DE3780055T2 - Pilzresistente markierungsmaterialien. - Google Patents

Pilzresistente markierungsmaterialien.

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DE3780055T2 DE8787302632T DE3780055T DE3780055T2 DE 3780055 T2 DE3780055 T2 DE 3780055T2 DE 8787302632 T DE8787302632 T DE 8787302632T DE 3780055 T DE3780055 T DE 3780055T DE 3780055 T2 DE3780055 T2 DE 3780055T2
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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf arzneimittelresistente Gene, die sich als Selektionsmarker für Penicillium chrysogenum eignen. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf einen arzneimittelresistenten Stamm von P. chrysogenum, bei dem die Arzneimittelresistenz durch ein Segment der heterologen DNA verliehen wird, das in der Lage ist, Sulfanomid-, Trimethoprim- oder Methotrexat-Resistenz zu verleihen.
  • Obwohl die Umwandlung in P. chrysogenum mit auxotrophen Markern früher bereits beschrieben wurde (Sanchez, F., et al "Transformation in P. Chrysogenum." Gene 51: 97-107 (1987)), wurden jedoch dominante Resistenzmarker (universell für alle Stämme), die keine besondere Mutation des Wirtsstammes erfordern, bisher noch nicht beschrieben.
  • Sulfonamide (z.B. Sulfamethoxazol) sind Strukturanalogien der p-Aminobenzoesäure. So weit bekannt ist, wirken sie als Arzneimittel, indem sie den Umfang der Synthese von funktionellem Dihydrofolat verringern.
  • Sulfonamide wirken gegen Bakterien, Hefen, Protozoen und Pflanzen, jedoch nicht bei Säugetieren, da Folsäure für Säugetiere ein Vitaminbedarf ist.
  • Methotrexat (MTX) und Trimethoprim (Tp), Strukturanalogien von Dihydrofolsäure, hemmen die Wirkung der Enzym- Dihydrofolsäure-Reduktase (DHFR). Dieses Enzym katalysiert die Reduktion der Dihydrofolsäure zu Tetrahydrofolsäure (THF). THF ist ein Coenzym in 1-Kohlenstoff-Übertragungsreaktionen (Biosynthese von Purinen, Vitaminen und Aminosäuren), vom pharmakologischem Standpunkt aus ist ihre wichtigste Funktion jedoch in der Reaktion, wobei Deoxyuridylat (dUMP) in Deoxythymidylat (dTMP) umgewandelt wird. In dieser letzteren Reaktion wirkt THF nicht nur als Coenzym, sondern auch als Reduktant, indem sie zu DHF oxidiert, und THF durch die DHFR-katalisierte Reaktion wiedergewonnen werden muß. Infolgedessen führt die Hemmung von DHFR dann zu einem Mangel an dTMP und dementsprechend zur Hemmung der DNA- Synthese.
  • Obgleich sowohl MTX wie auch Tp die DHFR hemmen, hat Tp eine mehrfach geringere Affinität zu eukaryotischer im Gegensatz zu bakterieller DHFR, deshalb ist MTX das ausgewählte Arzneimittel für die Hemmung der eukaryotischen DHFR.
  • Plasmid-vermittelte Resistenz gegen Sulfonamide ist weit verbreitet und in einigen Fällen wird diese Resistenz durch eine durch das Plasmid spezifizierte neue Dihydropteroat Synthetase verursacht (z.B. Plasmid R388 - Svedberg, G. et al "Plasmid-borne sulfonamide resistance determinants studied by restriction enzyme analysis." J. Bacteriol. 153: 1228-1237 (1983)).
  • Zumindest zwei Sorten von Plasmid-spezifizierter DHFR wurden beschrieben (Fling, M.E., et al "Monitoring of plasmid-encoded, trimethoprim-resistant dihydrofolate reductase genes: detection of a new resistant enzyme." Antimicrob. Agents Chemother. 22: 882-888 (1982) ), die Tp/MTX Resistenz verursachen. Typ II DHFR's sind im Prinzip völlig unempfindlich gegen Tp oder MTX. Das Plasmid R388 spezifiziert den Typ II DHFR.
  • Resistenz gegen MTX wurde als Marker für Vektoren in eukaryotischen Organismen (Hefe, Drosophila-Zellen, Säuger-Zellen) verwendet. In einigen Fällen ist das verwendete DHFR-Gen jenes, das in pR388 vorhanden ist, wo der ursprüngliche bakterielle Promoter entfernt und durch einen zum verwendeten eukaryotischen Organismus homologen Promoter substituiert wurde (Miyajima, A., et al. "Expression of plasmid R388-encoded type II dihydrofolate reductase as a dominant selective marker in Saccharomyces cerevisiae." Mol. Cell. Biol. 4: 407-414 (1984). Bourois, M. et al. "Vectors containing a prokaryotic dihydrofolate reductase gene transform Drosophila cells to methotrexate-resistance". EMBO J. 2: 1099-1104 (193). O'Hare, K., et al. "Transformation of mouse fibroblasts to methotrexate resistance by a recombinant plasmid expressing a prokaryotic dihydrofolate reductase." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531 (1981) ).
  • P. chrysogenum ist ein industriell wichtiger fädiger Pilz der Ascomycetes-Familie, und wird insbesondere in der industriellen Herstellung von Penicillinen verwendet. Zahlreiche Forschungsarbeiten beziehen sich auf die Gewinnung von ergiebigen Stämmen mittels klassischer Mutagenese und gewaltsamer Selektion.
  • Es wurde nun festgestellt, daß es möglich ist, das molekulare Klonierungsverfahren für P. chrysogenum durch Einsetzen eines arzneimittelresistenten Markers in das P. chrysogenum Chromosom, oder als Satelliten-DNA, anzuwenden. Infolgedessen wird in einem ersten Aspekt der Erfindung ein arzneimittelresistenter Stamm von P. chrysogenum zur Verfügung gestellt, in dem diese Arzneimittelresistenz durch heterologe DNA verliehen wird, und ein Transformationsverfahren unter Verwendung dieser Resistenz.
  • In der Co-Patentanmeldung (DK 515/87; EP 87300916.1; JP 21653/1987; US 009713) werden Beispiele von auxotrophen Markern für P. chrysogenum angeführt und der entsprechende Wortlaut wird hier als Referenz zitiert. Es wurden insbesondere Stämme von E. coli, die das trpC Gen enthalten, gemäß dem Vertrag von Budapest am 14. März 1986 im National Collection of Industrial Bacteria, Schottland, hinterlegt und diese haben die Registrierungs-Nummern NCIB 12222 und NCIB 12223. Diese hinterlegten Stämme entsprechen den hier beschriebenen pPctrpC1 und pPctrpC6 und es sei darauf hingewiesen, daß eine Bezugnahme auf diese Plasmide eine Bezugnahme auf die entsprechenden Plasmide und Derivate gemäß Beschreibung in dieser Co-Patentanmeldung einschließt.
  • Bei Verwendung von mit P. chrysogenum assoziierten Promotern und Terminatoren wie jenen, die in pPctrpC1 und pPctrpC6 vorhanden sind, ist es möglich, exogene DNA, die Arzneimittelresistenz in anderen Organismen verleiht, in P.chrysogenum, zu verwenden. Somit kann durch die Verwendung von homologen Kontrollsequenzen mit einem geeigneten exogenen Resistenzgen P. chrysogenum-Resistenz gegen jedes gewünschte Arzneimittel verliehen werden.
  • Es wurde zum Beispiel festgestellt, daß die Resistenzgene von Plasmid R388 in Vektoren für P. chrysogenum eingeschlossen werden können, um Resistenz gegen Tp und Su zu verleihen.
  • Die Sequenz des Plasmid R388-Dihydrofolat-Reduktasegens wurde veröffentlicht (Swift, G., et al "DNA sequence of a plasmid-encoded dihydrofolate reductase." Mol. Gen. 181: 441-5447 (1991). Zolg, J.W. et al "Characterization of a R plasmid-associated, trimethoprim-resistant dihydrofolate reductase and determination of the nucleotide sequence of the reductase gene" Nucl. Acids Res. 9: 697-710 (1981) ). Details hinsichtlich der Bestimmung des Plasmid R388- Dihydropteroat-Synthetasegens, Substitution des ursprünglichen bakteriellen Promoters in beiden Genen durch einen Promoter von P. chrysogenum, und Transformationsfrequenzen der verschiedenen Konstruktionen werden in den Beispielen beschrieben.
  • Diese Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen und Beispiele näher erläutert, dabei zeigen:
  • Fig. 1 die Konstruktion eines EcoRI Kassettenfragments, enthaltend das Strukturgen von DHFR aus R388. o SaU3AI Stellen, Δ TaqI Stellen. Der punktierte Bereich ist der offene Leseraster (ORF) von DHFR.
  • Fig. 2 eine Nucleotidsequenz des EcoRI Kassettenfragments, enthaltend das DHFR Gen von R388. Der ORF des DHFR Gens ist umrandet. AluI Erkennungssequenzen sind unterstrichen.
  • Fig. 3 eine physikalische Karte von pPctrpC1. Symbole bedeuten: E EcoRI; H HindIII; Ha HaeIII; N NcoI; Ns NsiI; P PstI; S SalI; Sm Smal; X xbaI. Umrandet ist das Sau3AI Fragment der P. chrysogenum DNA, enthaltend das trpC Gen. Die punktierte Umrandung ist der trcP ORF. p: trpC Promoter. t: trpC Terminator. Die einfache Linie stellt pUC13 dar.
  • Fig. 4 die Konstruktion von pFS1 und pFS2. Die hell punktierte Umrandung ist das trpC ORF Gen, die dunkel punktierte Umrandung ist das Mtxr Gen. Für Enzyme gilt das Benennungssystem und die Symbole von Fig. 3. ( ) stellt das gefüllte Ende des entsprechenden Restriktionsschnittes dar. A AluI.
  • Fig. 5 eine physikalische Karte des 1.7 Kb BamHI Fragments von R388 enthaltend das Dihydropteroat-Synthetasegen.
  • Fig. 6 die Konstruktion von pML1 und pML2. Die hell punktierte Umrandung ist der trpC ORF, die dunkel punktierte Umrandung das Sur Gen. Für Enzyme gilt das Benennungssystem und die Symbole von Fig. 3. ( ) stellt das gefüllte Ende des entsprechenden Restriktionsschnittes dar.
    • BEISPIELE Beispiel 1 Vektoren mit dem R388-Dihydrofolat-Reduktasegen unter der Kontrolle des P. chrysogenum trpC Promoters und Terminators -Konstruktion eines EcoRI Kassettenfragments enthaltend das R388 Dihydrofolat-Reduktasegen.
  • Das Dihydrofolat-Reduktasestrukturgen des Plasmids R388 ist 236 bp (Basenpaare) lang und ist in einem PvuII- EcoRI Fragment mit 1160 bp enthalten (Swift, G., McCarthy, et al "DNA sequence of a plasmid-encoded dihydrofolate reductase." Mol. Gen. Genet. 181: 441-5447 (1981). Zolg, J.W. et al "Characterization of a R plasmid-associated, trimethoprim-resistant dihydrofolate reductase and determination of the nucleotide sequence of the reductase gene." Nucl. Acids Res. 9: 697-710 (1981)).
  • Um ein Fragment mit der vollständigen Nucleotidsequenz des Strukturgens zu erhalten, wo die meisten der 5' Upstream-Sequenzen deletiert wurden, wurde aus dem PvuII- EcoRI Fragment ein Sau3AI-EcoRI Fragment mit 278 bp geklärt, das 156 bp des Strukturgens (3' Ende plus zusätzliche 122 bp) enthielt und das angrenzende TaqI-Sau3AI Fragment mit 84 bp enthaltend die 5' 80 bp des Strukturgens plus zusätzlicher 4 bp upstream vom ursprünglichen ATG. Die Ligation der zwei Fragmente ermöglichte die Rekonstruktion des Strukturgens mit TaqI-EcoRI Enden. Um das Kassetten EcoRI Fragment zu gewinnen, wurden zwei Oligonucleotide synthetisiert, die nach neuerlichem Vergüten EcoRI-TaqI Enden aufwiesen. puC13, aufgeschlossen mit EcoRI und behandelt mit Phasphatase, wurde mit den zwei Fragmenten gemischt und die wieder vergüteten Oligonucleotide und Ligase zugesetzt. E. coli DH1- kompetente Zellen wurden mit der Mischung transformiert. Klone, die das geeignete Konstrukt enthielten, wurden ausgewählt. Fig. 1 zeigt die Konstruktion dieser EcoRI Kassette und die Sequenz ist in Fig. 2 gezeigt.
    • - Ein AluI Fragment der EcoRI Kassette.
  • Das 378 pb EcoRI Fragment wurde mit AluI aufgeschlossen (siehe Fig. 2). Ein 284 bp Fragment wurde mittels Elektrophorese auf Polyacrylamid (PAA) Gel getrennt und durch Extraktion mit 0,5 M Ammoniumacetat 1 mM EDTA gereinigt.
    • - P.chrysogenum trpC Promoter und Terminator.
  • Die codierende Sequenz des P.chrysogenum trpC Gens wurde veröffentlicht (Sänchez, F. et al "The complete nucleotide sequence of the trpC gene from P.chrysogenum", Nucl. Acides Res. 15 1874 (1987). Plasmid pPctrpC1 (Sänchez, F., et al "Molecular cloning and characterization of the trpC gene from P.chrysogenum", Mol. Gen. Genet. 205: 248-252 (1986)) enthält 350 bp upstream vom ursprünglichen ATG des trpC gens und 289 bp downstream vom Stoppcodon. Fig. 3 zeigt eine Karte von pPctrpC1, wo die relevanten Eigenschaften dieses Konstrukts gezeigt sind. Das Plasmid pPctrpC1 wurde hinterlegt (NCIB 12222).
  • In den 5' 350 bp ist eine einzige HaeIII Restriktionsstelle (weitere HaeIII Stellen sind in pUC13, trpC Gen und trpC Terminator-Sequenzen), die 2 bp upstream vom ursprünglichen ATG liegt. Um ein die Promotersequenz dieses Gens enthaltendes Fragment zu erhalten, wurde ein EcoRI- HaeIII Fragment mit 346 bp aus pPctrpC1 gereinigt.
  • In pPctrpC1 ist eine einzige NsiI Erkennungssequenz vorhanden, 16 bp downstream vom Stoppcodon. Plasmid pPctrpC1 wurde mit NsiI aufgeschlüsselt, die klebrigen Enden durch T4 DNA Polymerase-Aufschlüsselung in stumpfe Enden umgewandelt und das linearisierte Plasmid mit EcoRI aufgeschlüsselt. Auf diese Weise wurden zwei Fragmente gewonnen, eines enthaltend das Promoter und trpC Gen (2,6 Kb) und das andere (3 kb) enthaltend den ursprünglichen Vektor (pUC13) plus der Terminatorsequenz des trpC Gens. Dieses letztere Fragment wurd vom 2,6 kb Fragment durch PAA Gel-Elektrophorese getrennt und durch Extraktion mit 0,5M Ammoniumacetat 1mM EDTA gereinigt.
    • -Ligation des Promoters, Terminators und Gens: Vektor pFS1.
  • Fragmente des Mtxr Gens (284 bp), trpC Promoter (350 bp) und pUC13-trpC Terminator (3 kb) wurden in einem Molarverhältnis von 1:1:1 vermischt und mit T4 DNA Ligase behandelt. E.coli DH1-kompetente Zellen wurden mit der Mischung transformiert und Klone enthaltend die geeignete Sequenz in geeigneter Ausrichtung wurden ausgewählt. Das Plasmid eines dieser Klone wurde pFS1 benannt. Fig. 4 zeigt die Konstruktion und die Karte von pFS1.
    • -Ein Vektor enthaltend die trpC und Mtxr Marker: pFS2.
  • Ein SmaI-XbaI Fragment enthaltend die Sequenz trpC Promoter-Mtxr Gen-trpC Terminator wurde durch Aufschlüsselung mit den entsprechenden Enzymen aus pFS1 gewonnen. Das XbaI klebrige Ende wurde mittels Klenow-Polymerase geglättet und dieses Fragment mit SmaI-aufgeschlüsselten pPctrpC1 verbunden. E. coli DH1 kompetente Zellen wurde mit der Mischung transformiert und Inserte enthaltende Klone ausgewählt. Alle analysierten Klone enthielten das Mtxr Gen mit der gleichen Transkriptions-Richtung wie das trpC Gen. Das Plasmid eines dieser Klone wurde pFS2 benannt. Die Konstruktion und Karte von pFS2 sind in Fig. 4 gezeigt.
    • Beispiel 2 Vektoren mit dem R388-Dihydropteroat Synthetasegen unter Kontrolle des P. chrysogenum trpC Promoters und Terminators. - Sequenz des Plasmid R388 Dihydropteroat Synthetase-Gens und ein DNA Fragment, das dieses enthält.
  • Das Plasmid R388 enthält das Dihydropteroat Synthetase-Gen in einem BamHI Fragment mit 1,7 kb (Ward, J.M. et al "Physical and genetic analysis of the Inc-W group plasmides R388, Sa and R7K." Plasmid 7: 239-250 (1982)). Eine Analyse durch Subklonieren von verschiedenen Subfragmenten, die Sulfonamid Resistenz in E. coli ausdrücken oder nicht, zusammen mit einer teilweisen Nucleotidsequenz zeigen an, daß das putative Strukturgen sich zwischen einem NcoI und einem AvaI Restriktionsort befindet (Fig. 5). Das größere NcoI-BamHI Fragment mit 1,15 kb wurde in nachfolgenden Konstrukten als Struktur-Dihydropteroat-Synthetase-Gen verwendet.
    • -P.chrysogenum trpC Promoter und Terminator.
  • -pPctrpC1 enthält einen einzelnen NcoI Restriktionsort (CCATGG), der das ursprüngliche ATG des trpC Gens überlappt - siehe Fig. 3, (S nchez, F. et al "The complete nucleotide sequence of the trpC gene from P.chrysogenum" Nucl. Acids Res. 15 1874 (1987)). Es enthält ebenfalls einen einzigen NsiI Ort 16 bp downstream vom Stoppcodon des Gens. Daher ergab die Aufschlüsselung von pPctrpC1 mit NsiI (und Umwandlung der klebrigen Enden in stumpfe Enden mittels T4 DNA Polymerase), mit anschließender Aufschlüsselung mit NcoI und Reinigung des größeren Fragments (3,35 kb) den ursprünglichen Vektor pUC13, der mit dem Promoter und dem Terminator des trpC Gens gekoppelt ist.
    • -Ligation des Promoters, Terminators und Gens: PML1.
  • Das somit gewonnene Fragment wurde mit dem NcoI- BamHI Fragment des Gens verbunden (wo das BamHI klebrige Ende mittels Klenow Polymerase in ein stumpfes Ende umgewandelt wurde). E. coli DH1-kompetente Zellen wurden mit der Mischung transformiert und Klone, die das Konstrukt enthielten, ausgewählt. Das Plasmid eines dieser Klone wurde gereinigt und pML1 benannt. Die Konstruktion und die Karte von pML1 sind in Fig. 6 gezeigt.
    • -Ein Vektor enthaltend die trpC und Sur Marker: pML2.
  • Ein smaI-SaII Fragment enthaltend die Sequenz trpC Promoter -Sur Gen trpC Terminator. Das SaII klebrige Ende wurde in ein stumpfes Ende umgewandelt und das Fragment mit SmaI-aufgeschlüsseltem pPctrpC1 verbunden. E. coli DH1-kompetente Zellen wurden mit der Mischung transformiert und Klone, die das gewünschte Konstrukt enthielten, wurden ausgewählt. Alle analysierten Klone enthielten das Sur Gen mit der gleichen Transkriptionsrichtung wie das trpC Gen. Das Plasmid aus einem dieser Klone wurde pML2 benannt. Fig. 6 zeigt die Konstruktion und Karte von pML2.
    • Beispiel 3 Transformation von P. chrysogenum trp2 in MTX Resistenz.
  • P.chrysogenum trp2 wurde im Commonwealth Mycological Institute unter der Referenz-Nummer CMICC 3027092 hinterlegt.
  • 50 ml des mit Tryptophan (250 ug/ml) und Indol (50 ug/ml) ergänzten halbdefinierten Mediums wurden mit 10&sup5; Sporen/ml beimpft und 44 Stunden bei 28ºC inkubiert (Schütteln, 300 U/min.). Myzel wurde durch Filtrieren wiedergewonnen, gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen und in 1,2M KCl (10 ml pro Gramm Naßgewicht) wieder suspendiert. Durch Inkubation dieser Suspension mit Novozyme 234 (Novo Enzyme Industries, 20 mg pro Gramm Myzel) bei 28ºC während 4 bis 5 Stunden unter leichtem Schütteln wurden Protoplaste gebildet. Die Protoplaste wurden vom Myzeldebris durch Filtrieren durch Glaswolle getrennt, mittels Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (10 Minuten, 800 g) pelletiert, mit 1,2M KCl gewaschen und schließlich in 0,5 ml aus 1,2M KCl pro Gramm ursprünglichem Naßgewicht wieder suspendiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Protoplaste unter dem Mikroskop gezählt und geeignete Verdünnungen in mit Tryptophan (250 ug/ml) und Indol (50 u/ml) ergänztem MM und im gleichen Medium, das einen osmotischen Stabilisator (1,2M KCl) enthielt, plattiert. Für die Transformation wurden Protoplaste durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert, in 10 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl&sub2;, 1,2 M KCl, pH-Wert 8,0, wieder suspendiert (10&sup9; Protoplaste/ml) und während 10 Minuten bei 30ºC inkubiert. 0,1 ml Proben wurden mit Plasmid DNA gemischt und 2 ml aus 30%igem PEG 6000, 10 mM CaCl&sub2;, 1,2 M KCl, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, wurden beigemengt und die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Protoplaste wurden nach Wiedergewinnung durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit in 1 ml aus 1,2M KCl wieder suspendiert.
    • Die in diesem Experimenten verwendeten DNA waren die Plasmide pFS1 und pFS2.
  • Zum Plattieren wurden Proben der behandelten Protoplaste mit 5 ml eines bei 50º C gehaltenen osmotisch stabilisierten Agarmediums gemischt (siehe unten) und Petrischalen, die 30 ml des Mediums enthielten, wurden mit der Mischung überschichtet. Bei der Selektion für Methotrexat-Resistenz war das Arzneimittel (2625 ug) nur im überschichteten Medium vorhanden, wobei die Menge für eine Endkonzentration von 75 ug/ml im Gesamtvolumen des Mediums berechnet ist.
  • Mit pFS2 transformierte Protoplaste wurden auf Minimalmedium, das den osmotischen Stabilisator enthielt (Auswahl für trp+ Transformanten), auf Minimalmedium, das Tryptophan, Indol, den osmotischen Stabilisator und Mtx enthielt (Auswahl für Mtxr Transformaten) und auf Minimalmedium, das den osmotischen Stabilisator und Mtx (Auswahl für Doppeltransformanten trp+, Mtxr) enthielt, plattiert. Trp+ Transformanten traten in der üblichen Häufigkeit von 50 pro ug auf, wurden diese Klone aber hinsichtlich ihrer Ausprägung von Mtx-Resistenz untersucht (durch Ausstreichen auf 75 ug/ml Mtx enthaltendes Minimalmedium), hatten nur 4% eine Ausprägung für die Resistenz. Mtx resistente Transformanten oder Doppeltransformanten traten mit einer Häufigkeit von 0,6 - 6 pro ug auf, was dem obigen Ergebnis entspricht. Alle Mtx resistenten Transformanten waren zusammen mit trp+.
  • Mit pFS1 (dem Teile des trpC Gens fehlen) transformierte Protoplaste wurden nur für Mtx Resistenz ausgewählt. Sie traten mit einer Häufigkeit von 0,6 pro ug auf.
  • Eine Southern-Blot-Analyse der Gesamt-DNA der Transformanten ergab, daß jene Klone, die Mtx Resistenz ausprägten, mehrere Kopien des Transformanten-Plasmids, und zwar in Tandem-Weise integriert, enthielten.
  • Somit transformieren pFS1 und pFS2 P. chrysogenum trp2 in Methotrexat Resistenz. Die Tatsache, daß die Auswahl für Methothrexat zu mehreren Kopien des in dem Genom integrierten Vektors führt, obwohl die Transformationsfrequenz abnimmt, bedeutet, daß jede in diesem Vektor eingeschobene Sequenz in den transformierten Klonen in Mehrfachkopien vorkommt. pFS1 und pFS2 enthalten einzelne Restriktionsorte für die Enzyme EcoRI, PstI, SmaI und XbaI, die auf keinen der Marker einwirken, weshalb sie als Klonierungsstellen verfügbar bleiben.
    • Beispiel 4 Transformation von P. chrysogenum ATCC 10003 in MTX Resistenz.
  • Protoplaste des Stamms P. chrysogenum ATCC 10003 wurden gemäß Beschreibung für den P. chrysogenum trp2 Stamm (Beispiel 3) zubereitet, abgesehen davon, daß Indol und Tryptophan im Inkubationsmedium weggelassen wurden.
  • Die in den Experimenten verwendeten DNA waren pFS1 und pFS2. Die Auswahl für Mtx Resistenz erfolgte durch Plattieren der Protoplaste auf Minimalmedium, das den osmotischen Stabilisator und Mtx enthielt, um eine Endkonzentration von 75 ug/ml zu ergeben. Mtx resistente Transformanten traten mit einer Häufigkeit von 1 pro ug auf.
  • Infolgedessen sind die Vektoren pFS1 und pFS2, zusätzlich zu den in Beispiel 3 genannten Vorteilen, in der Lage, einen Wildtyp-Stamm von P. chrysogenum in Mtx Resistenz zu transformieren und, dementsprechend, jeden anderen auf Mtx empfindlichen P. chrysogenum-Stamm.
    • Beispiel 5 Transformation von P. chrysogenum trp2 in SU Resistenz.
  • Es wurden Protoplaste gemäß Beschreibung in Beispiel 3 zubereitet und mit pML2 transformiert.
  • Zum Plattieren wurden Proben der behandelten Protoplaste mit 5 ml eines bei 50º C gehaltenen osmotisch stabilisierten Agarmediums gemischt (siehe unten) und Petrischalen, die 30 ml des Mediums enthielten, wurden mit der Mischung überschichtet. Bei der Selektion für Sulfamethoxazol-Resistenz war das Arzneimittel (70 ug) nur im überschichteten Medium vorhanden, und zwar in einer Endkonzentration von 2 mg/ml des Gesamtvolumens.
  • Die Auswahl erfolgte für trp+ Phenotyp (mittels Plattieren auf Minimalmedium plus dem osmotischen Stabilisator), für Sulfamethoxazol-Resistenz (mittels Plattieren auf Minimalmedium enthaltend Indol, Tryptophan, den osmotischen Stabilisator und Sulfamethoxazol) und für trp+ und Sulfamethoxazol Resistenz (mittels Plattieren auf Minimalmedium enthaltend den osmotischen Stabilisator und Sulfamethoxazol). Trp+ Klone traten mit der üblichen Häufigkeit von 50 pro ug auf. Wurden diese Klone aber im Hinblick auf die Ausprägung von Sulfamethoxazol-Resistenz untersucht (durch Ausstreichen auf Minimalmedium enthaltend Sulfamethoxazol in einer Konzentration von 2mg/ml), hatten ungefähr 35% eine Ausprägung der Resistenz. Su resistente Transformanten oder Doppeltransformanten traten mit einer Häufigkeit von 10 - 15 pro ug auf, was dem obigen Ergebnis entspricht. Alle Sulfamethoxazol resistenten Transformanten waren zusammen mit trp+.
  • Mit Plasmid pML1 (dem Teile des trpC Gens fehlen) transformierte Protoplaste wurden nur für Su Resistenz ausgewählt. Sie traten mit einer Häufigkeit von 5 pro ug auf.
  • Eine Southern-Blot-Analyse der Gesamt-DNA der Transformanten ergab, daß jene Klone, die Sulfamethoxazol Resistenz ausprägten, das Transformanten-Plasmid enthielten. Somit transformieren pML1 und pML2 P. chrysogenum trp2 in Sulfamethoxazol Resistenz. pML1 und pML2 enthalten einzelne Restriktionsorte für die Enzyme EcoRI und SmaI, die auf keinen der Marker einwirken, weshalb sie als Klonierungsstellen verfügbar bleiben.
    • Beispiel 6 Transformation von P. chrysogenum ATCC 10003 in SU Resistenz
  • Protoplaste wurden gemäß Beschreibung in Beispiel 4 zubereitet. Die in den Experimenten verwendeten DNA waren pML1 und pML2. Die Auswahl für Sulfamethoxazol Resistenz erfolgte durch Plattieren auf Minimalmedium enthaltend den osmotischen Stabilisator plus Sulfamethoxazol in einer Konzentration von 2 mg/ml. Die Klone mit einer Ausprägung des Resistenzgens traten mit einer Häufigkeit von 0,5 pro ug auf.
  • Infolgedessen sind pML1 und pML2, zusätzlich zu den in Beispiel 5 genannten Vorteilen, in der Lage, einen Wildtyp-Stamm von P. chrysogenum in Sulfamethoxazol Resistenz zu transformieren und, dementsprechend, jeden für Sulfamethoxazol empfindlichen P. chrysogenum Stamm.
  • Die Plasmide wurden am 23. März 1987 im National Collection of Industrial Bacteria in Stämmen von E. coli DH1 wie folgt hinterlegt:
  • Stamm AM949 enthaltend p FS1 : NCIB 12436
  • Stamm AM950 enthaltend p FS2 : NCIB 12437
  • Stamm AM951 enthaltend p ML1 : NCIB 12438
  • Stamm AM952 enthaltend p ML2 : NCIB 12439.

Claims (10)

1. Arzneimittelresistenter Stamm von Penicillium chrysogenum, bei dem die Arzneimittelresistenz durch ein Segment der heterologen DNA verliehen wird, das in der Lage ist, Sulfonamid-, Trimethoprim- oder Methotrexat-Resistenz zu verleihen.
2. Stamm nach Anspruch 1, bei dem diese DNA ein heterologes Gen oder Gene ist, das operabel an eine Penicillium chrysogenum Promoterregion gekoppelt ist.
3. Stamm nach Anspruch 2, bei dem diese Promoterregion identifizierende Eigenschaften der Promoterregionen hat, die die Ausprägung eines trpC-Gens steuern.
4. Stamm nach Anspruch 3, bei dem das trpC-Gen ein trpC-Gen in pPctrpC1 (NCIB-12222) oder pPctrpC6 (NCIB-12223) ist.
5. Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Resistenzgen vom Plasmid R388 abgeleitet ist.
6. Stamm nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Arzneimittelresistenz durch mehr als ein Segment der heterologen DNA verliehen wird, wobei jedes gegen jedes der Arzneimittel Sulfanomid, Trimethoprim und Methotrexat Resistenz verleiht.
7. Vektor, der in der Lage ist, Resistenz gegen Penicillium chrysogenum zu verleihen, umfassend zumindest ein Methotrexat, Trimethoprim oder Sulfonamid Resistenzgen, das operabel an eine trpC-Promoterregion gekoppelt ist.
8. Plasmid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
pFS1, NCLB 12346
pFS2, NCLB 12347
pML1, NCLB 12348, und
pML2, NCLB 12349.
9. Stamm von Penicillium chrysogenum, der mit einem der Vektoren nach Anspruch 7 oder 8 transformiert wurde.
10. Verfahren, Arzneimittelresistenz gegen Penicillium chrysogenum zu verleihen, umfassend die Resistenzverleihung gegen die Arzneimittel Sulfonamid, Trimethoprim oder Methotrexat gegen Pennicillium chrysogenum, in dem die Arzneimittelresistenz durch Transformation mit einem heterologen Segment der DNA verliehen wird, in dem die Arzneimittelresistenz als domonierender Marker kodiert ist.
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