DE3784058T2 - Hybridisierungs-test und vorrichtungen zur durchfuehrung dieses tests. - Google Patents
Hybridisierungs-test und vorrichtungen zur durchfuehrung dieses tests.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft einen Hybridisierungstest, bei dem Nucleinsäuresonden, die mit Lantanidenchelaten, die zeitverzögerte Fluoreszenz zeigen, markiert sind, verwendet werden.
- Markierte Nucleinsäuren wurden unverzichtbar in Hybridisierungstests, die sowohl in vitro als auch bei der hybridocytochemischen Mikroskopie in vivo durchgeführt werden. Eine geeignete Markierung der Nucleinsäuren ist ein wesentlicher Punkt bei ihrer Sequenzierung, und Anwendungen können sich auch bei den verschiedenen Methoden der Nucleinsäuretrennung finden. Heutzutage wurden die meisten Bemühungen, empfindlichere Marker zu finden, auf dem Gebiet der Hybridisierungssonden zur Detektion spezifischer, komplementärer Nucleinsäuresequenzen vorgenommen. Dies ist angesichts der großen Bedeutung solcher Test in der Medizin und Molekularbiologie natürlich.
- DNA und RNA können auf verschiedenen Wegen markiert werden. Im allgemeinen können alle Marker direkt detektiert werden, d.h. der Marker, der an die Nucleinsäure gebunden ist, ist selbst nachweisbar oder indirekt, wenn der Marker an einer oder mehreren Reaktionen beteiligt ist, wodurch nachweisbare Produkte erzeugt werden.
- Verschiedene neue Markierungsverfahren wurden jüngst verfügbar. Trotz vieler Unterschiede können sie auf der Basis ihrer Hauptkriterien systematisiert werden. In der Nucleinsäuretechnologie ist ein üblicher Name für die unterschiedlichen Marker "Reportergruppe".
- Nucleinsäuren werden üblicherweise mit den Radioisotopen ³²P, ¹²&sup5;I, ³H oder fluoreszenten Markern markiert. Insbesondere in Routineanalysen wird das radioaktive Material gern durch nicht-radioaktive Marker wegen der ernstzunehmenden Nachteile, die mit der Verwendung von radioaktiven Markern verbunden sind, ersetzt. Probleme bezüglich der Sicherheit und der Entsorgung sind offensichtlich, aber die niedrige Stabilität der Materialien mit hoher spezifischer Aktivität zusammen mit ihren hohen Kosten sollten auch nicht vergessen werden.
- Theoretisch eignen sich fluoreszente Verbindungen ideal für den Ersatz radioaktiver Isotope. Bis heute sind die einzigen Beispiele für solche fluoreszenten Marker, die bei der DNA-Markierung verwendet werden, Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot und NBD. Die berechnete hohe Empfindlichkeit, die unter Verwendung dieser Reagenzienarten erreicht werden könnte, wird jedoch in großem Ausmaß durch die Tatsache begrenzt, daß die meisten biologischen Proben einschließlich Proteine ebenfalls fluoreszieren und somit den Hintergrund auf eine nicht immer annehmbare Höhe bringen.
- Nucleinsäuren werden mit unterschiedlichen Proteinen, die enzymatische Aktivitäten besitzen, markiert, z.B. alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase. Die anschließende Reaktion des geeigneten Substrats, die durch das angeheftete Enzym katalysiert wird, erzeugt üblicherweise ein leicht nachweisbares, gefärbtes Produkt. Es wird ständig betont, daß ein Vorteil eines solchen Systems die Tatsache ist, daß keine Notwendigkeit für einen Detektionsapparat besteht, aber diese Tatsache kann auch als Nachteil gesehen werden, da die visuelle Technik für die quantitative Analyse nicht gut geeignet ist.
- Die Art, in der Reportergruppen an Nucleinsäuren gebunden sind, kann als weiteres Kriterium der Unterscheidung der Markierungstechniken dienen.
- Direkte Befestigung bedeutet, daß der detektierbare Marker an die Nucleinsäure bereits bevor ein spezieller analytischer Prozeß stattfindet, gebunden ist. Der Marker kann an die Nucleinsäure enzymatisch, wie bei der radioaktiven Markierung unter Verwendung von DNA-Kinase und γ-³²P-ATP oder durch Verwendung verschiedener α-³²P-Nucleosidtriphosphate in dem Nick-Translationsverfahren gekoppelt werden. Ein geeignet aktivierter Marker, der mit jeder beliebigen vorhandenen oder geschaffenen Funktion an den Nucleinsäuren reagieren kann, kann auch chemisch an die Nucleinsäuren befestigt werden.
- Indirekte Befestigung der detektierbaren Gruppe an Nucleinsäuren kann nach verschiedenen Verfahren durchgeführt werden. Unter den am häufigsten verwendeten Verfahren ist die Markierung der Nucleinsäuren mit einem Hapten, was sie auf immunologischem Weg detektierbar macht.
- Fluorescein wurde vorgeschlagen und später auch eine Trinitrophenylgruppe (TNP) als Haptene, weil Antikörper mit hoher Affinität zu diesen Haptenen gut untersucht und leicht erhältlich waren. Jedoch machten die Komplexizität der Nucleinsäurederivatisierung zusammen mit einem ziemlich komplexen Detektionssystem, die Probleme bezüglich der Reinigung einiger der Verbindungen und eine relativ niedrige Empfindlichkeit des Assays diese Technik ziemlich unattraktiv.
- N-Acetoxy-N-2-acetaminofluoren (AAF) wurde zur chemischen Modifizierung von Nucleinsäuren für eine empfindliche kolorimetrische Detektion der Ziel-DNA unter Verwendung spezifischer Antikörper und eines mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase konjugierten zweiten Antikörpers verwendet.
- Angesichts der stark karzinogenen Eigenschaften von AAF wurden andere Markerarten erprobt. Somit wurde Biotin chemisch an Desoxyribonucleotiden befestigt, und diese Nucleotide wurden in die DNA durch Nick- Translation eingeführt. Ein Einstrangteil der Biotin-DNA wurde somit als Hybridisierungssonde verwendet. Um doppelsträngige DNA, an deren einen Strang Biotin oder ein Hapten gebunden ist, zu detektieren, wurden Avidin bzw. Antihapten-Antikörper verwendet, wobei das Protein entweder durch Fluoreszenzmarker markiert ist, oder es wurde nach typischen immunologischen Verfahren detektiert. Das aufwendige Verfahren der Derivatisierung der DNA mit Biotin wurde durch Einführen eines fotoaktivierbaren Analogons von Biotin zur Markierung der Nucleinsäuren vereinfacht. Jedoch ist die Anzahl an Biotingruppen, die in das DNA-Molekül eingeführt werden kann, in beiden Verfahren beschränkt. Es wurde darauf hingewiesen, daß die Technik extrem schwierig erfolgreich durchzuführen ist, und daß die erhaltenen Ergebnisse ziemlich variabel sind. Das Verfahren ist daher extrem unzuverlässig und stellt keine Basis für eine routinemäßige Polynucleotidsequenzdetektion dar. Daher war die Überlegung, biotin-markierte Histone mit einzelsträngigen Nucleinsäuren mit Glutaraldehyd querzuvernetzen, sehr interessant. Jedoch war trotz der Möglichkeit einer wesentlichen Erhöhung des Biotingehalts die Empfindlichkeit des Assays nicht hoch genug.
- Es ist offensichtlich, daß bei der Entwicklung von Hybridisierungssonden alle Markierungsverfahren auf der Basis einer statischen Derivatisierung der exocyclischen Aminofunktion in den Nucleinsäuren mit einem geeigneten Marker Polydesoxynucleinsäuren verwenden müssen. Die kurze DNA-Sequenz, beispielsweise eine Oligo-DNA-Sequenz, ist zu empfindlich für ein solches Verfahren, wenn eine effektive weitere Hybridisierung erwartet wird. Die Verwendung einer langen DNA-Sonde bringt mit sich, daß die Hybridisierungstemperatur relativ hoch sein muß, außer spezielle Additive, beispielsweise eine hohe DMF-Konzentration, liegen in dem Testgemisch vor. Eine derartige hohe Temperatur kann die Verwendung einiger Enzyme als detektierbare Marker durch Erniedrigen ihrer Aktivität beschränken. Ferner ist gut bekannt, daß eine längere Sequenz eine viel längere Zeit zum Ablauf der Hybridisierung benötigt, eine Tatsache, die ernsthaft die Geschwindigkeit der Assays beschränkt, ohne eine proportional gleiche Erhöhung der Sensitivität zu ergeben.
- In der Literatur gibt es nur wenige Bericht zur Verwendung von Oligodesoxynucleotiden, die mit nicht-radioaktiven Markern markiert sind, zur Verwendung als Hybridisierungssonden. Die Verwendung eines selektiv am 5'-Ende monobiotinylierten Octadecameren war nicht erfolgreich, weil die Empfindlichkeit des Assays viel zu niedrig war. Es wird daher allgemein angenommen, daß bei allen Verfahren, bei denen eine indirekte Markierung oder indirekte detektierbare Marker verwendet werden, bei dem bevorzugten Verfahren das Signal verstärkt wird. Dies ist aufwendig, erzeugt Versuchsirrtümer und macht Routineanalysen sehr schwierig.
- Polymere Substanzen des Nicht-Nucleotidtyps wurden bereits zur Entwicklung von nicht-radioaktiven Hybridisierungssonden verwendet. Biotin- markiertes Histon wurde mit einzelsträngigen Nucleinsäuren mit Glutaraldehyd quervernetzt, aber die Detektion der Ziel-DNA mit diesen Sonden und Avidinperoxidasekonjugaten war weniger empfindlich als die radioaktiven Verfahren. Gemäß einer weiteren Strategie wurden Peroxidase oder alkalische Phosphatase an Polyethylenimin mit niedrigem Molekulargewicht mit p-Benzochinon quervernetzt, und die entstandenen Konjugate wurden mit DNA mit Glutaraldehyd quervernetzt. In beiden Fällen wurden die Polymere hauptsächlich als Linker zwischen den DNA-Sonden und den detektierbaren Einheiten verwendet. Es ist daher wichtig zu unterstreichen, daß bei der erfindungsgemäßen Überlegung das hauptsächliche Ziel bei der Verwendung einer polymeren Matrix die Verstärkung des detektierbaren Signals ist, wodurch der Assay empfindlicher wird und nicht deren Verwendung als einfaches Linkermolekül.
- Hybridisierungstests, bei denen Chelate mit seltenen Erden verwendet werden, wurden vor dem Prioritätsdatum der vorliegenden Erfindung (EP-A-97 373; Syvänen et al, Nucl Acids Res 14 (1986), 1017-27; und Hurskainen et al, In: N0MBA Nordforsk Symposium Gene Technology in Basic and Applied Research (Abstr.) Savonalinna, Finnland, 27.-29. Mai, 1984, 12) beschrieben. Weitere Details wurden auch während des Prioritätsjahres (WO-A-87/02708; und EP-A-212 951) gegeben.
- Ein Überblick über die Literatur zeigt klar, daß, wenn das Ziel die Entwicklung eines leichten, zuverlässigen und empfindlichen Hybridisierungsverfahrens ist, es zweckmäßig ist, direkt markierte und detektierbare Sonden zu verwenden, und im Gegensatz zu Sandwich-Techniken, wenn die Verstärkung des Signals gefordert ist, dies durch eine erhöhte Markerdichte umgesetzt werden sollte. Das Verfahren der Wahl sollte weder mit radioaktiven Isotopen noch mit hochtoxischen Zwischenprodukten verbunden sein.
- Erfindungsgemäß wird ein verbessertes Hybridisierungstestverfahren bereitgestellt, bei dem bestimmte markierte Nucleinsäuresonden verwendet werden. Es ist ein Verfahren zur Detektion einer Nucleotidsequenz einer Nucleinsäure in einer Probe. Das Verfahren besitzt die folgenden, hauptsächlichen, charakteristischen Stufen:
- (i) Kontaktieren der einzelsträngigen Form der in der Probe vorhandenen Nucleotidsequenz unter Hybridisierungsbedingungen mit einer einzelsträngigen Nucleinsäuresonde, um eine doppelsträngige Nucleinsäure zu bilden, die als einen ihrer Stränge die zu detektierende Nucleotidsequenz und als den anderen Strang die Nucleotidsequenz der Sonde besitzt. Die Sonde besitzt als einen Teil eine Nucleotidsequenz, die der zu bestimmenden Sequenz komplementär ist, und als den anderen Teil eine Vielzahl von Chelatgruppe mit Seltenen Erdmetallen, die kovalent über ein wasserlösliches Polymeres mit Nicht-Nucleinsäurestruktur an dessen Nucleotidsequenz gebunden sind. Eine Sonde kann viele Sequenzen komplementär zu der zu bestimmenden und/oder viele Chelatgruppen mit Seltenen Erdmetallen besitzen.
- (ii) Bestimmung oder Detektion der so gebildeten doppelsträngigen Nucleinsäure unter Verwendung der zeitaufgelösten Spektrofluorometrie, um das in die doppelsträngige Nucleinsäure inkorporierte Chelat mit dem Seltenen Erdmetall zu messen.
- Die vorstehend erwähnte Vielzahl von Seltenen Erdmetallchelatgruppen besitzt mindestens ein Metallion, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Eu³&spplus;, Sm³&spplus;, Tb³&spplus; und Dy³&spplus;, bevorzugt die Europium- und Terbiumionen. Die Intensität der aus der doppelsträngigen Nucleinsäure emittierten Fluoreszenz ist ein quantitatives Maß für die zu bestimmende Nucleotidsequenz.
- Die Verwendung einer kovalent gebundenen, polymeren Gruppe, die mehrere Seltene Erdmetallchelatgruppen trägt, vervielfacht das Signal aus der Probe. Eine kurze Berechnung der Fluoreszenzintensität bei Verwendung der mit nur ein paar fluoreszenten Markern markierten Sonde zeigte, daß die Empfindlichkeit eines solchen Assays unzureichend ist. Dies gilt besonders bei der Detektion viraler DNA in den frühen Infektionsstadien. Daher liegt der wichtige Gesichtspunkt der Erfindung in der Verwendung von wasserlöslichen, polymeren Verbindungen als Matrix, an die eine große Anzahl von Europium- oder Terbiumchelaten kovalent gebunden sind. Dies entspricht einer größeren Vervielfältigung des detektierbaren Signals, aber im Gegensatz zu vielen bestehenden Verfahren ist die vorliegende Erfindung ein unkompliziertes, direktes und einstufiges Verfahren.
- Ein Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung sind die Sonden, die in dieser Beschreibung beschrieben sind und die erfindungsgemäß verwendet werden. Aus praktischen Erwägungen heraus und wie in den Beispielen gezeigt, ist das chelatisierte Lanthanidenion immer nicht-radioaktiv.
- Hybridisierungsassays sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Wie in üblichen Immunassaytechniken können sie in homogene und heterogene geteilt werden. Bei den homogenen Hybridisierungsassays werden Marker verwendet, die auf die eine oder andere Art ihr Signal als Folge ihrer Einarbeitung in doppelsträngige DNA-Formen verändern. Folglich ist keine Abtrennung der einzelsträngigen Nucleinsäuren von den doppelsträngigen in den homogenen Varianten erforderlich (siehe beispielsweise EP-A-144 914 und EP-A-70 685). In den heterogenen wird eine Abtrennung unter Verwendung einer Matrix, die in dem Assaymedium unlöslich ist, und die selektiv entweder sondenhaltige, doppelsträngige Nucleinsäuren binden kann, von den einzelsträngigen Sonden oder umgekehrt, erzielt. Die Bindung kann als biospezifische Absorption unter Verwendung kovalent gebundener Oligonucleotidsequenzen oder anderer biospezifischer Affinitätsreaktanten durchgeführt werden. Insolubilisiertes Streptavidin oder Antikörper können zur spezifischen Absorption von mit Biotinyl- bzw. homologen haptenischen Gruppen gebracht werden (vgl. z.B. Dunn et al, Cell 12 (1977), 23- 36; Ranki M et al, Gene 21 (1983), 77-85; Meinkoth and Wahl, Anal Biochem 138 (1984), 267-84; Syvänen et al, Nucl Acids Res 14 (1986), 5037-48; Dattagupta and Crothers, EP-A-130 523; WO-A-85/02628 und US-A-4 563 419). Das beliebteste heterogene Verfahren gegenwärtig ist die Hybridisierung auf Filterpapier, z.B. auf Nitrocellulosepapier. In dem zuletzt genannten Verfahren wird die zu untersuchende einzelsträngige DNA an das Filterpapier adsorbiert, und danach wird das Filterpapier mit DNA, die der zu untersuchenden nicht-homolog ist, gesättigt und unter Hybridisierungsbedingungen mit der DNA-Sonde in Kontakt gebracht.
- Die erforderliche Bedingung zur Durchführung der Hybridisierung hängt von der Sondenlänge, d.h. der Länge der zu hybridisierenden Oligonucleotidsequenz und der gewünschten Spezifität ab. Als allgemeine Regel benötigen längere Nucleotidsequenzen, die komplementär sind, eine längere Zeit bis zum Eintritt der Hybridisierung, obwohl eine Erhöhung der Temperatur und/oder Spezialzusatzstoffe, wie DMF, schnellere Reaktionen ergeben können. Normalerweise werden die Hybridisierungslösungen auf pH-Werte von 5 bis 9 gepuffert, und die Hybridisierungen werden bei konstanten Temperaturen von 18 bis 65ºC für 3 bis 48 h durchgeführt. Für homogene Varianten ist es sehr wesentlich, den Hybridisierungsmedien keine Chemikalien zuzusetzen, die das von dem bzw. den Marker(n) emittierte Signal negativ beeinflussen.
- Das wasserlösliche Polymere besitzt Nicht-Nucleinsäurestruktur und kann ein Biopolymeres oder ein synthetisches Polymeres sein. Unter die zuerst genannten fallen derivatisierte Formen von Biopolymeren. Wenn nicht an eine Nucleinsäure gebunden, zeigt das zu wählende Polymere viele funktionelle Gruppen, die eine kovalente Befestigung an eine Nucleinsäure ermöglichen. Somit besitzen die geeignetsten Polymere mehr als 10, wie z.B. mehr als 50 OH-Gruppen oder Aminogruppen. Die OH-Gruppen können ein Teil einer Carbonsäuregruppe oder eine alkoholische oder phenolische Hydroxylgruppe sein. Das Polymere kann Molekulargewichte über 1000, wie etwa über 5000 Dalton besitzen. In den meisten Fällen liegt das Molekulargewicht unter 10&sup6; Dalton.
- Lineare oder im wesentlichen lineare Polymere sind wegen der günstigen Geometrie der hypothetischen Hybride bevorzugt. Eine andere offensichtliche Forderung in Bezug solcher Polymere ist ihre Löslichkeit in Wasser. Freie Wasserlöslichkeit ihrer Chelatderivate ebenso wie die Wasserlöslichkeit des zum Schluß erhaltenen Lanthaniden-Chelat-Polymer-DNA- Komplexes sind zwingend erforderlich.
- Der erste erfolgreiche Versuch, derivatisierte Polymere zu synthetisieren, wurde durch Kondensation von Polysäuren mit Chelaten, die eine freie Aminogruppe besaßen, unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids als Kopplungsreagenz, durchgeführt. Da die meisten der verfügbaren Chelate sich am besten für die Derivatisierung von freien, bevorzugt primären, Aminogruppen mit einem relativ hohen pKa-Wert (optimaler Bereich pKa 8 bis 11) eignete, wurden Polymere, die solche Funktionen besitzen, als nächstes direkt getestet. Andere Polymere von Interesse wurden durch geeignete Derivatisierung unter Einführung freier Aminofunktionen in die Polymere, denen diese von Anfang an fehlten, hergestellt.
- Besonders gute Kopplungsergebnisse wurden mit den folgenden Polymeren erhalten: chemisch modifiziertes Dextran, Polyvinylamin (PVA), Polyethylenamin (PEA), Polylysin (Pl), chemisch modifiziertes Polyacrylamid, carboxymethyliertes Polyvinylamin (CM PVA) und Polyacrylsäure. Zwei davon, Polyethylenimin und Dextran, erfüllen nicht ganz das Kriterium der Linearität. Trotzdem enthalten beide Verbindungen lange Intervalle, innerhalb derer die gewünschte lineare Geometrie erhalten ist, und sind folglich im wesentlichen linear. Alle diese Polymere können leicht in Wasser in allen Derivatisierungsstufen aufgelöst werden.
- Polyvinylamin wurde nach einem bekannten Verfahren hergestellt und in einer geeigneten Form als Hydrochlorid als trockenes Pulver gelagert. Dieses Material (MPS 3,4 x 10&sup4;) wurde als Matrix zur Synthese von polymeren, wasserlöslichen Farbstoffen verwendet, und es wurde gezeigt, daß die beste Alternative eine Folge seiner hohen Reaktivität und der fast höchsten Dichte der Gruppen, die derivatisiert werden können, ist. Das in den erfindungsgemäßen Versuchen verwendete Polyethylenimin besitzt ein durchschnittliches Molekulargewicht von 5 x 10&sup4; bis 6 x 10&sup4;, 1,5 x 10&sup4; bis 3 x 10&sup4; bzw. Polylysinhydrobromide 3 x 10&sup4; bis 7 x 10&sup4;. Funktionell derivatisiertes Polyacrylamid wurde in dem Labor der Erfinder aus Polyethylacrylat mit einem Molekulargewicht von 72.000 erhalten. Die Synthese ist als Beispiel 1 beschrieben. Die verwendete Polyacrylsäure besaß ein MG von ungefähr 5000. Das Verfahren zur Carboxymethylierung von Polyvinylamin ist als Beispiel 2 dargestellt.
- Polyacrylamid ist ein Beispiel einer Überlegung, bei dem die gewünschte Verbindung nicht durch Derivatisierung von bereits vorhandenem polymerem Material, sondern durch die Synthese eines monomeren Acrylamidchelats und dessen anschließende Polymerisierung (Beispiel 3) hergestellt wird. Die Copolymerisierung solcher Monomeren mit anderen geeigneten Acrylamidderivaten erzeugt Produkte, die alle die notwendigen Besonderheiten, wie geeignete Löslichkeit, Nettoladung und das Vorliegen von anderen funktionellen Gruppen besitzen.
- Theoretisch sind zwei verschiedene Derivatisierungsverfahren für Polymere, die freie Aminofunktionen besitzen, möglich. Es wurde gefunden, daß die Derivatisierung mit einem Lanthanidenchelat mit anschließender Derivatisierung mit einem geeigneten bifunktionellen Reagenz und die Kopplung der aktivierten Oligo-DNA- oder Poly-DNA-Sonde die ökonomischere ist. Die umgekehrte Reihenfolge der Reaktionen ist auch möglich, da die Reaktivität der exocyclischen Aminofunktion in der DNA sehr niedrig ist, und somit keine Derivatisierung mit Chelaten an diesen Aminofunktionen stattfindet. Dies wurde an verschiedenen Vergleichsreaktionen mit DNA und den aktiven Formen der Chelaten bestätigt.
- Für saure Polymere (Polymere, die z.B. Carbonsäuregruppen enthalten) konnte nur der erste Weg, d.h. die Derivatisierung mit einem Chelat mit anschließender Reaktion mit einem bifunktionellen Kopplungsreagenz und die Zugabe der Nucleinsäure durchgeführt werden.
- Sowohl im Falle von Polyaminen als auch Polysäurepolymeren konnte der Reaktionszyklus auf der Stufe des aktivierten Polychelats (Beispiele 4 und 5) gestoppt werden. Derartige funktionell derivatisierte Polymere konnten eine lange Zeitspanne gelagert werden und an verschiedene DNA- Sonden, sofern notwendig, gekoppelt werden. Diese Art der Derivatisierung hat daher den Vorteil, daß sie "universell" ist.
- Die funktionelle Derivatisierung von sauren Polymeren erwies sich als ein sehr schneller Fortschritt, und der Grad der Kondensation, die in einer wäßrigen Lösung durchgeführt wurde und bei der ein großer Überschuß an EDAC (ein wasserlösliches Kondensationsmittel) benötigt wurde, war der Menge des verwendeten Aminoreagenzes direkt proportional
- Die Markierung von amin-funktionalisierten Polymeren, die Chelate bilden, wurde in wäßrigen Medien unter Verwendung eines Triethylammoniumbicarbonatpuffers mit pH 10 durchgeführt.
- Die Verwendung eines Phosphatpuffers sollte vermieden werden, da dieser unlösliche Salze in Wasser mit Polyaminen bildet. Das Ausmaß der Derivatisierung konnte leicht durch Verändern des pH-Wertes oder der Chelatkonzentration manipuliert werden. Beispielsweise konnten bei Verwendung von zwei Äquivalenten Isothiocyanochelate pro Aminogruppe in dem PVA bei pH 10 im wesentlichen alle Aminofunktionen in einer Übernacht-Reaktion derivatisiert werden.
- Führt man diese Reaktion bei einem pH-Wert von 7 durch, wurden nur 35 bis 50 % der Aminogruppen markiert. Dies wurde nach einer Standardgelfiltration und Bestimmen der Lanthanidenfluoreszenz bestimmt.
- Es gibt zwei allgemeine Alternativen bei der Wahl des Nucleinsäureteils der Sonde.
- Die Verwendung von Polynucleotiden ist oft günstig, wenn die Nucleinsäure leicht zugänglich ist und keine Daten zur Sequenz des Zielmoleküls vorliegen. Die Sonde konnte beispielsweise aus einer doppelsträngigen DNA, die in ihrer Sequenz zwei Strängen der zu detektierenden Gensequenz identisch ist, hergestellt werden. Nach Denaturierung der doppelsträngigen DNA werden die zwei Stränge mit zwei Strängen der zu detektierenden Gensequenz hybridisiert. Die als Sonde verwendete Sequenz ihres doppelsträngigen Vorläufers kann durch ihre Klonierung in ein Plasmid oder einen Phagen erzeugt werden. Mehrfache Markierung solcher Poly-DNA- Sonden mit polymeren Lanthanidenchelaten ist daher ein attraktives Verfahren, das die Überwindung der Nachteile im Zusammenhang mit der Markierung und der Vervielfachung des Signals in Fällen, in denen andere nicht- radioaktive Marker verwendet werden, ermöglicht.
- Das native Molekül einer Nucleinsäure muß durch Einführen von Gruppen, die selektiv mit einem potentiellen biofunktionellen Kopplungsreagenz reagieren können, modifiziert werden. Ein Beispiel für eine Gruppe, die diese Kriterien erfüllt, ist die Thiolgruppe, und sie kann unter Verwendung verschiedener, bekannter Verfahren (Beispiel 6) eingeführt werden. Dieses direkte Verfahren ist schnell, zuverlässig und sicher und sollte eine billige Markierung einer beliebigen DNA mit Lanthanidenchelaten in kleinem oder großem Maßstab erlauben.
- Die bereits erwähnte niedrige Reaktivität der natürlichen Aminofunktionen in DNA gestattet nur eine geringfügige Quervernetzung zwischen der DNA und den polymeren Chelaten. Dies ist für die Beständigkeit der intakten Fragmente in der DNA notwendig und ist eine wichtige Besonderheit einer effizienten Hybridisierung. Heutzutage besteht jedoch eine Tendenz, kurze Oligonucleotide anstelle längerer Poly-DNA-Fragemente als Hybridisierungssonden zu verwenden. Dies ist besonders bei der Entwicklung von Routineassays wichtig, bei denen die Zeit eine wichtige Rolle spielt. Diese kleinen Fragmente mit der Sequenz, die lange genug ist, um für die zu detektierende Sequenz spezifisch zu sein, sollte theoretisch mindestens 16 Nucleotide enthalten. Solche Oligonucleotide können heute leicht unter Verwendung im Handel erhältlicher Reagenzien und Apparaturen selbst von einem Nicht-Chemiker synthetisiert werden. Eine zusätzliche Besonderheit der synthetischen DNA-Fragemente ist die Möglichkeit ihrer spezifischen und regioselektiven Derivatisierung in geschütztem Zustand. Eine dieser Reaktionen ist das jüngst veröffentlichte Verfahren zur selektiven 5'-Thiolierung von synthetischen Oligonucleotiden (Beispiel 7). Dies im Zusammenhang mit dem bereits bestehenden Verfahren zur spezifischen endständigen Derivatisierung, selbst in einem völlig ungeschützten Zustand, zusammen mit den einfachen präparativen Reinigungsverfahren macht sie zu einer interessanten Alternative für die Polydesoxynucleotidsonden (Beispiel 8 und 9). Jedoch wird vielleicht der größte Vorteil der kurzen DNA-Fragemente bei Betrachtung des Hybridisierungsverfahrens klar.
- Die Oligo-DNA-Sonden sind durch die sehr günstigen Kinetiken der Hybridisierung gekennzeichnet, was den Assay bei einer niedrigen Temperatur und in einer viel kürzeren Zeitspanne als für Poly-DNA-Sonden nötig ist, ablaufen läßt. Dies trifft natürlich nur auf relativ freie OligoDNA- Sonden zu. Diejenigen, die an globuläre Moleküle, z.B. Proteine, gebunden sind, können sich sehr verschieden verhalten, und in den drastischsten Fällen sogar vollständig die Eigenschaften der Basenpaarung verlieren. Günstigerweise jedoch war die Quervernetzung von 5'-derivatisierten Oligo-DNA-Sonden an die linearen Polymere ohne irgendwelche nachweisbaren Unterschiede in der Hybridisierungseffizienz im Vergleich zu den freien Sonden erfolgreich.
- Verschiedene Arten von funktionell derivatisierten Seltenerdenchelaten sind aus dem Stand der Technik bekannt. Einige von ihnen zeigen bei Anregung mit der geeigneten Wellenlänge Fluoreszenz, andere nicht. Die Fluoreszenzeigenschaft ist für ihre Verwendung in heterogenen Varianten gemäß vorliegender Erfindung nicht kritisch, weil Techniken entwickelt wurden, die nicht-fluoreszierende Seltenerdenchelate in fluoreszierende umwandeln können (Hemmilä et al., Anal. Biochem. 137 (1984), 335-43). Für die homogenen Varianten ist es wichtiger, das Chelat mit Fluoreszenzeigenschaften auszuwählen. Es ist somit wichtiger, das Chelat gemäß der bei dem Hybridisierungsassay gewünschten Stabilität als nach den inhärenten Fluoreszenzeigenschaften als Kriterien auszuwählen.
- Um zu bestimmen, ob ein gegebenes Chelat die ausreichende Stabilität besitzt, wird es einfach in dem durchzuführenden Assay getestet. Wenn die Empfindlichkeit zufriedenstellend ist, besitzt das Chelat zufriedenstellende Stabilität. Geeignete Chelate zur erfindungsgemäßen Verwendung besitzen meist Carboxylat, Phosphat oder Phosphonat als anionische Gruppen und/oder primäre, sekundäre oder tertiäre Aminstickstoffatome, die in dem Molekül so angebracht sind, daß sie gleichzeitig über ihre negativ geladenen Sauerstoff- bzw. Stickstoffatome mit den Seltenerdmetallionen Komplexe bilden, so daß mehr als drei-, bevorzugt mehr als vier-, fünf- oder sechsgliedrige Ringe gebildet werden. Diese Definition bedeutet, daß die in Frage kommenden Chelate mehr als vier, bevorzugt mehr als fünf Heteroatome, ausgewählt aus den Stickstoff- oder Sauerstoffatomen, besitzen, und daß die Seltenerdmetallionen ein Bindeglied für alle Ringe sind. Stickstoffatome in aromatischen Ringen sind in tertiären Stickstoffatomen eingeschlossen. Fünfgliedrige Ringe sind bevorzugt. Diese Definition eines stabilen Chelats kann in üblichen Lehrbüchern gefunden werden und umfaßt auch diejenigen, die in der im folgenden angegebenen Patentliteratur angegeben sind.
- Verschiedene Chelattypen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, wurden zuvor beschrieben (EP-A-195 413; EP-A-139 675; EP-A-68 875; EP-A-203 047; EP-A-171 978; EP-A-2 570 703; US-A-4 352 271 und US-A- 3 994 466). Bezüglich der Hybridisierungsassays, die extrem harte Bedingungen benötigen, wurde eine Reihe von Chelaten entwickelt, die in Beispiel 10 wiedergegeben ist. Sie besitzen als gemeinsamen Nenner einen Pyridinring, der an den 2- und 6-Positionen mit Gruppen substituiert ist, die zusammen mit dem Pyridinstickstoff ein Metallion chelatisieren können. An den Pyridinring sind nur Wasserstoff- und/oder aliphatische Kohlenstoffatome gebunden. Diese extrem stabilen Chelate entsprechen der Definition für stabile Chelate gemäß den Lehrbüchern.
- Das verwendete Chelat muß in den Assayschritten, die harte Bedingungen benötigen, z.B. erhöhte Temperaturen (über 60ºC), Vorhandensein von anderen chelatbildenden Mitteln (EDTA etc) etc. ausreichend stabil sein.
- An jedes lineare polymere Molekül können mehr als 10, wie beispielsweise mehr als 25 chelatbildende Gruppen, gebunden sein. Bezogen auf die Gesamtzahl der Lanthanidenchelatgruppen in einem gegebenen Lanthanidenchelatpolymeren und die funktionellen Gruppen, die zur Einführung der gleichen Gruppe potentiell nützlich sind, beträgt der Substitutionsgrad des Lanthanidenchelatpolymeren üblicherweise mehr als 20 % und kann in vielen Fällen auch 50 % überschreiten.
- 2,0 g Polyethylacrylat (MG 72000 - Aldrich) wurde bei 50ºC mit 50 ml trockenem Ethylendiamin in einem 100 ml Rundkolben unter Verwendung eines langsam rotierenden Magnetrührers behandelt. Nach 24-stündigem Rühren wurde das Gemisch an einem Rotationsverdampfer mit einer Ölpumpe zur Trockene eingedampft und dreimal mit n-Butanol eingedampft. Der Rückstand wurde nach Auflösen in 10 ml Methanol mit 5 M HCl angesäuert und wieder zur Trockene eingedampft. Das feste Rohprodukt wurde in Wasser (20 m) aufgelöst und aus Aceton ausgefällt.
- Die Elementaranalyse des Materials zeigte ein Minimum von 80 % Umwandlung der Ausgangsesterfunktionen.
- 1,0 (12,6 mMol) Polyvinylaminhydrochlorid (PVA HCl) wurde in 20 ml Wasser aufgelöst, und der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von 5 M NaOH auf 10,5 gebracht. 10,5 g Bromessigsäure (75,6 mMol), die in 20 ml Wasser aufgelöst und mit NaOH neutralisiert war, wurde der magnetgerührten PVA-Lösung zugetropft, wobei der pH-Wert von 10,5 durch Zugabe von 5 M NaOH beibehalten wurde. Nach beendeter Zugabe wurde das Gemisch über Nacht unter Rühren stehengelassen. Das Rohrprodukt wurde durch Zugabe von 500 ml Ethanol isoliert. Das weiße Präzipitat wurde abgetrennt, in Wasser aufgelöst und gegen destilliertes Wasser dialysiert.
- 100 mg eines aminoderivatisierten Lanthanidenchelates (EP-A-139 675) wurden in 5 ml 1 M Trimethylammoniumbicarbonatpuffer, pH 9,5, aufgelöst und auf 0ºC abgekühlt. Zu dieser gerührten Lösung wurden in geringen Anteilen 1,5 ml Acryloylchlorid zugesetzt. Das Fortschreiten der Reaktion kann mit TLC unter Verwendung von Acetonitril - H&sub2;O (4:1) als Lösungsmittel überwacht werden. Das Gemisch wurde 1 h lang gerührt und an einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Der abschließend erhaltene Rückstand wurde in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und am Hochvakuum lyophilisiert.
- AA) Analog können die Chelate gemäß Beispiel 10 (Verbindungen 12) verwendet werden.
- Monotrifluoracetat eines (α,ω)-Diaminoalkans wurde in trockenem Pyridin: Dichlormethan (1:1) aufgelöst und auf -10ºC abgekühlt. Zu dem gerührten Gemisch wurden 1,5 ml Acryloylchlorid gegeben. Das Gemisch wurde 30 min lang gerührt und zwischen CHCl&sub3; und gesättigtem NaHCO&sub3; verteilt. Die organischen Extrakte wurden eingedampft und dreimal mit Toluol zusammen eingedampft. Der ölige Rückstand wurde in Methanol (10 ml/mMol) aufgelöst und ein gleiches Volumen gesättigter Na&sub2;CO&sub3;-Lösung wurde auf einmal zugegeben. Das trübe Gemisch klärte sich nach etwa 1 h, und die Hydrolyse der Trifluoracetamidogruppe war nach 5 h praktisch beendet. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf kleines Volumen eingedampft und 6-mal mit CHCl&sub3;/EtOH (1:1) nach Zugabe von gesättigter (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung extrahiert. Nach Eindampfen wurde der Extrakt chromatografisch mit einer kurzen Säule unter Verwendung von CHCl&sub3;/EtOH (6:4) als Endlösungsmittel gereinigt. Nach Eindampfen der geeigneten Fraktionen wurde das ölige Produkt bei -20ºC nach Zusatz eines Polymerisationsinhibitors gelagert.
- Zu einem Gemisch aus Acrylamidochelat (Punkt a), funktionell derivatisiertem Acrylamid (Punkt B) in einem Verhältnis 2:1 und aufgelöst in Phosphatpuffer (u = 0,01), pH 8,0, so daß die Konzentration der Acrylamidomonomeren 5 % betrugt, wurden TEMED (5%ige wäßrige Lösung) und Ammoniumpersulfat (5%ige wäßrige Lösung) bis zu einer Endkonzentration von 0,047 % (TEMED) und 0,033 % (Ammoniumpersulfat) zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 min bei 50ºC gehalten, und das Polymere wurden von den niedermolekularen Komponenten mittels Gelchromatografie abgetrennt.
- Bei Verwendung dieses Verfahrens konnten Polymere mit Chelatfunktionen bis zu 60 % ihrer Amidogruppen leicht erhalten werden. Indem man auch andere Acrylmonomere, beispielsweise acrylierte Aminosäuren oder acryliertes Taurin einbezieht, und indem man die Verhältnisse der zugesetzten Monomeren variiert, konnten Polymere unterschiedlicher Konstitution synthetisiert werden.
- CC) Unter Verwendung des Acrylamidochelats nach Stufe AA können andere funktionell derivatisierte Polyacrylamide, die das entsprechende Chelat enthalten, erhalten werden.
- 5,85 mg (0,01 mMol) Eu³&spplus;-Chelat in Aminoform (wie in Beispiel 3A) wurden in 50 ul Wasser aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung aus 2,0 mg (0,02 mMol - bezogen auf das Carboxylat) carboxymethyliertes Polyvinylamin in 30 ul Wasser zugesetzt. Festes EDAC (38 mg - 0,20 mMol) wurde dann in drei Anteilen während 1 h zugesetzt, und der pH-Wert der Lösung wurde bei 5,5 durch Zugabe verdünnter HCl gehalten. Zu diesem Reaktionsgemisch wurde ein bifunktionelles Reagenz (siehe Schema 5) (0,32 mg - 0,001 mMol) und anschließend EDAC (19 mg - 0,01 mMol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 min lang inkubiert, und das Produkt wurde durch Zugabe von Aceton ausgefällt. Das feste, zentrifugierte Material wurde in Wasser aufgelöst, und das polymere Produkt wurde durch Filtration durch eine Trisacrylsäule (2 x 50 cm) unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl, 0,5 NaCl- Puffer, pH 7,0, abgetrennt.
- Die Bestimmung des Europiumgehalts in den vereinigten hochmolekularen Fraktionen ergab eine 60%ige Aufnahme des monomeren Ausgangschelats, was etwa 200 Chelaten pro polymerem Molekül entspricht. Schließlich wurde das Material gegen Wasser dialysiert, aus Aceton ausgefällt und als trokkenes Pulver gelagert.
- 500 ug (6,3 uMol, bezogen auf die Aminfunktion) Polyvinylaminhydrochlorid, aufgelöst in 20 ml H&sub2;O wurde mit 10 uMol eines mit Isothiocyanat derivatisierten Lanthanidenchelats (siehe EP-A-139 675 und Verbindung 13 von Beispiel 10) in Gegenwart von 10 uMol Triethylamin markiert. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 20ºC inkubiert. Das nicht-umgesetzte Chelat wurde durch Gelfiltration durch eine Sephadex G-50-Säule (0,7 x 20 cm) entfernt. Die Fraktionen, die Lanthanidenionen enthielten, wurden vereinigt, entsalz und konzentriert. Dieses Verfahren ergab ein Polymeres mit einem hohen Substitutionsgrad (50 bis 75 %).
- Das polymere Chelat (aus Stufe A) wurde in 50 ul Phosphatpuffer, pH 6,5, aufgelöst, und 270 ug (0,63 uMol) eines bifunktionellen Kopplungsreagenzes (siehe Schema 6) in 10 ul Ethanol wurden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 6 h unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Das Produkt wurde nach Filtration durch eine Sephadex G-50-Säule isoliert und aus Aceton ausgefällt.
- 10 ug einer einzelsträngigen DNA des Phagen M 13 mp 10, enthaltend ein Xba I-Restriktionsfragment des Adenovirus 2 (0 bis 3,85 willkürliche Einheiten) von etwa 1350 bp wurden mit 150 ul 25%iger Glutardialdehydlösung und 50 ug eines europium-markierten PVA (aus Beispiel 5) in phosphatgepufferter Salzlösung (10 mM Na-K-Phosphat, pH 7,4, 0,18 M Natriumchlorid) umgesetzt. Die Reaktion ließ man 20 min bei 37ºC ablaufen. Nach Inkubation wurden die nicht-umgesetzten Aldehydgruppen durch Umsetzung mit 500ul 1M Lysin, pH 7,5, bei 20ºC für 1h blockiert.
- 200 ug einer einzelsträngigen M 13 DNA, die ein Fragment der DNA des Adenovirus 2 enthielt, wurden mit Natriumbisulfit-Ethylendiamin bei pH 6,5 2 h lang nach einem veröffentlichten Verfahren modifiziert. Die dialysierte und konzentrierte Probe wurde dann in 1 ml PBS (pH 8,5) aufgelöst. Fester S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid (1 mg - 5,75 uMol) wurde zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 60 min unter gelegentlichem Schütteln bei Raumtemperatur gehalten. Das Gemisch wurde auf 0,3 M bezüglich Natriumacetat gebracht, und 2,5 Volumina Ethanol wurden zugesetzt, um die DNA auszufällen. Das Präzipitat wurde in 1,0 ml 0,01 M Natriumhydroxidlösung aufgelöst, und 60 min bei Raumtemperatur zur Hydrolyse der S-Acetyl-Schutzgruppen gehalten. Danach wurde das Gemisch mit 0,1 M HCl neutralisiert. Die DNA wurde ausgefällt und von den niedermolekularen Verbindungen mittels Gelchromatografie durch Sephadex G-25 (0,7 cm x 15 cm) in einem 0,05 M Phosphatpuffer, pH 6,5, gereinigt.
- 200 ug der gereinigten einzelsträngigen DNA mit den freien Sulphydrylgruppen und 500 ug Eu-PVA aus Beispiel 4 oder Beispiel 5, Stufe B, wurden vermischt und 20 h bei Raumtemperatur inkubiert.Das Eu-PVA-DNA- Konjugat wurde mittels Gelfiltration durch eine Sephadex G-50-Säule (0,7 cm x 47 cm) gereinigt. Die Säule wurde mit PBS äquilibriert und eluiert.
- Eine hexadecamere DNA-Sonde wurde in großen Mengen unter Verwendung der Standardchemie der Lösungen synthetisiert. Die 5'-Schutzgruppe wurde dann entfernt, und die Sonde wurde mit einer geschützten Thiolfunktion (S-Tr) nach dem Verfahren von Connolly B.A., Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4485-4502, modifiziert durch die Phosphortriesterchemie, markiert. Danach wurden Standardverfahren zur Beseitigung der Schutzgruppe und zur Reinigung verwendet. Abschließend wurde die S-Tr-Schutzgruppe mit Silbernitrat in einem durch Natriumacetat gepufferten System entfernt. Der Überschuß an Silber wurde mit Hydrogensulfid entfernt, und das ausgefällte Silbersulfid wurde mit Hilfe von 2 u-Filtern abfiltriert. Das klare Filtrat wurde konzentriert und auf Sephadex G-25 (10 x 200 mm) entsalzt.
- Stufe B: 1,0 mg 5'-thiolierter Oligo-DNA-Sonde wurde mit einem aktivierten PVA-Chelat (aus Beispiel 5) bei pH 7,0 und in unterschiedlichen Verhältnissen (3:1 bis 20:1) vermischt. Alle Gemische wurden über Nacht inkubiert, und unter Verwendung einer Sephadex G-50-Säule (0,7 cm x 50 cm) abetrennt. Die Säule wurde mit PBS äquilibriert und eluiert.
- Adenovirus 2 DNA und PBR 322 als Kontroll-DNA wurden denaturiert und auf Nitrocellulosefilter getüpfelt. Mengen von DNA von 100 ng bis hinunter zu 1 pg wurden aufgebracht. Die Filter wurden in einem Mikrowellenofen 3 min lang wärmebehandelt.
- Die in Stufe A erhaltenen Filter wurden bei 42ºC 2 h lang in 50%igem Formamid, enthaltend 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 5 x Denhardt-Reagenz (0,1 % Ficoll 400, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Rinderserumalbumin) und 50 ug pro ml denaturierte DNA aus Heringssperma vorhybridisiert.
- Nach der Vorhybridisierung wurden die Filter in eine Hybridisierungslösung, die 50 % Formamid, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris- HCl, pH 7,0, 5 x Denhardt-Reagenz, 0,5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 50 ug pro ml denaturierte DNA aus Heringssperma enthielt, überführt. Das Eu-PVA-DNA-Konjugat (Beispiele 1, 2 und 3) wurde zugesetzt, um der Endprobe eine DNA-Konzentration von 0,2 ug/ml zu verleihen. Die Filter wurden bei 42ºC 4 h hybridisiert. Die Filter wurden dann bei 42ºC mit 0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, enthaltend 0,5 % SDS, dreimal 15 min lang gewaschen.
- Die Flecken auf den Filtern wurden ausgestanzt und die zeitverzögerte Fluoreszenz aus Europium in jedem Flecken wurde unter Verwendung einer Verstärkerlösung (Wallac Oy, Finnland) gemessen. Die Empfindlichkeit des Tests betrug 10 pg Adenovirus 2 DNA. Werte, die dem Zweifachen des Mittelwerts der negativen Kontrollen oder mehr entsprachen, galten als positiv.
- Wie in Beispiel 8.
- Die Filter wurden bei 30ºC 1 h lang in 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 5 x Denhardt-Reagenz und 50 ug pro ml denaturierter DNA aus Heringssperma voreingeweicht.
- Nach Vorhybridisierung wurden die Filter in eine Hybridisierungslösung, die 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 0,5 % SDS, 5 x Denhardt-Reagenz und 50 ug pro ml denaturierte DNA aus Heringssperma enthielt, überführt. Ein Eu-PVA-Hexadecamer-Konjugat aus Beispiel 7, Stufe B, wurde zugesetzt und ergab eine Hexadecamerkonzentration von 20 ng/ml. Die Hybridisierung wurde bei 30ºC 3 h lang durchgeführt. Die Filter wurden in 1 M NaCl, das 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 und 0,5 % SDS enthielt, zuerst bei 30ºC 15 min lang und dann bei 35ºC 10 min lang gewaschen.
- Die Flecken wurden ausgestanzt, und das Europium in jedem Flecken wurde wie in Beispiel 8, Stufe D, gemessen. Ein positives Signal wurde detektiert, wenn die Flecken in den Filtern 200 pg oder mehr Adenovirus 2 DNA enthielten.
- Zum Überblick über den verwendeten synthetischen Weg und die Strukturen der beteiligten Verbindungen wird auf Schema 8 verwiesen. Die NMR- Spektren wurden für das Endprodukt und die synthetisierten Zwischenprodukte aufgezeichnet, und es wurde gefunden, daß sie den angegebenen Strukturen entsprechen. Die Nummern der Verbindungen beziehen sich auf die in Schema 8 angegebenen.
- Flüssiges Ammoniak (150 ml) wurde in einen 250 ml Dreihalsrundkolben mit einem mechanischen Rührer, einem Tropftrichter und einem Einlaßrohr gegeben und in ein Trockeneis/Ethanol-Bad eingetaucht. Natriumamid wurde durch Zugabe von 20 mg Eisennitrat (Fe³&spplus;), gefolgt von metallischen Natrium (2,09 g, 0,09 Mol) erzeugt. Die tiefblaue Lösung wurde 1 h lang gerührt, und eine Lösung aus Collidin (1) (10,06 g, 0,083 Mol) in 20 ml trockenem Diethylether wurde in den Reaktionsansatz im Verlauf von 15 min zugegeben. Die gebildete gelbe Suspension wurde für weitere 45 min lang gerührt, und anschließend wurde Benzylchlorid (6,33 g, 0,05 Mol) aufgelöst in 10 ml trockenen Diethylether zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 45 min lang gerührt, und überschüssiges Natriumamid wurde durch Zugabe von Ammoniumchlorid (4,82 g, 0,09 Mol), aufgelöst in 20 ml Wasser, neutralisiert. Das Ammoniak wurde verdampft, und der Rest wurde zwischen Wasser und Diethylether verteilt. Die gewonnene etherische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der braune ölige Rückstand wurde fraktioniert, wobei eine Fraktion, die bei 130ºC/0,1 mmHg abdestillierte, gewonnen wurde. Ausbeute = 6,17 g (55 %), Öl.
- Verbindung (2) (20 g, 88,9 mMol) wurde in THF (150 ml) aufgelöst, und Salpetersäure (6,7 ml, 60%ige wäßrige Lösung, 1 eq) wurde zugesetzt. Diethylether wurde der klaren Lösung, bis sie trüb blieb, zugesetzt, und das Gemisch ließ man zur Kristallisation im Gefrierschrank stehen. Die farblosen Nitratkristalle (quantitative Ausbeute) wurden in kleinen Mengen zu einer gut gekühlten Schwefelsäure (150 ml) gegeben, wobei man die Temperatur 10ºC nicht erreichen ließ. Danach wurde das Gemisch 10 min lang bei 50ºC erwärmt. Die entstandene braune Lösung wurde auf Eis gegossen und mit festem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Das organische Material wurde mit Chloroform (3x200 ml) extrahiert, und nach Trocknen über Natriumsulfat wurde der Chloroformextrakt unter Verwendung von 4 % Ethanol/Chloroform als Lösungsmittel flash-chromatografiert. Die geeigneten Fraktionen wurden gewonnen und eingedampft und ergaben einen reinen gelben Feststoff. Ausbeute: 22,82 g (95 %).
- Die Verbindung (3) (22,82 g, 84,5 mMol) wurde in Chloroform (100 ml) aufgelöst, und 16 g (94 mMol) m-Chlorperbenzoesäure (mCPBA) wurden in kleinen Anteilen bei Raumtemperatur im Verlauf einer Zeitspanne von 30 min zugesetzt. Das Gemisch wurde weitere 2 h lang gerührt, und nach einem negativen TLC-Test bezüglich des Ausgangsmaterials wurde es durch Verteilen zwischen gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und Chloroform aufgearbeitet. Die vereinigten Chloroformextrakte (3x200 ml) wurden eingedampft und ergaben einen leicht gelben Feststoff, der gemäß TLG rein war. Ausbeute: 24,55 g(100 %).
- Die Verbindung (4) (24,0 g) wurde in 100 ml Essigsäureanhydrid suspendiert. Das Gemisch wurde am Rückfluß 20 min lang erhitzt und ergab eine homogene dunkle Lösung. Der Essigsäureanhydrid wurde an einem Rotationsverdampfer verdampft, und der ölige Rückstand wurde mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und anschließender Extraktion mit Chloroform (3x200 ml) neutralisiert. Die Chloroformphase wurde verdampft, und das Rohmaterial wurde unter Verwendung von 2 % Ethanol/ Chloroform als Lösungsmittel flash-chromatografiert. Die gereinigten Fraktionen wurden eingedampft und ergaben ein Öl, das Gemäß TLC und NMR rein war. Ausbeute: 19,55 g (69 %).
- Die Verbindung (5) (19 g, 60,5 mMol) wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben, oxidiert. Das rohe, in der TLC nur einen Flecken ergebende Produkt wurde nach einem Standardaufarbeitungsverfahren isoliert. Ausbeute: 18,97 g (95 %) Öl.
- Verbindung (6) (18,5 g, 56 mMol) wurde in Produkt (7) gemäß einer Synthese, die der Synthese in Beispiel 4 analog ist, umgewandelt. Das neutralisierte, endextrahierte Produkt wurde eingedampft und unter Verwendung von 2 % Ethanol/Chloroform als Lösungsmittel flash-chromatografiert. Die reinen, das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft. Ausbeute: 12,04 g (61 %) Öl.
- Das Diacetat (7) (12,0 g, 34,1 mMol) wurde in 50 ml Ethanol aufgelöst. Zu dieser bei Raumtemperatur gerührten Lösung wurden auf einmal 20 ml 5 M Natriumhydroxid zugesetzt. Nach 10 min wurde bei negativem TLC-Test auf das Substrat, das Gemisch mit Citronensäure neutralisiert und zwischen gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und Ethanol/Chloroform im Verhältnis 1:1 verteilt. Die Extraktion wurde 3-mal unter Verwendung von 100 ml organischem Lösungsmittel für jede Extraktion wiederholt. Die vereinigten Extrakte wurden eingedampft, und das verbleibende Gemisch wurde unter Verwendung von schließlich 8%igem Ethanol/Chloroform als Lösungsmittel flash-chromatografiert. Die geeigneten reinen Fraktionen wurden gewonnen und eingedampft. Ausbeute: 4,75 g (52 %) gelber Feststoff.
- Zu der Dihydroxyverbindung (8) (2,7 g, 9,44 mMol) in 35 ml trockenem Dichlormethan wurde Phosphortribromid (3,63 g, 1,26 ml, 13,41 mMol) zugesetzt, und das Gemisch wurde 15 min lang am Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und mit Chloroform (3x50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden eingeengt und aus Ethylacetat umkristallisiert. Ausbeute: 3,91 g (84 %) farblose Kristalle.
- Verbindung (9) (3,27 g, 7,9 mMol) und Iminodiessigsäurediethylester (5,78 g, 30,5 mMol) wurden zusammen mit Toluol verdampft und in trockenem Acetonitril (50 ml) wieder aufgelöst. Festes Natriumcarbonat (10 g) wurde zugesetzt, und das Gemisch wurde 2 h lang am Rückfluß erhitzt. Danach wurden die Salze abfiltriert, und das Filtrat wurde eingedampft. Die Rückstand wurde flash-chromatografiert, und die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden zur Trockene eingedampft. Um das Material frei von irgendwelchem mitchromatografierten Iminodiessigsäureethylester zu erhalten, wurde das ölige Produkt mit Petrolether (3x20 ml) innig vermischt, worauf das Material frei von irgendwelchen Verunreinigungen erhalten wurde. Ausbeute: 5,09 g (80 %) Öl.
- Zu der Lösung aus Verbindung (10) (4,8 g, 7,5 mMol) in 50 ml Ethanol wurden 10 % Palladium auf Kohle (100 mg) zugegeben und anschließend wurde Natriumborhydrid (378 mg, 10 mMol) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 5 min lang bei Raumtemperatur gerührt und dann zwischen gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und Chloroform verteilt. Die Chloroformextrakte (3x50 ml) wurden konzentriert und unter Erhalt der reduzierten Form der Verbindung (10) (= Verbindung (11)) als ein Öl nach Eindampfen flash-chromatografiert. Ausbeute: 3,89 g(85 %).
- Die reduzierte Form der Verbindung (10) (250 mg) in 20 ml Ethanol wurde mit 1 M Natriumhydroxid (10 ml) 3 h lang bei Raumtemperatur behandelt. Das in der TLC reine Produkt (Lösungsmittelsystem Acetonitril/Wasser 4:1) wurde mit 1 M Salzsäure neutralisiert und konzentriert. Zu dem in Wasser aufgelösten Rückstand (25 ml) wurde Europiumchloridhexahydrat (60 mg), aufgelöst in 5 ml Wasser, zugesetzt, und das Gemisch wurde 30 min lang gerührt. Der Überschuß an Europiumsalz wurde durch Erhöhen des pH-Werts auf 8,5 mit gesättigter Natriumcarbonatlösung und Filtration des Präzipitats entfernt. Die klare Lösung wurde fast zur Trockene eingedampft und (12) wurde durch Zugabe von 100 ml Aceton ausgefällt. Das Produkt wurde auf dem Filter mit Aceton gewaschen und getrocknet.
- Zu dem Aminochelat (12) (100 mg), aufgelöst in 5 ml Wasser und heftig gerührt, wurde Thiophosgen (80 ul), aufgelöst in 3 ml Chloroform, auf einmal zugegeben, und das Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt.
- Die Wasserphase wurde abgetrennt, mit Chloroform (3 x 3 ml) extrahiert und auf ein Volumen von 0,5 ml eingeengt. Die Zugabe von Ethanol (10 ml) bewirkte eine quantitative Ausfällung von (13) als weißem Feststoff. Die TLC (System: Acetonitril/H&sub2;O 4:1) und die Entwicklung von Fluoreszenz mit Acetonylaceton/EtOH (1:20) zeigte nur ein einziges Produkt, das im Fluorescamintest auf freie Amine negativ war.
- Die Verbindungen 11 und 13 wurden in den vorausgehenden Beispielen verwendet. Herstellung von aminoderivatisiertem Polvacrylamid (Schema 1) Herstellung von carboxymethyliertem Polyvinylamin (CMPVA) (Schema 2) Herstellung von funktionell derivatisierten Polychelaten durch die Polymerisation von monomeren Einheiten (Schema 3) Synthese von Acrylamidochelaten (Schema 4) Synthese von carboxymethyliertem Polyvinylamin (CMPVA) mit aktivierten Gruppen und Chelatgruppen (Schema 5) Verwendung von Polyvinylamin zur Synthese von aktiviertem polymerem Chelat (Schema 6) Bildung von Lanthaniden-markierter Oligodesoxyribonucleinsäure (Schema 7) Vollständig geschützt Pyridin teilweise Abspaltung der Schutzgruppe Schutzgruppe abgespalten Inkubation mit aktiviertem Polychelat O-Chlorophenyl Synthese der neuen chelatbildenden Verbindungen und ihrer Chelate (Schema 8)
Claims (9)
1. Verfahren zur Detektion einer Nucleotidsequenz einer
Nucleinsäure in einer Probe, dadurch
gekennzeichnet, daß man in Stufen
(i) unter Hybridisierungsbedingungen die einzelsträngige
Form der Nucleotidsequenz mit einer einzelsträngigen
Nucleinsäuresonde, worin eine Vielzahl an
Seltenerdmetallchelatgruppen kovalent über ein wasserlösliches
Polymeres mit Nicht-Nucleinsäurestruktur an eine der
zu detektierenden Sequenz komplementären
Nucleotidsequenz gebunden ist, in Kontakt bringt, um eine
doppelsträngige Nucleinsäure, die als einen ihrer Stränge
die zu detektierende Nucleotidsequenz und als den
anderen Strang die Nucleotidsequenz der Sonde besitzt,
zu bilden, und
(ii) die Bildung von doppelsträngiger Nucleinsäure, die die
Sonde enthält, durch Messen der zeitaufgelösten
Fluoreszenz aus dem als Chelat in die doppelsträngige
Nucleinsäure inkorporierten Seltenerdmetallion
detektiert,
wobei die Vielzahl der Seltenerdmetallchelatgruppen
mindestens ein Metallion, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Eu³&spplus;, Sm³&spplus;, Tb³&spplus; und Dy³&spplus; als das chelatisierte
Seltenerdmetall besitzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß mindestens ein Metallion aus
der Gruppe, bestehend aus Eu³&spplus; und Tb³&spplus;, ausgewählt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polymere
aus der Gruppe von Polymeren mit vielen OH- oder
Aminogruppen ausgewählt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polymere
aus der Gruppe von Polymeren mit vielen OH-Gruppen, wie
beispielsweise Polymeren mit vielen alkoholischen, phenolischen
oder carboxylischen Gruppen, ausgewählt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das Polymere aus der Gruppe
von Polymeren aus Polymeren mit vielen Aminogruppen
ausgewählt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß das wasserlösliche Polymere
aus der Gruppe von Polymeren, bestehend aus Polyvinylaminen,
Polyethyleniminen, Polylysinen, Polysacchariden,
Polyacrylamiden, und derivatisierten Formen dieser Polymere mit
vielen OH- oder Aminogruppen ausgewählt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß mindestens zwei
Nucleotidsequenzen komplementär der zu detektierenden Sequenz an das
wasserlösliche polymere Molekül gebunden sind.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß mindestens zwei
wasserlösliche
Polymermoleküle an die der zu detektierenden
Nucleotidsequenz komplementäre Nucleotidsequenz gebunden sind.
9. Nucleotidsequenz, dadurch
gekennzeichnet, daß an sie eine Vielzahl von
Lanthanidenchelatgruppen kovalent über ein wasserlösliches Polymeres
mit Nicht-Nucleinsäurestruktur gebunden ist, wobei das
Lanthanid nicht-radioaktiv ist und aus der Gruppe Dy³&spplus;,
Sm³&spplus;, Eu³&spplus; und Tb³&spplus;, bevorzugt Eu³&spplus; und Tb³&spplus;, ausgewählt
ist.
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