DE3819604A1 - Verfahren und einrichtung zur erzeugung von phasenkontrastbildern - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Einrichtung zur Erzeugung von Phasenkontrastbildern mit einem das Objekt punkt­ förmig abrasternden Lichtmikroskop.

Licht-Raster-Mikroskope, die oft auch als "Laser-Scan- Mikroskope" bezeichnet werden, sind bereits seit längerer Zeit bekannt. So ist beispielsweise im "Journal of Microscopy, Vol. 138, Pt 1, (April 1985) auf den Seiten 29-34 ein Licht-Raster­ mikroskop mit konfokalem Aufbau beschrieben, welches die Objektabtastung mit Hilfe eines bewegten Tisches durchführt. Die Optik dieses Mikroskops steht fest und ist so ausgelegt, daß ein möglichst kleiner beugungsbegrenzt fokussierter Licht­ punkt in der Objektebene erzeugt wird. Zur Sammlung des durch das Objekt hindurchtretenden Lichtes dient ein Kondensor in Form eines zweiten Objektivs. Hinter diesem Objektiv ist dann nach entsprechender Strahlumlenkung der Photomultiplier ange­ bracht, dessen Signale zur Darstellung des Objektbildes auf einem Monitor dienen.

Ein Raster-Lichtmikroskop mit einem etwas anderen Aufbau ist aus der Firmenschrift W 41-910d "Laser-Scan-Microscop: ein optisches Rastermikroskop" der Anmelderin, Druckvermerk IX/84 bekannt. In diesem Rastermikroskop wird der für die Abtastung verwendete Laserstrahl selbst über das feststehende Objekt bewegt. Der Aufbau dieses Raster-Lichtmikroskopes ist in Fig. 1 dargestellt und wird noch im Zusammenhang mit dieser Figur nachstehend beschrieben.

Bei konventionellen Mikroskopen ist der "Phasenkontrast nach Zernicke" eine bereits seit langem eingeführte Kontrastierungsmethode. Die Theorie und Praxis dieses Verfahrens ist beispielsweise sehr ausführlich in dem Buch von Dr. H. Beyer, "Theorie und Praxis des Phasenkontrastsver­ fahrens", Akademische Verlagsgesellschaft Frankfurt/Main 1965, beschrieben. Das Verfahren besteht kurz gesagt darin, eine ringförmige Blendenöffnung in der hinteren Brennebene des Kondensors eines Durchlichtmikroskopes auf eine entsprechend ringförmige Phasenplatte in der Pupille des verwendeten Objektivs abzubilden. Das Phasenkontrastbild entsteht durch Interferenz des direkt durch das Objekt und die Phasenplatte hindurchgehenden Lichtes mit dem am Objekt gebeugten, neben dem Phasenring durch das Objektiv gehenden Lichtes. Eine komprimierte Darstellung dieses Effektes findet sich auch im ABC der Optik, Herausgeber Karl Mütze, Verlag Werner Dausien Hanau/Main 1961 auf den Seiten 634 bis 638.

In ihrem Buch "Theorie and Practice of Scanning Optical Microscopy", Academic Press 1984 haben T. Wilson und C. Sheppard beschrieben, daß das Phasenkontrastverfahren nach Zernicke auch auf Licht-Rastermikroskope angewendet werden kann. Hierbei wurde der gleiche, bereits aus der konventionellen Mikroskopie bekannte Aufbau unter Verwendung eines Kondensors und einer ringförmigen Blendenöffnung in dessen hinterer Brennebene vorausgesetzt. Diesen Aufbau verwendet auch das vorstehend beschriebene, aus der Firmenschrift W 41-910d bekannte Licht-Rastermikroskop zur Erzeugung von Phasenkontrastbildern.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein für die Anwendung auf Licht-Rastermikroskopen geeignetes Kontrastierungsverfahren zu schaffen, das einen geringeren Aufwand erfordert.

Diese Aufgabe wird durch die im Kennzeichen des Anspruches 1 genannten Merkmale bzw. durch ein Gerät mit dem im Kennzeichen des Anspruches 2 angegebenen Merkmalen gelöst.

Die Erfindung macht von der überraschenden Erkenntnis Gebrauch, daß in Licht-Rastermikroskopen zur Realisierung von Phasenkontrastbildern auf den Kondensor verzichtet werden kann.

Es ist lediglich erforderlich, eine an die Form der phasenschiebenden Bereiche im Objektiv angepaßte Blende mit nachgeschaltetem Detektor oder einen Detektor, dessen photoempfindliche Fläche auf die Form der phasenschiebenden Bereiche abgestimmt ist, an geeigneter Stelle direkt unterhalb der Objektebene anzubringen.

Es hat sich gezeigt, daß dieser neue Aufbau ohne Kondensor sowohl für Geräte geeignet ist, die mit Strahlscanning arbeiten, d.h. die das Beleuchtungslichtbündel über das abzubildende Objekt führen, als auch für Geräte, bei denen die Abtastbewegung mit Hilfe des Objekttisches durchgeführt wird. Die genaue Position von Ringblende und Detektor relativ zur Objektebene ist unkritisch, solange die Ringblende mit ihren Radien an den Hohlkegel angepaßt ist, der durch die Phasenplatte und das Objektiv definiert ist. Diese Anpassung läßt sich berechnen oder experimentell durchführen.

Zwar sind die geometrischen Beziehungen von der Apertur und dem Abbildungsmaßstab des verwendeten Objektivs abhängig, für unterschiedliche Objektive lassen sich jedoch immer Lösungen finden, indem entweder die Blende bzw. die ringförmige Detektorfläche in unterschiedliche Abstände zum Objekt gebracht wird, oder entsprechend mehrere Blenden mit unterschiedlichem Ringdurchmesser und unterschiedlicher Ringweite z.B. auf einem Revolver eingesetzt werden.

Die Erfindung ermöglicht es somit, zur Realisierung von Phasenkontrast bei Licht-Rastermikroskopen vollständig auf einen Kondensor zu verzichten, ohne daß eine Einbuße an Bildqualität eintritt.

Das Verfahren ist deshalb nicht nur für Lichtmikroskope ge­ eignet, die im sichtbaren Spektralbereich arbeiten, sondern insbesondere auch für die Röntgenmikroskopie geeignet. Denn dort ist es ohnehin sehr schwierig, Kondensoren mit ausreichend hoher Transmission herzustellen.

Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Fig. 1-8 der beigefügten Zeichnungen.

Fig. 1 Zeigt eine Prinzipskizze eines an sich bekannten, mit Strahlscanning arbeitenden Licht-Rastermikroskopes;

Fig. 2 zeigt die wesentlichen optischen Komponenten zur Erzeugung eines Phasenkontrastbildes in einem Licht- Rastermikroskop mit Tisch-Scanning;

Fig. 3 zeigt die wesentlichen optischen Komponenten zur Erzeugung eines Phasenkontrastbildes in einem Licht-Rastermikroskop mit Strahl-Scanning;

Fig. 4 zeigt in vergrößerter Aufsicht einen alternativ zum Detektor (36) bzw. (136) in Fig. 2 bzw. Fig. 3 verwendbaren Detektor;

Fig. 5 zeigt die optischen Komponenten zur Erzeugung eines Phasenkontrastbildes in einem Raster-Lichtmikroskop, wobei im Vergleich zu Fig. 2 ein Objektiv mit kürzerer Brennweite verwendet ist;

Fig. 6 ist das Bild eines Objektes im Phasenkontrast, aufgenommen in konventioneller Technik mit Hilfe eines Kondensors;

Fig. 7 zeigt das Objekt aus Fig. 6, aufgenommen mit dem in Fig. 3 skizzierten Aufbau;

Fig. 8 zeigt das gleiche Objekt wie in Fig. 7 in defokussiertem Zustand.

In Fig. 1 ist das aus der vorstehend genannten Firmenschrift W 41-910d der Anmelderin bekannte Licht-Rastermikroskop dargestellt. Dieses hat folgenden Aufbau:

Der Strahl eines z.B. Argon-Lasers (1) wird nach Umlenkung an einem Spiegel (2) von einer Teleskopoptik (3, 4) aufgeweitet und einem Abtastsystem (8) bestehend aus zwei senkrecht zueinander verschwenkbaren Spiegeln zugeführt. Der von diesen Spiegeln zyklisch abgelenkte Lichtstrahl wird dann von einem Strahl­ teiler (11) in den Beobachtungsstrahlengang eines Mikroskops eingespiegelt und von einem Objektiv (12) auf die Probe (13) fokussiert. Die Linse (9) dient zur Abbildung des Abtastsystems (8) in das Objektiv (12). Mit (22) und (23) sind Lampe und Kollektor eines Hilfsbeleuchtungssystems bezeichnet, das mittels eines weiteren Strahlteilers (10) koaxial dem Strahl des Lasers (1) überlagert wird. Dies ermöglicht eine konventionelle mikroskopische Beobachtung des Objektes (13) über den vereinfacht dargestellten Beobachtungsstrahlengang bestehend aus einer Tubuslinse (24), einem Umlenkprisma (25) und einem Okular (26).

Zur rastermikroskopischen Darstellung des Objekts (13) ist ein erster Detektor (7) im Auflichtstrahlengang vorgesehen, der hinter einer Linse (29) und einem Filter (6) angeordnet ist und beispielsweise die von der Probe emittierte und vom Objektiv (12) gesammelte Strahlung nach Rückführung über die Ablenkeinheit (8) nachweist. Der Detektor (7) befindet sich in einem durch den Strahlteiler (5) zwischen der Aufweitungsoptik (3/4) und der Abtasteinrichtung (8) ausgespiegelten Teilstrahlengang.

Zum Nachweis des von der Probe (13) vorwärts in Strahlrichtung gestreuten Lichtes im Durchlicht ist ein zweiter Detektor (27) vorgesehen. Dieser befindet sich ebenfalls in einem durch den Strahlteiler (18) aus dem Durchlicht-Hilfsbeleuchtungsstrahlen­ gang des Mikroskopes ausgespiegelten Teilstrahlengang hinter einer Linse (19). Der Strahlengang der Durchlicht-Hilfsbe­ leuchtung besteht aus einer Lampe (21), einem Kollektor (20) einer Linse (17), einem Umlenkspiegel (16) und einem Kondensor (14) unterhalb der Probe (13).

Die Signale der beiden Detektoren (7) und (27) werden einem Monitor (28) mit angeschlossenen Bildspeicher zugeführt, der außerdem mit den Schwenkspiegeln der Abtasteinrichtung (8) synchronisiert ist, und zur wahlweisen Darstellung eines Auflicht- und eines Durchlichtbildes dient.

Zur Darstellung von Phasenkontrastbildern im Durchlicht besitzt der Kondensor (14) dieses bekannten Licht-Rastermikroskop ebenso wie der Kondensor bei einem herkömmlichen Mikroskop entsprechend ringförmigen Blendenöffnungen in seiner hinteren Brennebene.

Gemäß der Erfindung ist nun vorgesehen, auf diesen Kondensor (14) und die nachgeschaltete Optik (15-19) zu verzichten. Zur Erläuterung wird hierbei auf die Fig. 2 und 3 Bezug genommen. In Fig. 2 ist das Objektiv eines Licht- Rastermikroskops vereinfacht als Linse (31) dargestellt und mit (32) ist die in Phasenkontrast-Objektiven vorhandene Phasenplatte mit dem Phasenring (33) bezeichnet. Üblicherweise ist der Phasenring (33) auch anstatt auf einer zusätzlichen Glasplatte direkt auf eine Linse des Objektivs aufgedampft.

Hinter der Objektebene (34), in der das Objektiv (31) den abrasternden Lichtstrahl beugungsbegrenzt fokussiert, ist unter einem Abstand (a) eine Ringblende (35) und direkt dahinter ein photoelektrischer Detektor (36) mit relativ großflächiger photoempfindlicher Fläche angeordnet. Bei dem Detektor handelt es sich beispielsweise um eine Diode des Typs "PIN 10 D" der Firma UDT. Diese Detektordiode besitzt eine photoempfindliche Fläche mit einem Durchmesser von 11,3 mm.

Der durch den Phasenring (33) hindurchgehende Strahlkegel (37) ist gestrichelt dargestellt. Der Abstand (a) zwischen der Blende (35) und der Objektebene (34) und der Durchmesser (c) der ringförmigen Blendenöffnung (38) sind so gewählt, daß dieser Strahlkegel (37) die Blendenöffnung (38) passiert und innerhalb des photoempfindlichen Bereiches auf die Detektor­ diode (36) auftrifft.

Es ist nun möglich, Phasenkontrastbilder zu erhalten, wenn man das zu untersuchende mikroskopische Objekt in der Objektebene (34) rasterförmig bewegt und die Signale des Detektors (36) zur Bilddarstellung benutzt. Die Position von Ringblende (35) und Detektor (36) relativ zur Objektebene ist unkritisch, solange durch geeignete Wahl von (a) und (c) dafür gesorgt ist, daß der durch die Phasenplatte (32) und das Objektiv (31) definierte Strahlkegel (37) die Blendenöffnung (38) durchsetzt. Zur Unter­ drückung von Störlicht aus der Umgebung kann über oder unter der Blende (35) ein Interferenzfilter angeordnet werden.

Es hat sich außerdem gezeigt, daß sich Phasenkontrastbilder auch dann erzeugen lassen, wenn nicht das Objekt selbst bewegt wird, sondern der Laserstrahl selbst über das feststehende Objekt geführt wird. Diese Situation ist in Fig. 3 darge­ stellt. In Fig. 3 sind die gleichen Bauelemente verwendet wie im Ausführungsbeispiel nach Fig. 2 und entsprechend mit einer um die Zahl hundert erhöhten Bezugsziffer versehen. Obwohl bei einem solchen Aufbau dadurch, daß der Laserstrahl bewegt wird, - dies ist durch den Doppelpfeil (A) angedeutet - im Zuge des Abtastvorganges eine teilweise Beschneidung des durch den Phasenring (133) hindurchgehenden Strahlkegels (137) stattfindet, ist ein Einfluß auf die Qualität eines auf diese Weise erzeugten Phasenkontrastbildes nicht feststellbar. Dies läßt sich dadurch erklären, daß sich der Strahlkegel (137) beispielsweise bei Verwendung eines Objektivs der Anmelderin vom Typ Planapochromat 40/0.95 PH3 auf dem Detektor im Zuge des Scan-Vorganges um weniger als 0,1 mm um die Mittellage herum schwankt. Da die Breite der ringförmigen Blendenöffnung (38) im gegebenen Fall zwei Millimeter beträgt, fällt der geringe An­ teil des beschnittenen Lichtes nicht ins Gewicht.

Es ist klar, daß der Durchmesser (c) bzw. die Entfernung (a) der Blende (35) dann geändert werden muß, wenn ein Objektiv mit anderer Apertur bzw. anderen Abmessungen des Phasenringes be­ nutzt werden soll. Dieser Fall ist in Fig. 5 dargestellt. Hier befindet sich der Detektor (46) und die vorgeschaltete Blende (45) bei gleichem Durchmesser (c) der Blendenöffnung (48) in einem im Vergleich zu Fig. 3/4 geringerem Abstand (b) unterhalb der Objektebene (44), um die Anpassung an den durch den Phasen­ ring (43) hindurchgehenden und von einem Objektiv (41) mit höherer Apertur und kleinerer Brennweite fokussierten Strahl­ kegel sicherzustellen. Bereits aus diesen Geometriebe­ trachtungen erkennt man, daß es statt dessen auch möglich ist, die Anpassung unter Beibehaltung des Abstandes zwischen Blende und Objektebene über den Durchmesser und die Breite der ring­ förmigen Blendenöffnung (48) vorzunehmen und hierfür beispiels­ weise mehrere Blenden mit unterschiedlichen Abmessungen auf einem Revolver anzuordnen.

Weiterhin ist es möglich, auf eine vorgeschaltete Blende ganz zu verzichten, wenn wie in Fig. 4 dargestellt, ein Detektor (40) verwendet wird, dessen lichtempfindliche Fläche (39) be­ reits ringförmig ist. Derartige Detektoren sind beispielsweise von der Firma EG & G Reticon unter der Bezeichnung "Circular Array RO0720B" bzw. "Self-Scanned Circular Photodiode Array RO0064N" erhältlich. Diese Detektoren bestehen aus mehreren Einzeldioden in der ringförmigen Anordnung und erlauben daher, nicht nur die integral auf die Kreisfläche auffallende Intensität für das Phasenkontrastbild heranzuziehen sondern auch vorwählbare Winkelbereiche auszuwählen. Dies ermöglicht zusätzliche, vorteilhafte Kontrastierungsmethoden ähnlich der sogenannten einseitig schiefen Beleuchtung etc.

In den Fig. 6-8 sind Phasenkontrastbilder dargestellt, die nach dem Stand der Technik bzw. gemäß der vorliegenden Er­ findung aufgenommen wurden. Als Objekt diente der Schnitt einer jungen Forelle (quergeschnitten). Das Bild gemäß Fig. 6 wurde aufgenommen mit dem anhand von Fig. 1 beschriebenen Laser- Scan-Mikroskop der Anmelderin mit einem Objektiv Planapochromat (40/0.95) und einem Kondensor, dessen Revolver auf den Phasen­ ring "Nr. 3" eingestellt war. Der elektronische Zoom des Laser-Scan-Mikroskops war auf einen Vergrößerungsfaktor von 45 x eingestellt, so daß der Abbildungsmaßstab insgesamt ca. 1350 x betrug.

Das Bild nach Fig. 7 wurde am gleichen Mikroskop mit der gleichen Einstellung aufgenommen mit dem Unterschied, daß der Kondensor entfernt, der Photomultiplier (27) aus Fig. 1 abge­ schaltet und statt dessen die Anordnung nach Fig. 2 bzw. Fig. 3 mit dem vorgenannten Detektor "PIN 10D der Fa. UDI zur Aufnahme des Phasenkontrastbildes gewählt wurde. Wie man er­ kennt ergibt sich ein Phasenkontrastbild in gleich guter Qualität.

Anschließend wurde dann aus der Objektebene heraus de­ fokussiert. Das resultierende Bild zeigt Fig. 8. Wie man erkennt findet eine Kontrastumkehr im Bild statt, wie dies auch im Phasenkontrast der konventionellen Mikroskopie der Fall ist.

Claims (10)

1. Verfahren zur Erzeugung von Phasenkontrastbildern mit einem das Objekt punktförmig abrasternden Lichtmikroskop, wobei zur Beleuchtung des Objekts ein Objektiv (31, 41, 131) mit phasenschiebenden Bereichen in der Nähe einer Pupillenebene verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß das vom Objekt gebeugte Licht unter Vermeidung sammelnder Optik direkt von einem an die Geometrie der phasenschiebenden Bereiche (33, 43, 133) angepaßten, photoelektrischen Detektor (36, 46, 146) nachgewiesen wird.

2. Licht-Rastermikroskop zur punktweisen Abtastung von Objekten mittels eines durch ein Objektiv fokussierten Laserstrahles und einer photoelektrischen Nachweiseinrichtung für das vom Objekt kommende Licht, wobei das Objektiv (31, 41, 131) phasenschiebende Elemente (33, 43, 133) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (36, 46, 146) der Nachweiseinrichtung ohne vorgeschaltete Kondensoroptik in Lichtrichtung gesehen hinter der Objektebene (34, 44, 134) angeordnet ist und die Form der photoempfindlichen Fläche des Detektors der Geometrie der phasenschiebenden Elemente angepaßt ist.

3. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das phasenschiebende Element (33, 43, 133) im Objektiv (31, 41, 131) und die effektive photoempfindliche Fläche (Blendenöffnung 38, 48, 138; 39) des Detektors (36, 46, 136, 40) ringförmig sind.

4. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem Detektor (36, 46, 136) zur Anpassung seiner photoempfindlichen Fläche an die Geometrie der phasenschiebenden Elemente (33, 43, 133) eine Blende (35, 45, 135) vorgeschaltet ist.

5. Mikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Blenden (35, 45) in verschiedenen Abständen (a, b) vorgesehen sind.

6. Mikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Blenden mit unterschiedlichem Durchmesser bzw. unterschiedlicher Dicke der ringförmigen Blendenöffnung auf einem Revolver angeordnet sind.

7. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (40) ein Halbleitersensor mit ringförmiger photo­ elektrischer Fläche (39) ist, die aus mehreren Einzel­ elementen besteht.

8. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur punktweisen Abtastung des Objektes eine den Laserstrahl ablenkende Scanningeinrichtung vorgesehen ist.

9. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur punktweisen Abtastung des Objektes eine Einrichtung zur rasterförmigen Bewegung des Objektträgers vorgesehen ist.

10. Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Unterdrückung von Umgebungslicht dem Detektor ein Filter vorgeschaltet ist.