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Bei den in großem Maßstab durchgeführten
Fermentationsverfahren ist es üblich, die Fermentation chargenweise
durchzuführen. In einem solchen Verfahren wird die
Ausgangskultur in einen Fermentor gebracht, der bereits sämtliche der
Nährstoffe enthält, um die gewünschte End-Zellmasse zu
erhalten.
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Im Falle vieler chargenweise durchgeführten
Fermentationen sind die hohen Konzentrationen an den zu Beginn vorliegenden
Ausgangsmaterialien nachteilig für das optimale
Wachstum der Mikroorganismen. Als Folge hiervon ist das
sogekannte Fed-Batch-Verfahren üblich geworden. Im Falle eines
solchen Verfahrens werden die Nährstoffe in dem Maße zugesetzt,
in dem die Fermentation fortschreitet, um die Zellmasse zu
verbessern, die erzeugt wird, oder die
Wachstumsgeschwindigkeit oder andere Parameter.
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Der Fortschritt der rekombinanten DNA-Technologie
hat eine zusätzliche Aufmerksamkeit auf
Fermentationsverfahren gerichtet. Die exogene DNA befindet sich gewöhnlich in
einem Mikroorganismus, der in einem Fermentor gezüchtet
werden muß, um das gewünschte Produkt zu erzeugen. Während der
Wachstumsphase oder später wird die exogene DNA exprimiert
und das gewünschte Produkt erzeugt.
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Gewöhnlich ist der Wirts-Mikroorganismus ein
Escherichia coli oder ein Saccharomyces cerevisiae, obgleich
damit begonnen wird, bestimmte Bacillus-, Pseudomonas- und
Streptomyces-Spezies zu verwenden. Unglücklicherweise jedoch
erzeugen diese Mikroorganismen, wenn sie bei maximal
erzielbarer Geschwindigkeit gezüchtet werden, unerwünschte
Nebenprodukte. Diese Nebenprodukte führen nicht nur zu einer
Diversion des Ausgangsmaterials und der Energie, sondern begrenzen
schließlich auch die Menge an Zellen, die erzeugt werden
können und auch die Geschwindigkeit, mit der sie erzeugt werden.
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Im Falle von E. coli beispielsweise ist es bekannt,
daß ein ungehemmtes Wachstum Essigsäure erzeugt, die wie wir
befunden haben, die logarithmische Wachstumsphase des
Mikroorganismus vorzeitig beendet. Wünschenswert wäre es
deshalb, wenn die logarithmische Wachstumsphase des
Mikroorganismus verlängert werden könnte, insbesondere wenn das
gewünschte Produkt während dieser Phase erzeugt wird.
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Die Steuerung des Verfahrens durch Überwachung der
erzeugten Essigsäure ist nicht praktisch. Zunächst sind
analytische Verfahren für eine On-Line-Messung von Acetat nicht in
zufriedenstellendem Maße entwickelt worden. Von größerer
Bedeutung ist jedoch, daß wir gefunden haben, daß in der Zeit,
in der Acetat festgestellt wurde, sich die Physiologie des
Mikroorganismus bereits geändert hat und daß geringere als
optimale Ergebnisse erzielt werden, wenn die Überwachung zu diesem
Zeitpunkt erfolgt.
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In einer Arbeit von Zabriskie und Acuri, Factors
influencing productivity offermentations employing recombinant
microorganisms, veröffentlicht in Enzyme Microb. Technol.,
Band 8, Seiten 706-717 (1986) wird darauf hingewiesen, daß
Verbesserungen im Falle dieses Fermentationstyps erreicht
werden können, wenn die Wachtstumsgeschwindigkeit auf weniger als
den maximalen Wert beschränkt wird. Um dies zu erreichen, wird
Kohlenstoff-Lieferant mit einer konstanten Geschwindigkeit
zugeführt, die unter der Geschwindigkeit liegt, bei der eine
maximale Wachstumsgeschwindigkeit erfolgt. Im Falle einer
solchen Verfahrensweise unterliegt die Wachstumsgeschwindigkeit
einer dauernden Veränderung, obgleich sie stets unter dem
maximal erzielbaren Wert zu jedem beliebigen Zeitpunkt liegen
mag.
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Wie die Überschrift aussagt, beschreiben Allen und
Luli in einer Arbeit A Gradient-Feed Process for Obtaining
High Cell Densities for Recombinant E. Coli., (1985) ein
Verfahren, bei dem die Einspeisgeschwindigkeit im Falle eines
Fed-Batch-Fermentationsverfahrens im Verlaufe der Fermentation
verändert wird. Periodisch durchgeführte Off-Line-Messungen
der Glukose und der Zelldichte wurden dazu angewandt, um einen
Algorithmus auf den neuesten Stand zu bringen, der dazu
angewandt wurde, um die Einspeisgeschwindigkeit zu berechnen.
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Sachdienliche Merkmale von Fig. 4 dieser
Literaturstelle werden hier in Fig. 2 reproduziert. Im Falle dieser
typischen Fermentation gemäß Allen und Luli, werden drei
verschiedene Wachstumsgeschwindigkeiten beobachtet. Ferner war
die Acetat-Erzeugung, obwohl geringer als in einer
unkontrollierten Fermentation, beträchtlich. Die überschüssige Glukose
war während eines großen Teils der Fermentation bedeutend.
Schließlich erfordert das Verfahren die dauernde Beobachtung
durch Betriebspersonal, und das Verfahren läßt sich nur schwer
mit reproduzierbaren Ergebnissen durchführen. Es ist
offensichtlich, daß,obwohl das Verfahren von Allen und Luli eine
Verbesserung gegenüber dem Stande der Technik darstellt, dennoch
weitere Verbesserungen im Falle des Fed-Batch-Verfahrens für
Mikroorganismen wünschenswert sind.
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Infolgedessen besteht das durch die vorliegende
Erfindung gelöste Problem darin, ein Fed-Batch-Verfahren
bereitzustellen, das die Produktion eines das Wachstum behindernden
Nebenproduktes wesentlich reduziert oder eliminiert, und zwar
so lange wie möglich, unter Verlängerung der logarithmischen
Wachstumsphase.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Fed-Batch-
Verfahren für die Fermentation eines Mikroorganismus
bereitgestellt, bei dem ein Kohlenstofflieferant während des
Verfahrens zugesetzt wird, wobei das Verfahren die folgenden Stufen
aufweist:
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1) kontinuierliche Messung der Menge an Kohlendioxid,
die während der Fermentation erzeugt wird,
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2) Berechnung der spezifischen Wachstumsrate des
Mikroorganismus aus dem erzeugten Kohlendioxid, und
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3) Aufrechterhaltung einer im wesentlichen konstanten
spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit, die geringer ist als
die Wachstumsgeschwindigkeit, die sich ergibt bei einer
hemmenden Akkumulation eines Nebenproduktes durch Veränderung der
Einspeisgeschwindigkeit des Kohlenstofflieferanten.
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Die Fermentation von E. coli ist für die vorliegende
Erfindung illustrativ. Ist während der Fermentation von
E. coli die Wachstumsgeschwindigkeit im wesentlichen konstant
und liegt sie stets unterhalb des Grades, bei dem Acetat
erzeugt wird, so schreitet die logarithmische Wachstumsphase
fort, bis andere Faktoren als das Acetat das Wachstum
beschränken. Dies führt zu einer viel längeren logarithmischen
Wachstumsphase. Eine längere logarithmische Wachstumsphase
führt zu einer höheren Zelldichte und zu einer verbesserten
Produkterzeugung, und zwar insbesondere dann, wenn das
Produkt während der Wachstumsphase erzeugt wird. Zusätzlich wird,
da ein unerwünschtes Nebenprodukt nicht erzeugt wird, die
Ausbeute des Verfahrens verbessert. Kein Kohlenstoff wird zur
Acetatproduktion abgezweigt. Da ferner kein Acetat erzeugt
wird, treten weniger Probleme hinsichtlich der Verwertung des
verbrauchten Mediums auf. Schließlich ist die Steuerung des
Verfahrens durch Anwendung einer Kohlendioxidmessung leichter
als im Falle der Anwendung der Off-Line-Glukose- und
Zelldichtemessung. Eine Steuerung auf Basis von Kohlendioxid kann
leicht On-Line sowie automatisch mittels eines Computers
erfolgen.
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Fig. 1 ist eine Aufzeichnung von sachdienlichen
Daten von einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
Aufgetragen ist das Wachstum von E. coli, die Menge von Acetat
in der Fermentationsbrühe und von Glukose in der
Fermentationsbrühe in Abhängigkeit von der Zeit.
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Fig. 2 ist eine Aufzeichnung ähnlich von Fig. 1
mit der Ausnahme, daß es sich um das Verfahren von Allen und
Luli gemäß der oben zitierten Literaturstelle handelt und
infolgedessen nicht illustrativ für die vorliegende Erfindung
ist.
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Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der auf
Kohlendioxid beruhenden Feed-Back-Steuerung, die im Falle der
Erfindung angewandt wird.
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In der folgenden Beschreibung werden Details im
Falle der Fermentation von E. coli diskutiert, wobei das das
Wachstum inhibierende Nebenprodukt Acetat ist. Festzustellen
ist jedoch, daß die Erfindung auf ein Verfahren unter
Verwendung eines beliebigen Mikroorganismus gerichtet ist,
einschließlich beispielsweise auf Verfahren mit Spezies der
Genera Saccharomyces, z. B. cerevisiae, Bacillus Pseudomonas
und Streptomyces. Obgleich die Betonung der vorliegenden
Beschreibung auf der inhibierenden Wirkung von Acetat liegt, ist
festzustellen, daß die Erfindung dazu angewandt werden kann,
um den Effekt von anderen inhibierenden Materialien zu
reduzieren, wie z. B. von anderen organischen Säuren.
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Fig. 1 ist eine Aufzeichnung der Ergebnisse eines
typischen Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung. Die
Details bezüglich der Fermentation, bei der diese Ergebnisse
erzielt wurden, werden in Beispiel 1 beschrieben. Es ist darauf
hinzuweisen, daß nach einer kurzen anfänglichen
Wachstumsperiode hoher Geschwindigkeit (nicht aufgezeichnet) die
Wachstumsgeschwindigkeit konstant blieb. Während des Verfahrens
wurden dem Medium Proben entnommen und auf Acetat und Glukose
analysiert. Beide dieser Materialien blieben auf einem
niedrigen Niveau während des Verfahrens.
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Fig. 1 steht im Gegensatz zu Fig. 2, die aus den
Daten der oben zitierten Literaturstelle von Allen und Luli
reproduziert wurde. Das bekannte Verfahren schließt ebenfalls
das Wachstum von E. coli ein und verändert die
Zufuhrgeschwindigkeit des Kohlenstofflieferanten. Die
Einspeisgeschwindigkeit wurde jedoch auf Grund von Off-Line-Messungen von Glukose
und der Zelldichte verändert. Es wurde kein Versuch
unternommen, um eine konstante Wachstumsgeschwindigkeit zu erreichen.
Vielmehr wurde die Wachstumsgeschwindigkeit periodisch
reduziert, in einem Versuch, um die erzeugte Acetatmenge zu
vermindern. Als Folge dieser Form der Steuerung wurden drei
Wachstumsgeschwindigkeiten beobachtet und es wurden merkliche
Mengen an Acetat erzeugt. Zusätzlich enthielt das Medium zu
verschiedenen Zeitpunkten überschüssige Glukose.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die
spezifische Wachstumsrate bei einer praktisch konstanten
Geschwindigkeit gehalten, und zwar durch Veränderung der
Einspeisgeschwindigkeit. Steigt die spezifische
Wachstumsgeschwindigkeit auf über die gewünschte Menge an, so wird die
Einspeisgeschwindigkeit vermindert. Liegt umgekehrt die Wachstumsrate
unterhalb der gewünschten Menge, so wird die
Einspeisgeschwindigkeit erhöht.
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Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit wird
definiert als die vorliegende Wachstumsgeschwindigkeit, dividiert
durch die gesamte Wachstumsmenge, die bis zu dem vorliegenden
Zeitpunkt aufgetreten ist. Die spezifische
Wachstumsgeschwindigkeit hat somit die Einheiten von 1/Zeit. Im Falle der Erfindung
wurde angenommen, daß die Geschwindigkeit der
Kohlendioxiderzeugung direkt proportional ist der Wachstumsgeschwindigkeit
und entsprechend daß die Gesamtmenge an erzeugtem Kohlendioxid
direkt proportional ist der gesamten Wachstumsmenge. Dies
bedeutet, daß die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit konstant
unter Anwendung der Kohlendioxid-Daten gesteuert werden kann.
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Kohlendioxid, das in einem Fermentor erzeugt wird,
wird üblicherweise gemessen, weshalb diese Messung im Rahmen
des Könnens des Fachmannes liegt. Eine Methode beruht auf der
Anwendung eines On-Line-Massenspektrometers.
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Die Wachstumsgeschwindigkeit wird bei einer im
wesentlichen konstanten Geschwindigkeit aufrechterhalten, die
geringer ist als die Geschwindigkeit, bei der eine
inhibierende Akkumulation eines das Wachstum hindernden Nebenproduktes
auftritt. Die genaue Wachstumsgeschwindigkeit, die in dem
Verfahren angewandt wird, hängt von dem Mikroorganismus ab, der
gezüchtet wird. Selbst innerhalb einer besonderen Spezies,
z. B. E. coli, variiert die genaue gewünschte Geschwindigkeit
von Stamm zu Stamm und hängt ferner ab von dem angewandten
Medium. Es muß infolgedessen experimentell ermittelt werden.
Methoden zur Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit, bei
welcher inhibierende Produkte erzeugt werden, sind bekannt.
Im Falle einer typischen Methode wird der Mikroorganismus in
einem kontinuierlichen Reaktor unter Gleichgewichtsbedingungen
gezüchtet.
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Dies ist im Stande der Technik bekannt als ein
Chemostat. Chemostaten erfordern lange Zeitspannen, um zu
einem Gleichgewicht zu gelangen und eignen sich infolgedessen
nicht für kommerzielle Zwecke.
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Das Chemostat-Wachstum eines Stammes von
rekombinantem E. coli, das die Wachstumsgeschwindigkeit
veranschaulicht, bei der eine Erzeugung von Acetat beginnt,
wurde publiziert und veranschaulicht ein Verfahren zur
Bestimmung der gewünschten Wachstumsgeschwindigkeit in dem Fed-
Batch-Verfahren der Erfindung. Verwiesen wird auf die Arbeit
von Fiescho und Ritch, publiziert in Chem. Eng. Commun., 45
229-240, 1986. Schwellenwert-Wachstumsgeschwindigkeiten im
Falle anderer Mikroorganismen, die andere das Wachstum
inhibierende Nebenprodukte erzeugen können, können in ähnlicher
Weise bestimmt werden.
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Alternativ kann das vorliegende gesteuerte
Wachstumsgeschwindigkeitsverfahren dazu verwendet werden, um die genaue
Wachstumsgeschwindigkeit für folgende Fermentationen zu
bestimmen. Wird beispielsweise im Falle einer ausgewählten
Wachstumsgeschwindigkeit in einem speziellen Fermentationsprozeß
überschüssiges inhibierendes Nebenprodukt erzeugt, so kann eine
nachfolgende Fermentation bei einer etwas geringeren
Wachstumsgeschwindigkeit durchgeführt werden.
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Zu bemerken ist, daß eine Wachstumsgeschwindigkeit,
die etwas höher ist als die Wachstumsgeschwindigkeit, bei der
keine inhibierende Nebenprodukte erzeugt werden, in manchen
Fällen angewandt werden kann. Was wesentlich ist, ist, daß das
Inhibierende Nebenprodukt mit einer solchen Geschwindigkeit
erzeugt wird, daß es nicht akkumuliert wird zu inhibierenden
Konzentrationen im Verlaufe der Fermentation. In den meisten
Fällen wird es wünschenswert sein, eine
Wachstumsgeschwindigkeit auszuwählen, derart, daß kein inhibierendes Nebenprodukt
erzeugt wird.
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Im Falle der Fig. 3 wird ein Block-Diagramm der
Ausrüstung gezeigt, die zur Durchführung der Steuerung
geeignet ist, die Teil der vorliegenden Erfindung ist. Gezeigt wird
ein Kohlendioxid-Meßgerät 10, bei dem es sich beispielsweise
um ein Massenspektrometer handeln kann. An der Ausgangsseite
dieses Gerätes befindet sich ein Computer 20, der Mittel für
die Berechnung der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit
(SGR) 21 aufweist und logistische Mittel 22 für die Steuerung
des Verfahrens. Die logistischen Mittel 22 können bestehen
aus einem Proportional Integral Controller (PIC), der die
Einspeispumpe 40 steuert. Von dem Kohlendioxid, das in dem
Fermentor 50 erzeugt wird, wird dann eine Probe durch das
Kohlendioxid-Messgerät 10 entnommen, wodurch der Steuer-
Kreislauf vervollständigt wird.
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Im Falle der chargenweisen Fermentation gemäß der
Erfindung ist das Medium, das zur Züchtung des Mikroorganismus
verwendet wird, nicht kritisch. Jede beliebige Kombination von
Bestandteilen kann verwendet werden, von der gefunden wurde,
daß sie für das Wachstum des speziellen Mikroorganismus
geeignet ist. Es ist zweckmäßig, daß das Verhältnis der Bestandteile
in dem Nährmedium derart ist, daß das erhaltene Medium, das
ich in dem Fermentor befindet, bezüglich des
Kohlenstofflieferanten wesentlich beschränkt ist, so daß eine auf Kohlendioxid
beruhende Steuerung effektiv ist. Eine Optimierung des Mediums
liegt im Rahmen des Könnens des Fachmannes. Die Anfangsmenge
an Kohlenstofflieferant im Fermentor zu Beginn sollte niedrig
sein, so daß die Wachstumsgeschwindigkeit früh in den
gewünschten Steuerbereich des Verfahrens fällt.
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Andere Parameter, von denen bekannt ist, daß sie für
Fermentationen wichtig sind, werden in üblicher Weise
gesteuert. Beispielsweise ist es wünschenswert, eine
pH-Werts-Steuerung durchzuführen, eine Steuerung des gelösten Sauerstoffes
und eine Temperatursteuerung.
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Die Erfindung ist besonders geeignet in dem Falle,
in dem ein nützliches Produkt durch den Mikroorganismus
während der Wachstumsphase erzeugt wird, da die Wachstumsphase
erfindungsgemäß ausgedehnt wird. Viele Produkte, die durch
exogene DNA erzeugt werden, fallen unter diese Kategorie. Da
jedoch höhere End-Zelldichten erzielt werden, ist die
Erfindung ferner für die Fälle geeignet, in denen das gewünschte
Produkt während einer späteren stationären Phase erzeugt wird
oder einfach ausgedrückt, wo es erwünscht ist, den
Mikroorganismus in hohen Zelldichten zu erzeugen.
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Im Falle einer Ausführungsform wird die Erfindung
mit einem Mikroorganismus durchgeführt, der exogene DNA für
die Erzeugung von Biotin enthält. Ein derartiger rekombinanter
Mikroorganismus ist E. coli BM4062, der das Plasmid pKa5
enthält, wie er in der PCT-Anmeldung 8 701 391 vom
12. März 1987 beschrieben wird. Unter Anwendung der Erfindung
wurden Biotin-Produktivitäten von 2,2 mg/L-Stunde erreicht,
im Vergleich zu Produktivitäten von 1,0 mg/L-Stunde im Falle
eines üblichen Fed-Batch-Verfahrens. Chemostat-Experimente
zeigten, daß kein Acetat durch diesen Mikroorganismus erzeugt
wurde, wenn die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit unter
etwa 0,1/Stunde bei 30ºC gehalten wurde. Lediglich eine geringe
Menge an Acetat wurde bei einer spezifischen
Wachstumsgeschwindigkeit von 0,2/Stunde erzeugt.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter
veranschaulichen.
BEISPIEL 1
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Es wurde eine Impfkultur für die Inokulation eines
Produktions-Fed-Batch-Fermentors hergestellt. Dieses Verfahren
wurde ausgewählt, um die Erzeugung von Acetat während der
Anfangsphase des Prozesses auf ein Minimum zu reduzieren. Ein
Kolben, der 500 mL des Tankmediums wie unten beschrieben
enthielt, wurde inokuliert mit 0,5 mL eines gefroreren Fläschchens,
das E. coli BM4062 enthielt mit dem Plasmid pKa5. Dieser
Kolben wurde inkubiert unter Rühren bei 200 Umdrehungen pro
Minute 16 Stunden lang bei 30ºC.
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Die optische Dichte der erhaltenen Kultur wurde
beobachtet, und eine Probe der Kultur von ausreichender Größe,
derart, daß das Produkt der optischen Dichte und die mL der Probe
140 betrug (später als mLOD bezeichnet) wurde dazu verwendet,
um einen zweiten Kolben zu inokulieren, der weitere 500 mL des
Tankmediums enthielt. Dies Präparat wurde wiederum unter
Rühren 16 Stunden lang bei 30ºC inkubiert.
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Eine Probe, die 1960 mLOD enthielt, wurde dann dazu
verwendet, um einen 14 Liter fassenden Fed-Batch-Fermentor zu
inokulieren, der 5 Liter des Tankmediums enthielt.
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Der Fed-Batch-Fermentor war mit der Ausrüstung
ausgerüstet, die oben im Zusammenhang mit Fig. 3 beschrieben
wurde. Die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit, errechnet
nach dem entwickelten Kohlendioxid, wurde mittels eines
proportionalen integralen Steuerungsgerätes überwacht, das' sich
in einem Steuerungssystem vom Typ Hewlett Packard A-600
real-time process computer control system befand. Der
proportionale integrale Algorithmus war das digitale Äquivalent des
folgenden:
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Ausgang = K C ε + Ki εdt
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Der Konstrollinstrumentfehler ε wurde erhalten durch Abziehen der
errechneten spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit (von der
Kohlendioxidentwicklung), von der gewünschten spezifischen
Wachstumsgeschwindigkeitseinstellung. Der Ausgang aus dem
Kontrollinstrument wurde dazu verwendet, um die Geschwindigkeit des
Einspeismediums zu verändern, das dem Fermentor zugeführt
wurde. Kc ist der proportionale Gewinn (in diesem Beispiel auf
10 eingestellt), und Ki ist der integrale Gewinn (in diesem
Beispiel auf 0,1 eingestellt). Der Fermentor wurde ferner mit
einem üblichen pH-Meßgerät ausgerüstet, ferner einem Gerät
zur Überwachung von gelöstem Sauerstoff und der Temperatur.
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Da der Fermentor zu Beginn eine Menge an Glukose
enthält, fällt die Wachstumsgeschwindigkeit nicht in den
steuerbaren Bereich von etwa 4 Stunden. Nach dieser Zeitspanne
hält das Kohlendioxid-Steuerungssystem, das im Vorstehenden
beschrieben wurde, die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit
wischen 0,15 und 0,20/Stunde. Wenn die optische Dichte des
Materials im Fermentor 20 erreichte, wurde die Temperatur auf
37ºC erhöht, um die Kopie-Anzahl des Plasmids in dem
Mikroorganismus zu erhöhen. Die Acetatmenge, die bei dieser
Wachstumsgeschwindigkeit erzeugt wurde, war minimal. (Die maximale
Acetat-Konzentration, die erreicht wurde, lag lediglich bei
0,4 g/L nach 34 Stunden.)
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Die Zusammensetzungen des Tankmediums und des
Einspeismediums waren wie folgt:
TABELLE I Zusammensetzung der Medien
Tank-Medien Einspeis-Medien Glukose Methionin Thiamin·HCl Histidin Vitamin-Lösung Spurenmetalle Ampicillin Alanin Folsäure Pyridoxin·HCl Riboflavin Pantothensäure Calcium Salz Nicotinsäure Spurenmetall-Lösung Na&sub3; Citrat·2H&sub2;O
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Die Ergebnisse sind in Fig. 1 zusammengestellt.
Die logarithmische Wachstumsphase setzte sich über 34 Stunden
lang fort, und die Zellen erreichten eine optische Dichte von
110. (Im Falle der Figur sind Zellen-Trockengewichte
aufgetragen. Die Beziehung zwischen Zellen-Trockengewicht und
optischer Dichte ist ein Faktor von etwa 2. Dies bedeutet, daß
beispielsweise, wenn das Zellen-Trockengewicht 60 beträgt, die
entsprechende optische Dichte des entsprechenden
Fermentationsmediums bei etwa 120 liegt.) Die Biotin-Produktion lag im
Mittel bei 2,2 mg/L-Stunde.
BEISPIEL 2
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Dies ist ein Vergleichsbeispiel.
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Beispiel 1 wurde wiederholt bis zu dem Punkt, an dem
die Impfkultur in den Fed-Batch-Fermentor eingebracht wurde.
Die Fermentation wurde durchgeführt. Anstatt jedoch die
Wachstumsgeschwindigkeit zu überwachen, war die
Einspeisgeschwindigkeit gerade genügend, um eine stoichiometrische Menge an
Glukose, bezogen auf den Kohlendioxidverbrauch, zuzuführen.
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Die Ergebnisse waren derart, daß sich die
logarithfische Wachstumsphase lediglich etwa 20 Stunden lang
fortsetzte, daß die Zellen eine optische Dichte von lediglich etwa
60 erreichten und daß die Biotin-Produktion im Mittel bei
lediglich etwa 1,0 g/L-Stunde lag, bei einer Fermentationsdauer
von 34 Stunden. Die Acetat-Produktion war während der ersten
15 Stunden des Verfahrens beträchtlich.