppm oder höher, vorzugsweise auf einen Wert von 60 ppm oder höher eingestellt und auf einem solchen Wert während Durchführung der Reaktion gehalten wird. Auf diese Weise treten keine Probleme bezüglich der nachteiligen Wirkung eines Wachstums von verunreinigenden Stoffen auf.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch die folgenden Merk male gekennzeichnet: (1) es verwendet eine sehr einfache Methode, um das Wachstum von mikrobiellen verunreinigenden Substanzen zu unterdrücken, nämlich die Aufrechterhaltung einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff in einer Reaktions lösung auf einem Wert von 40 ppm oder höher; (2) es erfordert keine sterilen Bedingungen, da das Wachstum von mikrobiell wirkenden Verunreinigungen selbst dann unterdrückt werden kann, wenn diese Verunreinigungen bereits in einer Reaktions lösung vorhanden sind; (3) es erfordert keine kostspieliegen Vorrichtungen oder speziellen Vorrichtungen; (4) es handelt sich um eine aus hygienischer Sicht außerordentlich sichere Arbeitsweise; (5) während des Ablaufens der Reaktion wird keine Verminderung der enzymatischen Aktivität beobachtet, selbst dann nicht, wenn die Konzentration an gelöstem Sauer stoff erhöht wird. Es handelt sich demgemäß um ein außerordent lich nützliches Verfahren, welches auf vielen industriellen Anwendungsgebieten zum Einsatz kommen kann.

Die Erfindung wird nun anhand der Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Beispiel 1

(1) Herstellung eines immobilisierten Enzyms und einer Sub stratlösung.

Zu 45 ml einer Lösung von Pronase (Handelsbezeichnung, Her steller: Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co.) in einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5), welche so eingestellt war, daß die Enzymkonzentration 1,25 mg/ml betrug, wurden 1,8 g Chito pearl BCW-3510 (Handelsbezeichnung, Perlen aus Chitosan, Her steller: Fuji Spinning Co.Ltd.) zugesetzt. Diese Mischung wurde 3 Stun den lang bei 0°C gerührt, so daß die Pronase an der Chito pearlmasse adsorbiert wurde. Anschließend wusch man 7 Mal mit jeweils 30 ml einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5) und ver wendete das so hergestellte Präparat als immobilisiertes Enzym.

Als Substratlösung wurde eine 0,5prozentige (Gewicht/Volumen) Lösung von Casein in einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5) verwendet.

Die Chitopearl-Masse, die Phosphatpufferlösung und die Sub stratlösung wurden vor ihrem Einsatz 10 Minuten in einem Autoklav bei 121°C sterilisiert.

(2) Hydrolysereaktion von Casein unter Verwendung des immobi lisierten Enzyms.

In einen Reaktor, wie er in Fig. 4 dargestellt ist, wurden 1,8 g des immobilisierten Enzyms und 350 ml der Substratlö sung eingefüllt. Durch ein Glasfilter am Boden des Reaktors (1) ließ man in dem erforderlichen Ausmaß Luft oder Sauerstoff mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 ml/Min. zuströmen, um die Hydrolysereaktion bei einer Temperatur von 30°C durch führen zu können, wobei die Konzentration an gelöstem Sauer stoff auf konstante Werte von 190 ppm (Druckbeaufschlagung bis zu 5 kg/cm² G mittels Sauerstoffbelüftung), 95 ppm (Druck beaufschlagung bis 2 kg/cm² G durch Sauerstoffbelüftung), 65 ppm (Druckbeaufschlagung bis 1 kg/cm² G durch Sauerstoffbelüf tung), 7 ppm (bei Atmosphärendruck mittels Sauerstoffbe lüftung) oder auf 2 bis 3 ppm (bei Atmosphärendruck ohne Sauerstoffbelüftung) eingestellt wurde. Der Reaktor (1) wies außerdem einen Magnetrührer (2) auf. Der zugeführte Sauerstoff durchströmte zunächst den Strömungsregler (8) und dann ein Luftfilter (9) und schließlich einen Befeuchter (7). Proben konnten über Leitung (6) entnommen werden. Außerdem sind im Reaktor (1) eine Elektrode (3), eine Meßvorrichtung (4) und eine Aufzeichnungsvorrichtung (5) zur Bestimmung und Kontrolle des Gehaltes an gelöstem Sauerstoff in der Reaktionslösung vorhanden.

Nach Beendigung der enzymatischen Umsetzung wurde nur die Reaktionslösung abgezogen und das Innere des Reaktors wurde 3 Mal mit je 80 ml Phosphatpufferlösung gewaschen, während das immobilisierte Enzympräparat im Reaktor verblieb. An schließend wurden 350 ml frische Substratlösung in den Reak tor eingefüllt und die Hydrolysereaktion wurde wiederholt.

Die Aminosäurekonzentration in der Reaktionslösung wurde be stimmt durch Abnahme einer Probe der Reaktionslösung über Lei tung (6) und zu jeweils einer Probe von 5 ml wurden 5 ml eines Proteinfällungsmittels zugesetzt (enthaltend 0,11 M Trichlor essigsäure, 0,22 M Natriumacetat und 0,33 M Essigsäure).Um das Protein vollständig auszufällen, ließ man die Reaktion bei 30°C 30 Minuten lang ablaufen, filtrierte dann die Probe der Reaktionslösung und bestimmte den Gehalt an Aminosäure in dem Filtrat mittels der Anfärbmethode von Folin (vgl. "KOSO KENKYU-HO (Method of Investigating Enzymes), Vol.2", heraus gegeben von Shiro Akabori, 237-246 (veröffentlicht am 30. Mai 1956 durch Asakura Shoten K.K.)).

Die Anzahl an lebensfähigen mikrobiellen Zellen der verunrei nigenden Stoffe in der Reaktionslösung wurde unter Verwendung eines Bouillon-Nährmediums mittels der Plattenzählmethode be stimmt (vgl. "BISEIBUTSU-GAKU JIKKEN-HO (Experimental Method of Microbiology)", Herausgeber: BISEIBUTSU KENKYU-HO KONDANKAI, 203-204 (veröffentlicht am 15. Dezember 1975 durch Kodansha K.K.)). Nach Beendigung der Hydrolysereaktion wurde auch die Anzahl der lebensfähigen mikrobiellen Zellen mittels der Plat tenzählmethode bestimmt, welche an dem immobilisierten Enzym anhafteten. Zu diesem Zweck wurden 5 Teilchen des immobili sierten Enzyms in 9 ml sterilisiertes Wasser eingebracht und die Mischung wurde mit einem Glasstab ausreichend zerkleinert und dann 1 Minute lang in Bewegung gehalten.

Die Änderungen der erzeugten Aminosäure (Aminosäurekonzentra tion) und in der Zahl der lebensfähigen mikrobiellen Zellen der verunreinigenden Stoffe in der Reaktionslösung oder der lebensfähigen Zellen, welche an dem immobilisierten Enzymprä parat noch anhafteten, sind in Fig. 5 graphisch dargestellt (gelöste Sauerstoffkonzentration: 190 ppm und 7 ppm). Fig. 6 zeigt dieselben Verhältnisse bei einer gelösten Sauerstoffkon zentration von 95 ppm bzw. 2 bis 3 ppm und Fig. 7 zeigt die entsprechenden Verhältnisse bei einer gelösten Sauerstoffkon zentration von 65 ppm bzw. 2 bis 3 ppm. In Fig. 5 beziehen sich die Symbole -○-, -- und -∆- auf die Durchführung der Reaktion bei einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 190 ppm und die Symbole -⚫-, -∎- und -▲- auf die Durchfüh rung der Reaktion bei einer Konzentration an gelöstem Sauer stoff von nur 7 ppm. In entsprechender Weise beziehen sich die Symbole -○-, -- und -∆- in Fig. 6 auf die Durchführung der Reaktion bei einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 95 ppm und die Symbole -⚫-, -∎- und -▲- auf die Durchführung der Reaktion bei einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff von nur 2 bis 3 ppm. In Fig. 7 bedeuten die Symbole -○-, -- und -∆- die Ergebnisse bei Durchführung der Reaktion bei einer Konzentration an ge löstem Sauerstoff von 65 ppm und die Symbole -⚫-, -∎- und -▲- beziehen sich auf die Durchführung der Reaktion bei einer Kon zentration des gelösten Sauerstoffes von 2 bis 3 ppm.

Aus den Ergebnissen der Fig. 5, 6 und 7 kann abgelesen werden, daß das Wachstum von mikrobiell verunreinigenden Substanzen in der Reaktionslösung vollständig unterdrückt werden kann, wenn man die Konzentration an gelöstem Sauerstoff auf einem Wert von 65 ppm oder höher hält und daß dann auch kein Wachs tum der verunreinigenden Stoffe auf der Oberfläche des immobi lisierten Enzympräparates beobachtet wird. Außerdem zeigt sich, daß selbst bei Durchführung der Reaktion bei einer hohen Kon zentration an gelöstem Sauerstoff von 190 ppm keine Abnahme der Enzymaktivität infolge von Oxidation oder dergleichen stattfindet.

Beispiel 2

(1) Herstellung eines immobilisierten Enzyms und einer Sub stratlösung.

Zu 100 ml einer Lösung von Pronase in einer 0,05 M Phosphat pufferlösung (PH 7,5), welche so eingestellt war, daß sie eine Enzymkonzentration von 6 mg/ml aufwies, wurden 34,1 g (50 ml) Chitopearl BCW-3530 (Chitosan-Perlen, Hersteller: Fuji Spinning ComPany Ltd.) zugesetzt. Diese Mischung rührte man 3 Stunden lang bei 0°C, wodurch die Pronase an der Chitopearl masse adsorbiert wurde. Anschließend wusch man die Masse 7mal mit jeweils 70 ml der vorstehend erwähnten Pufferlösung (pH 7,5) aus und verwendete dann das Präparat als immobilisiertes Enzym.

Als Substratlösung wurde eine 0,5prozentige (Gewicht/Volumen) Lösung von Casein in einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5) verwendet.

Vor Durchführung der Reaktion wurden die Chitopearl-Masse, die Phosphatpufferlösung und die Substratlösung 10 Minuten lang in einem Autoklav bei 121°C sterilisiert.

(2) Kontinuierliche Hydrolyse des Caseins mit dem immobili sierten Enzympräparat.

Für die kontinuierliche Durchführung der Hydrolyse wurde der in Fig. 8 wiedergegebene Reaktor verwendet. Es handelte sich dabei um einen Reaktor (1) in Form einer Kolonne mit einem Festbett aus 50 ml des wie vorstehend erhaltenen immobili sierten Pronase-Präparates. Der Reaktor (1) bestand aus einem druckbeständigen zylindrischen Rohr (Durchmesser: 2 cm, Länge: 20 cm). Sauerstoffgas wurde in Form eines feinen Schaums kon tinuierlich über ein Luftfilter (9) und einen Gasverteiler (11) in den unteren Teil eines Vorratsbehälters (10) für die Substratlösung eingespeist, um die Luft in dem Leerraum dieses Vorratsbehälters (10) zu entfernen, wodurch dann der Sauerstoff sich in der Substrat lösung löste, wobei der Durchfluß des Gases bis zu einem Druck von 6 atm erhöht wurde (vgl. Druckventil 12). Auf diese Weise wurde in der Substratlösung eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 190 ppm (5 kg/cm² G) aufrecht erhalten. Diese Substratlösung, welche eine Konzentration an gelöstem Sauer stoff von 190 ppm aufwies, wurde am Boden des Reaktors (1) eingespeist und die Hydrolyse der darin befindlichen Casein lösung erfolgte, indem man ein elektromagnetisches Ventil am Auslaß (6) am Kopf des Reaktors mittels der Zeiteinstellvor richtung (13) öffnete und schloß, wodurch die Durchströ mungsgeschwindigkeit der Substratlösung auf einem konstanten Wert von 15 ml/Std. gehalten werden konnte.

Getrennt davon wurde eine Kontrollprobe erhalten, indem man die gleiche Substratlösung auch einem entsprechend gebauten Reaktor zuführte, welcher das immobilisierte Pronase-Präparat unter atmosphärischem Druck enthielt. Hierzu diente eine Tauchpumpe, welche den Durchfluß der Substratlösung auf 15 ml pro Stunde einstellte. Auf diese Weise erfolgte die Hydrolyse des Caseins unter atmosphärischen Druckbedingungen. Die Kon zentration an gelöstem Sauerstoff in dieser zur Kontrolle ein gesetzten Substratlösung lag im Bereich von 2 bis 3 ppm.

In beiden Fällen, d.h. bei der erfindungsgemäßen Durchführung und beim Kontrollverfahren, wurde die Reaktionstemperatur auf einem Wert von 30°C gehalten und die Umsetzung wurde ununter brochen 40 Tage lang durchgeführt. Alle Reaktionsvorrichtun gen wurden vor Durchführung dieses Versuches 10 Minuten lang in einem Autoklaven bei 121°C sterilisiert.

Nach Einsetzen der Reaktion wurde die Reaktionslösung täglich gesammelt, um die Anzahl der lebensfähigen mikrobiellen Zellen verunreinigender Stoffe in der Reaktionslösung und die Menge an erzeugter Aminosäure quantitativ zu bestimmen, so wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I wiedergegeben.

Tabelle I

Kontinuierliche Durchführung der Protein-Hydrolyse (30°C, pH 7,5)

Wie aus Tabelle I abgelesen werden kann (Kolonne: Anzahl der lebensfähigen mikrobiellen Zellen), wurde während der ge samten 40tägigen Versuchsdauer kein Wachstum von mikrobiellen verunreinigenden Stoffen beobachtet, wenn die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Substratlösung auf einem Wert von 190 ppm gehalten wurde (erfindungsgemäße Maßnahme). Andererseits zeigt der Kontrollversuch, daß eine mikrobielle Verunreinigung schon einen Tag nach Ingangsetzen der Reaktion eintritt und daß die Konzentration an lebensfähigen Zellen schon am 3. Tag einen außerordentlich hohen Wert von 1,9×10⁸/ml erreicht. Aus den Konzentrationswerten der Tabelle I für die gebildete Aminosäure läßt sich außerdem ablesen, daß die Enzymaktivität selbst nach 40tägiger Reaktion beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht wesentlich abgesunken war und daß keine Verminderung der enzymatischen Aktivität infolge einer mikrobiellen Verunreinigung oder einer Oxidation stattgefunden hatte.

Beispiel 3

Die Hydrolysereaktion von Casein wurde in einer wiederholten absatzweisen Form in der Art und Weise und mit der Vorrich tung, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch anstelle des immobilisierten Pronase-Präparates ein immobili siertes saures Protease-Präparat verwendet wurde und die Reaktion unter sauren Bedingungen (pH 3,0) durchgeführt wurde.

Das immobilisierte Enzympräparat wurde hergestellt unter Ver wendung von Protease M (Hersteller: AMANO SEIYAKU K.K.) in Form einer sauren Protease, wobei 2,0 g Chitopearl BCW-3510 zu 45 ml 0,05 M Lactatpufferlösung (pH 3,0) zugesetzt wurden, welche so eingestellt war, daß sie eine Enzymkonzentration von 3,5% (Gewicht/Volumen) aufwies. Die Mischung wurde dann in der gleichen Weise behandelt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Als Substratlösung wurde eine 0,5prozentige (Gewicht/Volumen lösung) von Casein in einer 0,05 M Lactatpufferlösung (pH 3,0) verwendet, welche vorher 5 Minuten lang unter milden Bedingun gen bei 85°C sterilisiert worden war.

Die Substratlösung wurde belüftet, wie in Beispiel 1 beschrie ben, so daß eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von 50 ppm aufrechterhalten wurde (Druckbeaufschlagung bis zu 0,7 kg/cm² G (1,7 atm) mittels Sauerstoffbelüftung). Diese absatzweise Reaktion wurde 4 mal bei 30°C wiederholt (ins gesamt 100 Stunden).

In Form eines Kontrollverfahrens wurde die Reaktion auch mit einer Substratlösung durchgeführt, welche eine Konzentra tion an gelöstem Sauerstoff im Bereich von nur 2 bis 3 ppm aufwies (bei Atmosphärendruck ohne Belüftung). Die Anzahl an lebensfähigen mikrobiellen Zellen in der Reaktionslösung und auf dem immobilisierten Enzympräparat sowie die Konzentration an Aminosäure , die in der Reaktionslösung gebildet worden war, wurden bestimmt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Hydrolyse von Protein (30°C, pH 3,0)

Wie aus der in Tabelle II angegebenen Zahl an lebensfähigen mikrobiellen Zellen ersichtlich ist, tritt bei dem Verfahren gemäß der Erfindung kein Wachstum der mikrobiellen verunreini genden Stoffe auf, und zwar weder in der Reaktionslösung selbst noch an dem immobilisierten Enzympräparat, selbst wenn die betreffende Umsetzung 4 mal hintereinander wiederholt wird.

Im Gegensatz hierzu wird jedoch bei dem Kontrollverfahren schon bei dem zweiten Wiederholungsversuch ein Wachstum der mikrobiellen verunreinigenden Stoffe festgestellt und die Anzahl an lebensfähigen mikrobiellen Zellen nimmt ständig zu und erreicht nach Beendigung des vierten Wiederholungsver suchs einen Wert von 2,6 x 10⁶/ml.

Aus den vorstehend wiedergegebenen Ergebnissen ist zu ent nehmen, daß unter der optimalen Bedingung für die saure Pro tease bei einem pH-Wert von 3,0 eine mikrobielle Verunreinigung in befriedigender Weise verhindert werden kann, selbst wenn die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Sub stratlösung nur 50 ppm beträgt.

Beispiel 4

Die Hydrolyse von Casein wird wiederholt mittels eines ab satzweisen Verfahrens durchgeführt, wie in Beispiel 3 be schrieben, wobei jedoch eine alkalische Protease eingesetzt wird (Protease P (Hersteller: AMANO SEIYAKU K.K.) , welche auf dem gleichen Träger immobilisiert worden ist, wie in Beispiel 1 beschrieben). Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Substratlösung wurde auf einem Wert von 65 ppm (Druckbeaufschlagung bis zu 1 kg/cm² G durch Belüftung mit Sauerstoff) aufrecht erhalten und es wurde eine Substrat lösung mit einem pH-Wert von 9,0 verwendet. Die Anzahl der lebensfähigen mikrobiellen Zellen der verunreinigenden Stoffe in der Reaktionslösung und auf dem immobilisierten En zympräparat und die Konzentration an erzeugter Aminosäure in der Reaktionslösung wurden in der gleichen Weise bestimmt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Hydrolyse von Protein (30°C, pH 9,0)

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist abzulesen, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren selbst nach vierfacher Wiederho lung der Umsetzung kein Wachstum der mikrobiellen verunreini genden Stoffe beobachtet wird.

Im Gegensatz hierzu zeigt sich bei einer Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Substratlösung von nur 2 bis 3 ppm beim gleichen pH-Wert eine außerordentlich starke mikro bielle Verunreinigung, beginnend mit dem zweiten Wiederholungs versuch.

Beispiel 5

Zu 45 ml einer Lösung von α-Amylase (Amylase AH, Hersteller: AMANO SEIYAKU K.K.) in einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 6,0) , welche so eingestellt war, daß die Enzymkonzentra tion 5% (Gewicht/Volumen) betrug, wurden 5,0 g feuchter Chitopearl-Masse BCW-3510 (Hersteller: Fuji Spinning Co.,Ltd.) zugesetzt. Diese Mischung wurde 3 Stunden lang bei 0°C gerührt, so daß die Amylase von der Chitopearl-Masse adsorbiert wurde. Anschließend wusch man die Masse 7mal mit der gleichen Puffer lösung aus und erhielt so ein immobilisiertes Enzympräparat.

Als Substratlösung wurde eine 10prozentige (Gewicht/Volumen) Lösung von Stärke in einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 6,0) verwendet, welche vorher 5 Minuten lang unter milden Bedingun gen bei 95°C sterilisiert worden war.

Die Hydrolyse der Stärke wurde bei einer Temperatur von 50°C unter mehrfacher Wiederholung der absatzweisen Methode durch geführt, wobei die Konzentration an gelöstem Sauerstoff in der Substratlösung auf einem Wert von 45 ppm (Druckbeaufschlagung bis 1 kg/cm² G mittels Sauerstoffbelüftung) oder von 1,5 ppm (Atmosphärendruck) gehalten wurde. Die Anzahl an lebensfähi gen mikrobiellen Zellen der verunreinigenden Stoffe in der Reaktionslösung und an dem immobilisierten Enzympräparat wur den bestimmt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Hydrolyse von Stärke (50°C, pH 6,0)

Aus den Werten der vorstehenden Tabelle IV in bezug auf die Anzahl an lebensfähigen mikrobiellen Zellen ist ersichtlich, daß es bei der Aufrechterhaltung einer erfindungsgemäßen Kon zentration an gelöstem Sauerstoff in der Substratlösung von 45 ppm kein Wachstum von mikrobiellen Verunreinigungen gibt, und zwar weder in der Reaktionslösung noch auf dem immobili sierten Enzympräparat, selbst nicht nach einer vierfachen Wiederholung. Im Gegensatz hierzu wird bei der unter Atmosphä rendruck durchgeführten Kontrollreaktion schon in der dritten Wiederholungsstufe ein Wachstum der mikrobiellen verunreini genden Substanzen beobachtet und nach Beendigung der vierten Wiederholungsreaktion hat die Anzahl an lebensfähigen mikro biellen Zellen einen Wert von 3,3 x 10³/ml erreicht. Auch die Anzahl der an das immobilisierte Enzympräparat gebundenen mikrobiellen Zellen erreichte einen hohen Wert von 8.5 x 10/ml. Bei Durchführung der Reaktion bei einer Temperatur von 50°C war die Enzymaktivität nach Vervollständigung der Wiederho lungsversuche sowohl beim erfindungsgemäßen Verfahren als auch bei dem Kontrollverfahren etwas abgesunken.

Beispiel 6

Im gleichen Reaktionssystem, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde die Umsetzung bei einer Temperatur von 40°C durchge führt, während gleichzeitig die Konzentration an gelöstem Sauerstoff beim erfindungsgemäßen Verfahren auf einem Wert von 90 ppm gehalten wurde, während die Konzentration beim Kontrollverfahren einen Wert von 2,0 ppm hatte. Die dabei er haltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle V zusammenge faßt.

Tabelle V

Hydrolyse von Stärke (40°C, pH 6,0)

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde weder in der Reak tionslösung noch an dem immobilisierten Enzympräparat ein Wachstum von mikrobiell verunreinigenden Stoffen beobachtet, selbst nicht nach Beendigung des vierten Wiederholungsver suches, und die Enzymaktivität hatte gleichfalls nicht abge nommen.

Beispiel 7 (1) Herstellung einer Enzymquelle und einer Substratlösung

Gemäß der in Beispiel 15 der US-Patentschrift 46 14 719 be schriebenen Verfahrensweise wurde Brevibacterium acetylicum AT-6-7 (ATCC 39311) gezüchtet und abgeerntet. Die so erhalte nen mikrobiellen Zellen wurden mit Aceton getrocknet und dann bei der nachfolgenden Umsetzung als eine Quelle für Nucleo sidphosphorylase eingesetzt.

Als Substratlösung diente eine Lösung von 40 mM 1,2,4-Triazol 3-carboxamid und 60 mM Uridin in einem 8 mM Monokalium-dihy drogenphosphatpuffer (pH 7,0).

(2) Durchführung einer Ribavirin erzeugenden Reaktion

Die wie vorstehend erhaltenen, mit Aceton getrockneten mikro biellen Zellen aus 20 ml einer Anzuchtbrühe und 20 ml der Substratlösung wurden in einen Reaktor der in Fig. 4 darge stellten Art eingefüllt.

Die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 40°C durchgeführt, wobei die Konzentration an gelöstem Sauer stoff in der Substratlösung durch Belüftung auf einem Wert von 110 ppm gehalten wurde. Auf diese Weise wurde in der Reaktionslösung Ribavirin gebildet. Nach Beendigung der Um setzung wurden die mikrobiellen Zellen aus der Reaktionslö sung abzentrifugiert und in einem nächsten Versuchslauf wieder verwendet.

Zur Kontrolle wurde die gleiche Umsetzung unter den gleichen Bedingungen, aber bei Atmosphärendruck durchgeführt.

Es wurde die Anzahl der lebensfähigen mikrobiellen Zellen von Verunreinigungen, die bei 40°C wachsen, und die Ribavirin-Aus beute in der Reaktionslösung nach Ablauf der Reaktion be stimmt (Tabelle VI). Die Ausbeute an Ribavirin wurde berechnet

Wie aus der nachstehenden Tabelle VI ersichtlich ist, wurden bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in keinem Wiederholungsversuch lebensfähige mikrobielle Zellen von Ver unreinigungen festgestellt.

Diese Umsetzung wurde in der beschriebenen Weise wiederholt, wobei jedoch die mit Aceton getrockneten Zellen ersetzt wurden durch immobilisierte Zellen, wobei intakte mikrobielle Zellen von Brevibacterium acetylicum AT-6-7 in einem Calciumalginat gel eingeschlossen worden waren, und es wurden dann die in Tabelle VI wiedergegebenen Ergebnisse erzielt.

Tabelle VI

Hydrolyse von Ribavirin (40°C, pH 7,0)

Claims

1. Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentra tion des in der Reaktionslösung gelösten Sauerstoffs auf einen Wert von mindestens 40 ppm einstellt und während der Umsetzung auf einem Wert von mindestens 40 ppm hält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Konzentration des in der Reaktionslösung gelösten Sauerstoffs auf einen Wert von mindestens 60 ppm einstellt und während der Umsetzung auf einem Wert von mindestens 60 ppm hält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der Reaktionslösung auf höchstens 5 oder mindestens 9 einstellt und die Konzentration des in der Reak tionslösung gelösten Sauerstoffs auf einen Wert im Bereich von 40 bis 60 ppm einstellt und während der Umsetzung auf einem Wert in diesem Bereich hält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Durchführung der enzymatischen Reaktion ein enzymhaltiges Produkt verwendet, welches aus einer Kultur eines Mikroorganismus, aus intakten Zellen eines Mikroorganis mus, aus modifizierten Zellen eines Mikroorganismus und/oder einer Proteinfraktion mit Enzymaktivität ausgewählt ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Durchführung der enzymatischen Reaktion eine Proteinfraktion mit Enzymaktivität verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Durchführung der enzymatischen Reaktion eine Substanz mit der Enzymaktivität einer Transferase, Hydrolase, Lyase, Isomerase oder Synthetase verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Durchführung der enzymatischen Reaktion ein immobilisiertes Enzymprodukt verwendet, welches durch eine an sich bekannte Immobilisierungsbehandlung erhalten worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein immobilisiertes Enzymprodukt verwendet, welches durch eine Vernetzungsbehandlung, eine zur Bindung führende Behand lung oder durch eine Adsorptionsbehandlung erhalten worden ist.

9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß An spruch 1, umfassend einen Reaktor, in welchem die eigentliche Enzymreaktion abläuft, und eine Vorrichtung zur Aufrechterhal tung des erforderlichen Wertes für die Konzentration von in der Reaktions lösung gelöst vorliegendem Sauerstoff.