DE3904416A1 - Fluoreszenzspektralphotometer - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Fluoreszenzspek­ troskopie und insbesondere auf ein Fluoreszenzspektral­ photometer, das zum Messen von polarisiertem Fluoreszenzlicht ausgebildet ist.

Ein Fluoreszenzspektralphotometer beinhaltet im allgemeinen eine Lichtquelle, einen ersten oder Erregermonochromator, eine Probenzelle, die eine zu analysierende Probe enthält, einen zweiten oder Emissionsmonochromator, einen Photodetektor und eine Signalverarbeitungseinrichtung. Der Erregermonochromator wählt Licht einer bestimmten Wellenlänge der Lichtquelle aus und projiziert es auf die Probe in der Zelle. Das resultierende Fluoreszenzlicht wird in den Emissionsmonochromator eingeführt und Fluoreszenz­ licht einer gewählten Wellenlänge wird auf den Photodetektor gerichtet, der ein der Intensität des Fluoreszenzlichtes entsprechendes elektrisches Signal erzeugt.

Um den Polarisationsgrad des Fluoreszenzlichtes mit einem Fluoreszenzspektralphotometer zu messen ist es üblich gewesen, einen Polarisator in den Strahlengang des Erreger­ lichtes von dem Erregermonochromator zu der Probe und einen weiteren Polarisator in den Strahlengang des Fluoreszenz­ lichtes von der Probe zu dem Emissionsmonochromator einzusetzen. Beim Stand der Technik wird beim Messen des Polarisationsgrades des Fluoreszenzlichtes eine Probe mit einer einzigen Art von fluoreszierendem Farbstoff eingefärbt, um den Polarisationgrad von Fluoreszenzlicht einer einzigen Wellenlänge zu messen. Beispielsweise ist es in der Biotechnologie durch die Messung des Polarisations­ grades des von einer mit einem fluoreszierenden Farbstoff eingefärbten Zelle emittierten Fluoreszenzlichtes möglich, den Flüssigkeitsgehalt der Zellenmembran zu erkennen.

Bei dem jüngsten Fortschritt in der Biotechnologie ist es notwendig geworden, den Polarisationsgrad des polarisierten Fluoreszenzlichtes von verschiedenen Teilen einer einzigen Zelle, wie zum Beispiel von der Oberfläche der Zellenmembran oder dem Inneren der Zelle zu messen.

Es ist möglich, verschiedene Teile einer Zelle mit verschiedenen Farbstoffen einzufärben. Aber es sind keine Fluoreszenzspektralphotometer verfügbar, die den Zeitverlauf der Polarisation des Fluoreszenzlichtes messen können und auch den Polarisationsgrad des Fluores­ zenzlichtes verschiedener Wellenlängen, das von der gleichen Probe emittiert wird.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Fluoreszenzspektralphoto­ meter zu entwickeln, das den Zeitverlauf der Polarisation von Fluoreszenzlicht mit mehr als zwei Wellenlängen messen kann, die von einer Probe emittiert sind, die mit mehr als zwei Arten von floureszierenden Farbstoffen eingefärbt ist.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbei­ spielen unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher beschrie­ ben. Es zeigen:

Fig. 1 ein Blockschaltbild des Geräts;

Fig. 2 ein Flußdiagramm, das ein Beispiel für die Arbeitsweise des Geräts zeigt;

Fig. 3 ein Zeitdiagramm, das die Arbeitsweise zeigt;

Fig. 4 ein Diagramm, das die durch die in Fig. 3 gezeigte Arbeitsweise erhaltenen Daten zeigt; und

Fig. 5 ein Blockdiagramm eines Ausführungsbeispiels.

Fig. 1 zeigt schematisch ein Fluoreszenzspektralphotometer, das eine Lichtquelle 1 beinhaltet, einen ersten oder Erregermonochromator 2, der das Licht aus der Lichtquelle 1 in eine Reihe von Wellenlängen aufteilt, von denen eine zur Projektion auf eine Probenzelle 3 ausgewählt wird, die eine zu analysierende Probe enthält, die Fluoreszenzlicht abgibt. Ein zweiter oder Emissionsmonochromator 4 teilt das Fluoreszenzlicht in verschiedene Wellenlängen, die wahlweise einem Detektor 5 zugeführt werden.

Ein erster oder Erregerlichtpolarisator (auch Erregerpo­ larisator genannt) 6 ist im optischen Strahlengang (auch Erregerlichtstrahlengang genannt) Px zwischen dem Erregermonochromator 2 und der Probenzelle 3 angeordnet, und ein zweiter oder Emissionslichtpolarisator (auch Emissionspolarisator genannt) 7 ist im optischen Strahlengang (auch Emissions- oder Fluoreszenzlichtstrah­ lengang genannt) Pm zwischen der Probenzelle 3 und dem Emissionsmonochromator 4 angeordnet.

Eine Monochromatorsteuerung 8 steuert den Erregermono­ chromator 2 und den Emissionsmonochromator 4 synchron so, daß die Erregerlichtwellenlänge des Erregermonochromators 2 und die Emissionslichtwellenlänge des Emissionsmonochro­ mators 4 paarweise auf eine nachfolgend genauer beschriebene Art, geändert werden. Eine Polarisatorsteue­ rung 9 steuert den Erregerpolarisator 6 und den Emissionspolarisator 7 getrennt, um so die Polarisations­ richtung eines jeden der Polarisatoren zwischen zwei orthogonalen Richtungen zu ändern. Die Polarisationsrich­ tung ist die Richtung eines elektrischen Vektors eines Lichtstrahls, der durch den Polarisator hindurchgeht.

Ein Datenprozessor 10 mit einem Vorverstärker des Detektors, einem Abfrage-A/D-Wandler und einem Mikroprozessor empfängt Meßsignale von dem Detektor 5, wenn der Emissionspolarisator 7 auf eine der zwei orthogonalen Polarisationsrichtungen eingestellt ist, und ein Speicher 11 speichert die Daten aus dem Datenprozessor 10. Eine Systemsteuerung 12 steuert die Funktionen der Monochromatorsteuerung 8, der Polarisatorsteuerung 9 und des Datenprozessors 10.

Zur Messung des Polarisationsgrades des polarisierten Fluoreszenzlichtes von einer Probe wird der Erregerpolarisator 6 so eingestellt, daß seine Polarisationsrichtung senkrecht zu einer Ebene ist, die sowohl den Erregerlichtstrahlengang Px als auch den Emissionslichtstrahlengang Pm einschließt, und die Einstellung des Emissionspolarisators 7 wird abwechselnd zwischen zwei orthogonalen Stellungen gewechselt, das heißt einer ersten Stellung, bei der die Polarisationsrichtung des Emissionspolarisators 7 parallel zur Polarisationsrichtung des Erregerpolarisators 6 ist und einer zweiten Stellung, bei der die Polarisationsrichtung des Emissionspolarisators 7 senkrecht zu der Polarisationsrichtung des Erregerpolarisators 6 ist. Bei der ersten Stellung, bei der die Polarisationsrichtungen des Erregerpolarisators 6 und des Emissionspolarisators 7 parallel zueinander sind, kann gesagt werden, daß die Polarisatoren in dem "parallelen" Zustand sind. Bei der zweiten Stellung, bei der die Polarisationsrichtungen der zwei Polarisatoren senkrecht zueinander sind, kann gesagt werden, daß die Polarisation in dem "senkrechten" Zustand sind. Bezeichnet man die Intensität des Fluoreszenzlichtes von der Probe bei dem parallelen Zustand der Polarisatoren mit "Ipar" und die Fluoreszenzlichtintensität bei dem senkrechten Zustand der Polarisatoren mit "Isenk", ist der Polarisationsgrad P gegeben zu:

P = (Ipar - Isenk) : (Ipar + Isenk) (1)

Zur gleichzeitigen Messung des Polarisationsgrades des Fluoreszenzlichtes von einer Probe, die mit zwei Arten von fluoreszierenden Farbstoffen eingefärbt ist, werden die Erregerlichtwellenlänge und die Emissionslicht bzw. Fluoreszenzlichtwellenlänge gleichzeitig geändert, abwechselnd zwischen zwei den zwei floureszierenden Farbstoffen entsprechenden Wellenlängenbedingungen und bei jeder der Wellenlängenbedingungen wird unter Wechseln der Stellung des Emissionspolarisators zwischen den vorangehend genannten orthogonalen Stellungen die Messung des polarisierten Fluoreszenzlichtes von der Probe bei jeder der Polarisatorstellungen durchgeführt, um so den Polarisa­ tionsgrad zu berechnen.

Die Arbeitsweise wird bezugnehmend auf die Fig. 2 und 3 in einem Beispiel genauer beschrieben, bei dem zwischen zwei Wellenlängenbedingungen A und B gewechselt wird, die je eine Erreger- und Emissionswellenlänge vorsehen.

Bei einem Schritt S 1 wird die Erregerwellenlänge des Erregermonochromators 2 auf eine Wellenlänge Ex λ a der Wellenlängenbedingung A eingestellt und die Emissionswellenlänge des Emissionsmonochromators 4 wird auf eine Wellenlänge Em λ a der gleichen Wellenlängenbedin­ gung A eingestellt. Die Monochromatorsteuerung 8 steuert die Einstellung und Änderung der Erreger- und Emissionswellenlängen.

Bei einem Schritt 2, bei dem der Erregerpolarisator 6 in die Stellung senkrecht zu der Ebene festgelegt ist, die den Erreger- und Emissionslichtstrahlengang Px und Pm einschließt, wird der Emissionspolarisator 7 durch die Polarisatorsteuerung 9 in die Stellung eingestellt, bei der die Polarisationsrichtung des Emissionspolarisators 7 "parallel" zu der Polarisationsrichtung des Erregerpolarisators 6 ist. Dann fragt bei einem Schritt S 3 der Datenprozessor 10 die Signale aus dem Detektor 5 ab und führt die verarbeiteten Daten dem Speicher 11 zu.

Dann wird bei einem Schritt S 4 die Stellung des Emissionspolarisators 7 von der Polarisatorsteuerung 9 auf die zweite Stellung geändert, bei der die Polarisations­ richtung des Emissionspolarisators 7 "senkrecht" zu der Polarisationsrichtung des Erregerpolarisators 6 ist, woraufhin bei einem Schritt S 5 der Datenprozessor 10 die Signale aus dem Detektor 5 abfragt und die verarbeiteten Daten dem Speicher 11 zuführt.

Dann wird bei einem Schritt S 6 geprüft, ob die Wellenlängenbedingung die Bedingung A ist oder nicht; wenn die Bedingung A besteht, wird ein Schritt S 7 ausgeführt. Anderenfalls wird zu dem Schritt S 1 zurückgegangen.

Bei dem Schritt S 7 ändert die Monochromatorsteuerung 8 die Wellenlänge des Erregermonochromators 2 und die des Emissionsmonochromators 4 auf die Erregerwellenlänge Ex λ b beziehungsweise die Emissionswellenlänge Em λ b der anderen Wellenlängenbedingung B. Auf diese Weise wechseln die Wellenlängenbedingung.

Bei der Wellenlängenbedingung B wird die Stellung des Emissionspolarisators 7 zwischen den orthogonalen Stellungen geändert, d. h. den Stellungen, bei denen die Polarisationsrichtung des Emissionspolarisators 7 "parallel" bzw. "senkrecht" zu der Polarisationsrichtung des Erregerpolarisators 6 ist, wobei der Datenprozessor 10 die Signale aus dem Detektor 5 abfragt und der Speicher 11 die verarbeiteten Daten speichert (bei den Schritten S 2 bis S 5).

Die Änderung der Wellenlängenbedingungen, die Änderung der Stellung des Emissionspolarisators 7, das Abfragen der Daten aus dem Detektor und das Speichern der Daten in dem Speicher 11 werden unter der Steuerung durch die Systemsteuerung 12 wiederholt.

Auf die vorstehend beschriebene Weise wird unter der Wellenlängenbedingung A die Stellung des Emissionspolari­ sators 7 auf den beiden orthogonalen Stellungen geändert, so daß ein Datensatz erhalten wird, den die Fig. 4 als A zeigt, und auch unter der Wellenlängenbedingung B wird die Stellung des Emissionspolarisators 7 auf den beiden orthogonalen Stellungen geändert, so daß ein weiterer Datensatz erhalten wird, den die Fig. 4 als B zeigt. Diese Daten werden als Daten über den Zeitablauf in dem Speicher 11 gespeichert und der Polarisationsgrad P wird aus den gespeicherten Daten arithmetisch berechnet. Wenn die arithmetische Operation schnell genug ist, ist eine Echtzeitberechnung des Polarisationsgrads möglich.

Anhand der Fig. 5 wird nun ein Ausführungsbeispiel beschrieben. Eine Xenonlampe 1 a wird als Lichtquelle benutzt. Das Licht der Lampe wird durch eine Linsen­ einrichtung 1 b in einem ersten oder Erregermonochromator 2 fokussiert. In einem Erregerlichtstrahlengang Px des monochromatischen Lichtes aus dem Erregermonochromator 2 ist ein erster oder Erregerpolarisator 6 angeordnet, der mittels eines ersten Schrittmotors 20 um eine zu der optischen Achse des Erregerlichtstrahlengangs Px parallele Achse drehbar ist, so daß die Polarisationsrichtung des Erregerlichtes wahlweise auf die zwei orthogonalen Richtungen eingestellt werden kann. Das polarisierte Licht aus dem Erregerpolarisator 6 wird auf eine Zelle 3 projiziert, die eine zu analysierende Probe enthält, woraufhin die Probe Fluoreszenzlicht in jede Richtung emittiert, von dem das auf eine Linse 1 d gerichtete Licht entlang eines Emissionslichtstrahlengangs Pm, der senkrecht zu dem Erregerlichtstrahlengang Px verläuft, durch einen zweiten oder Emissionsmonochromator 4 hindurchtritt. In dem Emissionslichtstrahlengang Pm ist ein zweiter oder Emissionspolarisator 7 angeordnet, der mittels eines zweiten Schrittmotors 21 so drehbar ist, daß Licht mit paralleler oder senkrechter Polarisationsrichtung durch den Emissionspolarisator 7 gemäß der Polarisationsrichtung desselben hindurchtreten kann. Die Schrittmotoren 20 und 21 werden über eine Ein- und Ausgabeschnittstelle 22 von einem Mikrocomputer 23 gesteuert.

Der Emissionsmonochromator 4 teilt das durch den Emissions­ polarisator 7 gelangende polarisierte Fluoreszenzlicht in verschiedene Wellenlängen, von denen eine gewählte von einem Detektor 5 empfangen wird, der eine Photoverviel­ facher-Röhre sein kann. Der Detektor 5 erzeugt ein elektrisches Ausgangssignal entsprechend der Intensität des empfangenen Lichtes, und führt das Ausgangssignal einem Verstärker 24 zu. Das verstärkte Signal wird von einem A/D- Wandler 25 in ein digitales Signal umgesetzt, das mittels einer Ein- und Ausgabeschnittstelle 26 dem Mikrocomputer 23 zugeführt wird.

Der Mikrocomputer 23 beinhaltet eine Zentraleinheit (CPU) 27, einen Schreib-/Lesespeicher 28, einen Festspeicher 29 und einen Taktimpulsgenerator 30, die alle mit einer Sammelleitung 31 verbunden sind. Der Festspeicher 29 speichert verschiedene Programme für den Betrieb des Systems sowie auch ein Programm für die Änderung der Wellenlängen der Monochromatoren 2 und 4, ein Programm zum Ändern der Stellungen der Polarisatoren 6 und 7 und ein Programm für die Abfrage der Meßdaten. Die Zentraleinheit 27 und der Festspeicher 29 entsprechen der Monochromator­ steuerung 8, der Polarisatorsteuerung 9, dem Datenprozessor 10 und der Systemsteuerung 12 in der Anordnung nach Fig. 1 und der Schreib-/Lesespeicher 28 entspricht dem Speicher 11 nach Fig. 1.

Wie oben beschrieben wird für die Messung des Polarisationsgrades die Stellung des Erregerpolarisators 6 so festgelegt, daß dessen Polarisationsrichtung senkrecht zu der Ebene ist, die den Erreger- und den Emissionslicht­ strahlengang Px und Pm einschließt.

Zur Messung der Polarisationscharakteristik des Fluores­ zenzspektralphotometers selbst soll die Polarisations­ richtung des Erregerpolarisators 6 geändert werden. Im einzelnen wird die Polarisationsrichtung des Erregerpo­ larisators 6 von der Stellung senkrecht zu der Ebene, die die Erreger- und Emissionslichtstrahlengänge Px und Pm einschließt, auf die Stellung parallel zu der Ebene geändert und unter Halten des Erregerpolarisators 6 in der parallelen Stellung die Polarisationsrichtung des Emissionspolarisators 7 zwischen den beiden orthogonalen Richtungen "parallel" und "senkrecht" in die Richtung senkrecht zu der Ebene für die Messung der Intensität von Komponenten I′par und I′senk des polarisierten Fluoreszenzlichtes geändert. Die Polarisations­ charakteristik G des Fluorezenzspektralphotometers ist durch folgenden Ausdruck gegeben:

G = I′par : I′senk (2)

Bei G = 1 hat das Fluoreszenzspektralphotometer keine Polarisationscharakteristik.

Wenn die Polarisationscharakteristik G berücksichtigt wird, ist der Polarisationsgrad gegeben durch:

P = (Ipar - G × Isenk) : (Ipar + G × Isenk)

Bei dem Ausführungsbeispiel ist die Probe mit zwei verschiedenen Arten von fluoreszierenden Farbstoffen eingefärbt. Falls drei oder mehr Arten von fluoreszierenden Farbstoffen benutzt werden, ist es auch möglich, das polarisierte Fluoreszenzlicht von einer Probe zu messen, indem man drei oder mehr entsprechende Wellenlängenbedingungen vorsieht, bei denen jeweils die Polarisationsrichtung des Emissionspolarisators zwischen zwei orthogonalen Richtungen wechselt.

In einem Fluoreszenzspektralphotometer mit einer Licht­ quelle, einem Erregermonochromator, einer Probenzelle, einem Emissionsmonochromator, einem Photodetektor und einer Signalverarbeitungseinrichtung sind ein Erregerlichtpolari­ sator und ein Emissionslichtpolarisator in dem Erreger­ lichtstrahlengang bzw. dem Emissionslichtstrahlengang angeordnet und die Erreger- und Emissionslichtwellenlängen der beiden Monochromatoren werden gleichzeitig in Übereinstimmung mit jeder einer Anzahl von Wellenlän­ genbedingungen geändert, bei denen jeweils die Polarisationsrichtung des Emissionslichtpolarisators zwischen zwei orthogonalen Richtungen geändert und das Ausgangssignal des Photodetektors durch die Signalverarbei­ tungseinrichtung abgefragt wird und die verarbeiteten Daten gespeichert werden, die zur Berechnung des Polarisations­ grades des polarisierten Fluoreszenzlichtes von der Probe benutzt werden.

Claims (4)

1. Fluoreszenzspektralphotometer, gekennzeichnet durch eine Lichtquelle (1);
einen Erregermonochromator (2) zum Empfangen des Lichtes von der Lichtquelle (1), und Abgeben von Erregerlicht gewählter Wellenlänge;
eine Probenzelle (3), die eine zu analysierende Probe enthält, auf die das Erregerlicht projiziert wird, damit die Probe Fluoreszenzlicht emittiert;
einen Emissionsmonochromator (4) zum Empfangen des Fluoreszenzlichtes und Abgaben von Emissionslicht gewählter Wellenlänge;
einen Photodetektor (5) zum Umsetzen des Emissionslichtes in ein der Intensität des Emissionslichtes entsprechendes elektrisches Signal;
eine Monochromatorsteuerung (8) zum Einstellen des Erreger­ (2) und des Emissionsmonochromators (4) auf eine gleichzeitige Änderung der Wellenlängen des Erreger- und des Emissionslichtes je nach einer Anzahl von Bedingungen für die Wellenlänge;
einen Erregerlichtpolarisator (6), der im Strahlengang des Erregerlichtes angeordnet ist,
einen Emissionslichtpolarisator (7), der im Strahlengang des Emissionslichtes angeordnet ist;
eine Polarisatorsteuerung (9) zum Einstellen des Emissionslichtpolarisators (7) derart, daß die Polarisa­ tionsrichtung des Emissionslichtpolarisators (7) wahlweise jeweils mit der Richtung parallel und senkrecht zu einer Ebene übereinstimmt, die durch die Strahlen des Erreger- und des Emissionslichtes bestimmt ist, bei jeder der Bedingungen für die Wellenlänge;
eine Signalverarbeitungseinrichtung (10) zum Aufnehmen des Ausgangssignals des Photodetektors (5), jeweils bei Über­ einstimmung der Polarisationsrichtung des Emissionslicht­ polarisators (7) mit der parallelen und senkrechten Richtung und zum Verarbeiten der aufgenommenen Signale; und eine Einrichtung (11) zum Speichern des verarbeiteten Signals.

2. Fluoreszenzspektralphotometer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Erregerlichtpolarisator (6) derart festgelegt ist, daß seine Polarisationsrichtung senkrecht zu der Ebene liegt, die durch die Strahlen des Erreger- und des Emissionslichtes bestimmt ist.

3. Fluoreszenzspektralphotometer nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Einrichtung (9) zum Einstellen des Erregerlichtpolarisators (6) derart, daß die Polarisationsrichtung des Erregerlichtpolarisators (6) wahlweise mit einer von zwei orthogonalen Richtungen übereinstimmt.

4. Fluoreszenzspektralphotometer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine der beiden orthogonalen Richtungen parallel zu der Ebene verläuft, die durch den Erregerlichtstrahl und den Emissionslichtstahl bestimmt ist, während die andere senkrecht zu der Ebene verläuft.