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Die
Erfindung betrifft Verbindungen und deren Verwendung zur selektiven
Vernichtung von hypoxischen Tumorzellen nach den Patentansprüchen 1 und
2, wobei den Zellen die erfindungsgemäße Verbindung unmittelbar verabreicht
wird sowie eine Verwendung dieser Verbindung zur Radiosensibilisierung
hypoxischer Tumorzellen nach Patentanspruch 3, wobei den Zellen
die erfindungsgemäße Verbindung
ebenfalls direkt verabreicht wird.
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Radiosensibilisatoren
für hypoxische
Zellen sind Verbindungen, die in selektiver Weise die Empfindlichkeit
hypoxischer Zellen für
zerstörende
Strahlung erhöhen.
Zytotoxine, die unter hypoxischen Bedingungen erhöhte Wirksamkeit
aufweisen, bilden ebenfalls ein Mittel für die selektive Zerstörung von
Zellen unter niedrigem Sauerstoffdruck. Diese Spezifizität für hypoxische
Zellen ist wichtig, weil gerade Tumoren durch solche Zellen gekennzeichnet
sind. Praktisch alle Tumoren, die als feste Massen vorliegen, enthalten
diese Zellen, wogegen normale Zellen im allgemeinen ausreichend
mit Sauerstoff versorgt sind. Infolgedessen können tumorwidrige Mittel aufgrund
hoher Wirksamkeit unter hypoxischen Bedingungen für Tumoren
selektiv gemacht werden, und in Anwesenheit dieser Sensibilisatoren
kann eine Strahlenbehandlung mit besserer Wirkung angewandt werden.
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Selbstverständlich ist
der Einsatz einer Strahlenbehandlung zur Vernichtung von Tumorzellen
nur sinnvoll, wenn eine Schädigung
des umgebenden normalen Gewebes minimiert bzw. vermieden werden
kann. Die Auswirkungen der Strahlung werden durch die Anwesenheit
von Sauerstoff verstärkt,
und es ist gesichert, daß mit
steigender Strahlungsdosis die Wirksamkeit hinsichtlich der Vernichtung
von Zielzellen ganz dramatisch zunimmt, wenn Sauerstoff anwesend
ist. Daher ist eine Selektivität
für Tumorzellen
in bezug auf Strahlung schwer zu erreichen; normale Zellen sind
wegen ihrer Sauerstoffversorgung im allgemeinen empfänglicher
für Strahlung
als die Tumorzellen, die zu vernichten sind. Es ist also erwünscht, ein
Mittel zur Sensibilisierung von Tumorzellen, jedoch nicht des umliegenden
Gewebes, für
eine Strahlenbehandlung anzugeben. Eine Lösung würde darin bestehen, die Sauerstoffzufuhr
zu diesen Tumorzellen zu steigern. Dies hat sich jedoch als schwer
durchführbar
erwiesen.
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Es
wurden bereits die verschiedensten heterocyclischen Verbindungen,
speziell solche mit oxidierten Stickstoffanteilen, für die Radiosensibilisierung
hypoxischer Tumorzellen eingesetzt. Es wurde sogar behauptet, daß die Funktionalität des oxidierten
Stickstoffs für
diese Wirksamkeit verantwortlich ist. Nitroimidazole, insbesondere
Misonidazol (MIS) und Metronidazol sind gründlich untersucht worden, und
MIS wird üblicherweise
als Standard bei In-vitro- und In-vivo-Tests auf eine Radiosensibilisierungs-Wirksamkeit
eingesetzt (vgl. z. B. Asquith et al., Radiation Res (1974) 60:108-118;
Hall et al., Brit J Cancer (1978) 37:567-569; Brown et al., Radiation
Res (1980) 82:171-190; und US-PS 4 371 540). Die Radiosensibilisierungs-Wirksamkeiten
bestimmter l-substituierter 3(5)-Nitro-s-triazole und ver schiedener
Chinoxalin-1,4-dioxid-Derivate wurden ebenfalls beschrieben.
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Ferner
ist in den eigenen US-Patentanmeldungen Serial-Nr. 730 761 (3. Mai
1985) und Serial-Nr. 788 762 (18. Okt. 1985) eine Gruppe von Radiosensibilisatoren
angegeben, die keinen oxidierten Stickstoff enthalten – die substituierten
Benzamide und Nicotinamide und ihre Thio-Analoga. Diese Verbindungen
sind trotzdem Radiosensibilisatoren. Es ist wichtig, die Fähigkeit
zur selektiven Sensibilisierung hypoxischer Zellen, z. B. durch
Erhöhung
ihrer Sauerstoffversorgung, von einem anderen Mechanismus zu unterscheiden,
der allgemein bei der "Sensibilisierung" von Zellen angetroffen
wird, und zwar von der Inhibierung des Enzyms Poly(ADP-ribose)polymerase,
von dem angenommen wird, daß es
für die
Reparatur bestrahlter Zellen nach der Bestrahlung wesentlich ist.
Dieser Reparaturmechanismus ist in hypoxischen und in normalen Zellen
wirksam. Daher wird durch die Verabreichung von "Radiosensibilisatoren", die nach diesem
letztgenannten Mechanismus wirken, das gewünschte Ziel der selektiven
Sensibilisierung von Zieltumorzellen nicht erreicht.
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Eine
Gruppe von Verbindungen, die bisher nicht für den Einsatz zur selektiven
Vernichtung hypoxischer Zellen oder zur Radiosensibilisierung solcher
Zellen vorgeschlagen wurde, umfaßt 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-di-N-oxid
und verwandte Verbindungen. Die US-PS'en 3 980 779, 3 868 371 und 4 001 410
beschreiben die Herstellung einer Gruppe dieser Verbindungen und
ihren Einsatz als Bakteriostatika, insbesondere bei Zugabe dieser
Stoffe zu Viehfutter. Die US-PS'en
3 991 189 und 3 957 799 geben Derivate dieser Verbindungen an, die
Substituenten am Stickstoff der 3-Aminogruppe aufweisen. Diese Verbindungen
haben ebenfalls bakteriostatische Wirksamkeit.
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Aus
J. Am. Chem. Soc., 5. Juli 1954, Seiten 3551 bis 3553 ist ein 5,7-Dichloro-3-Amino-1,2,4-Benzotriazin-1-Oxid
bekannt, allerdings nicht zur Radiosensibilisierung hypoxischer
Zellen, sondern zur Behandlung von Malaria. Darüber hinaus offenbart die Zeitschrift
Int. J. Radiat. Oncol., Biol., Phys., Vol.106, 1987, Seite 29, eine
Benzotriazin-Di-N-Oxidverbindung (SR-4233) als Mittel zum Einsatz
zur Vernichtung hypoxischer Zellen, jedoch ohne die Angabe weiterer
vorteilhafter Ausgestaltungen dieser Verbindung zur Verwendung zur
selektiven Vernichtung von hypoxischen Tumorzellen.
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Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt darin, die bekannten Verbindungen
dahingehend zu verbessern, dass hypoxische Tumorzellen mit verbesserter
Wirksamkeit selektiv vernichtet und die Radiosensibilisierung solcher
Tumorzellen verbessert wird.
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Die
Erfindung ist in den Patentansprüchen
1 bis 3 gekennzeichnet.
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Die
vorliegende Erfindung gibt weitere Verbindungen an, die spezifisch
eine Radiosensibilisierung hypoxischer Zellen in vitro bewirken
und die ferner für
hypoxische Zellen sowohl in vitro als auch in vivo direkt zytotoxisch
sind. Daher werden durch Verabreichung dieser Verbindungen vor oder
nach einer Strahlenbehandlung von Tumoren diejenigen hypoxischen
(Tumor)zellen, die die Strahlendosis überleben, selektiv vernichtet.
Sowohl die Fähigkeit
dieser Verbindungen zur Radiosensibilisierung hypoxischer Zellen
in vitro als auch insbesondere ihre Fähigkeit zur direkten selektiven
Vernichtung hypoxischer Zellen sind überraschende Eigenschaften
dieser Verbindungen.
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Die
Erfindung liefert eine wertvolle Bereicherung der Gruppe von Verbindungen,
die derzeit als selektive Radiosensibilisatoren und selektive zytotoxische
Mittel für
hypoxische Tumorzellen verfügbar
sind. Einige der in dieser Beziehung nützlichen Verbindungen sind
bekannt, andere sind neu. Ein Aspekt der Erfindung ist daher eine
Verbindung der folgenden Formel:
mit X = OH, OR, oder NR
2 und n = 1 oder bei X = NHR, wobei R jeweils
unabhängig
ein Alkyl mit 1-4 Kohlenstoffatomen, ein Amid oder eine Morpholino-Komponente
ist und weiter mit Hydroxy-, Alkoxy-, Amino- oder Halogen-Substituenten
substituiert sein kann;
Y
1 und Y
2 jeweils unabhängig entweder Kohlenwasserstoffreste
(C
3-C
14), einschließlich zyklische
und ungesättigte
Kohlenwasserstoffreste sind, fakultativ substituiert mit 1 oder
2 Substituenten, die eine Halogeno-, Hydroxy-, Epoxy-, Amino- (einschließlich Morpholino-),
Carboxy-, Carbamyl- oder Alkylcarbamyl- Gruppe sind, wobei die Alkylcarbamyl-Gruppe
durch -C(O)NHR' mit
R' enthaltend 1-4
Kohlenstoffatome und der Aminosubstituent der Amino- (einschließlich Morpholino-)
Gruppe durch NH
2, NHR oder NR
2 definiert
ist, wobei R jeweils unabhängig
ein Alkyl mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder ein Morpholino-Anteil ist und ferner
fakultativ substituiert sein kann mit 1-2 Hydroxy-, Alkoxy-, Amino-
oder Halogeno-Substituenten,
und wobei die Kohlenwasserstoffreste
fakultativ von einer einzelnen Ether(-O-)bindung unterbrochen sind,
oder
in der Y
1 und Y
2 jeweils
unabhängig
entweder NHR
1, O(CO)R
1,
NH(CO)R
1, O(SO)R
1 oder
O(POR
1)R
1 sind,
mit R
1 als Hydrocarbylgruppe, die wie oben
definiert fakultativ substituiert ist;
oder in der bei X =
NH
2 und n = 1,
Y
1 und
Y
2 jeweils unabhängig gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste
mit zwischen 7 und 14 Kohlenstoffatomen oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste
mit zwischen 1 und 6 Kohlenstoffatomen sind, wobei jeder Kohlenwasserstoffrest-Substituent unsubstituiert
oder substituiert ist mit einer Halogen-, Hydroxy-, Epoxy-, Amino-,
oder Morpholino-Gruppe, und wobei die Kohlenwasserstoffreste fakultativ
von einer einzelnen Etherbindung unterbrochen sind, oder
Y
1 und Y
2 jeweils
unabhängig
entweder NHR
1, O(CO)R
1,
NH(CO)R
1, O(SO)R
1 oder
O(POR
1)R
1 sind,
mit R
1 als Kohlenwasserstoffrest, der wie
oben definiert fakultativ substituiert ist.
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Die
Verbindungen gemäß der Erfindung
sind daher die Mono- oder Dioxide von fakultativ substituiertem
1,2,4-Benzotriazin, die eine entweder substituierte oder unsubstituierte
Hydroxyl- oder Aminogruppe in der dritten Stellung aufweisen. Es
sind zwar sämtliche
durch die Formel (1) definierten Verbindungen allgemein als Radiosensibilisatoren
wirksam, aber nur diejenigen Verbindungen, die einen 3-Aminosubstituenten
(d.h. X = NH2, NHR oder NR2,
wobei R der obigen Definition entspricht) aufweisen und die Di-N-oxide
(n = 1) sind, sind wirksame zytotoxische Mittel.
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Bestimmte
Verbindungen, die von der Formel (1) mit umfaßt sind, sind bereits als für andere
Zwecke brauchbar bekannt; andere sind dagegen neu. Die von der Erfindung
umfaßten
neuen Verbindungen, die mit den hier angegebenen Verfahren herstellbar
sind, umfassen durch die obige Formel dargestellte Verbindungen in
den drei folgenden Klassen: I. X = OH, OR oder NH2,
wobei R der obigen Definition entspricht; II. X = NH2 oder
NHR, wobei R der obigen Definition entspricht, n = 0 und Y1 und Y2 der obigen
Definition ent sprechen; III. X = NH2, n
= 1, und Y1 und Y2 entsprechen
der obigen Definition, sind jedoch nicht eine Halogengruppe, gesättigtes
Alkyl (1-6C) in nichtsubstituierter oder halogensubstituierter Form,
Alkoxy (1-6C), Carbamyl, Carboxy oder Carboalkoxy (1-6C).
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Anhand
der Zeichnung wird die Erfindung beispielsweise näher erläutert. Es
zeigen:
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1A, 1B, 1C die selektive Zytotoxizität von 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid
für hypoxische Zellen
von Hamster-, Mäuse-
und Humangewebe;
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2 die In-vivo-Wirksamkeit von 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid
bei der verstärkten
Vernichtung von Tumorzellen in Verbindung mit Strahlung; und
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3 die Vernichtung von Tumorzellen in vivo
durch 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid, nachdem der Tumor durch
die intraperitoneale Verabreichung des Antihypertonikums Hydralazin
hypoxisch gemacht worden war.
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A. Die für die Erfindung
nützlichen
Verbindungen
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Die
für die
Radiosensibilisierung hypoxischer Tumorzellen brauchbaren Verbindungen
sind Derivate von 1,2,4-Benzotriazinoxid.
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Die
durch Y1 oder Y2 wiedergegebene
Hydrocarbylgruppe kann 1-14 Kohlenstoffatome enthalten, sie kann
gesättigt
oder ungesättigt,
cyclisch oder acyclisch und fakultativ von einer einzelnen Etherbindung
unterbrochen sein. So kann die unsubstituierte Form von Y1 oder Y2 z. B. Methyl,
Ethyl, n-Propyl, s-Butyl, n-Hexyl, 2-Methyl-n-pentyl, 2-Ethoxyethyl,
3-(n-Propoxy)n-propyl, 4-Methoxybutyl, Cyclohexyl, Tetrahydrofurfuryl,
Cyclohexenyl, 3-(n-Decyloxy)n-propyl, 4-Methyloctyl, 4,7-Dimethyloctyl
u. dgl. sein.
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Das
Hydrocarbyl kann mit einem oder zwei Substituenten wie folgt substituiert
sein: Die Halogeno-Substituenten sind Fluoro-, Chloro-, Bromo- oder
Iodo-Reste. Die durch OR' repräsentierten
Alkoxysubstituenten können
1-4 Kohlenstoffatome enthalten und z. B. Methoxy, n-Propoxy und
t-Butoxy umfassen. Der Aminosubstituent kann NH2,
NHR oder NR2 sein, wobei R jeweils unabhängig ein
Alkyl mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder ein Morpholino-Anteil ist.
R kann fakultativ mit 1-2 Hydroxy-, Alkoxy-, Amino- oder Halogeno-Substituenten
substituiert sein.
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Die
Acyloxy- und Acylamidogruppen sind durch R'COO- und R'CONH- repräsentiert, wobei R' 1-4 Kohlenstoffatome
enthält,
und ihre Thioanaloga sind durch R'CSO- und R'CSNH- repräsentiert.
Alkylsulfonyl und Alkylphosphonyl sind R'SO2 bzw. R'P(OR')O-, wobei R' jeweils unabhängig wie
oben definiert ist. Carboxy ist die Gruppe -C(O)OH; Alkoxycarbonyl
ist -C(O)OR'; Carbamyl
ist -C(O)NH2; und Alkylcarbamyl ist -C(O)NHR'.
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Wenn
X = OH, können
die Verbindungen natürlich
auch als die pharmazeutisch annehmbaren Salze hergestellt werden,
die aus anorganischen Basen wie Natrium-, Kalium- oder Calciumhydroxid
oder aus organischen Basen wie Coffein, Ethylamin oder Lysin gebildet
werden.
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Wenn
X = NH2, können pharmazeutisch annehmbare
Säureadditionssalze
eingesetzt werden. Dabei handelt es sich um Salze mit anorganischen
Säuren
wie Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff- oder Phosphorsäure oder
mit organischen Säuren
wie Essig-, Brenztrauben-, Bernstein-, Mandel-, p-Toluol- sulfonsäure etc. (Aminosubstituenten
an der Hydrocarbyl-Seitenkette
können
natürlich
ebenfalls zu Salzen umgesetzt werden.)
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Das
1,2,4-Benzotriazin kann als Mono- oder Dioxid eingesetzt werden.
Es kann entweder der 1-Stickstoff- oder der Triazinring oxidiert
werden, oder es können
sowohl der 1- als
auch der 4-Stickstoff oxidiert werden.
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Spezielle
besonders bevorzugte Verbindungen, die für die Radiosensibilisierungs-
und zytotoxischen Verfahren nach der Erfindung einsetzbar sind,
umfassen
3-Hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
3-Hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Methoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Methoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Methoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Methoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Ethoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Ethoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Ethoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Ethoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[4-Acetamido-n-butanoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[4-Acetamido-n-butanoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[Acetamido-n-butanoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[4-Acetamido-n-butanoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[1-(2,3-Dihydroxy)propoxy]3-hydroxy-1,2,4,benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[1-(2,3-Dihydroxy)propoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[1-(2,3-Dihydroxy)propoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[1-(2,3-Dihydroxy)propoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[(2-Furyl)methylamino]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[(2-Furyl)methylamino]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[(2-Furyl)methylamino]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[(2-Furyl)methylamino]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(2-Methoxyethylamino)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(2-Methoxyethylamino)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(2-Methoxyethylamino)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(2-Methoxyethylamino)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Carbethoxymethoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Carbethoxymethoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Carbethoxymethoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Carbethoxymethoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[(2-Methoxyethyl)carbamylmethoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[(2-Methoxyethyl)carbamylmethoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[(2-Methoxyethyl)carbamylmethoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[(2-Methoxyethyl)carbamylmethoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[(2-Hydroxyethyl)carbamylmethoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[(2-Hydroxyethyl)carbamylmethoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[(2-Hydroxyethyl)carbamylmethoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[(2-Hydroxyethyl)carbamylmethoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-dioxid;
6(7)-[1-(2-Hydroxy-3-morpholino)propoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[1-(2-Hydroxy-3-morpholino)propoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[1-(2-Hydroxy-3-morpholino)propoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[1-(2-Hydroxy-3-morpholino)propoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-dioxid;
6(7)-[3-Amino-n-propoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[3-Amino-n-propoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-dioxid;
6(7)-[3-Amino-n-propoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[3-Amino-n-propoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-dioxid;
6(7)-[2,3-Epoxypropoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[2,3-Epoxypropoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[2,3-Epoxypropoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[2,3-Epoxypropoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[3-Methoxy-2-hydroxy-n-propoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[3-Methoxy-2-hydroxy-n-propoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[3-Methoxy-2-hydroxy-n-propoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[3-Methoxy-2-hydroxy-n-propoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[4-Ethoxy-3-hydroxy-n-butoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[4-Ethoxy-3-hydroxy-n-butoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[4-Ethoxy-3-hydroxy-n-butoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[4-Ethoxy-3-hydroxy-n-butoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[3,4-Dihydroxy-n-butoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[3,4-Dihydroxy-n-butoxy]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[3,4-Dihydroxy-n-butoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[3,4-Dihydroxy-n-butoxy]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Methyl-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Methyl-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Methyl-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Methyl-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Ethyl-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Ethyl-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Ethyl-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Ethyl-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Chloracetamido-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Chloracetamido-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Chloracetamido-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Chloracetamido-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[(2-Hydroxyethyloxy)acetamido]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[(2-Hydroxyethyloxy)acetamido]3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-[(2-Hydroxyethyloxy)acetamido]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-[(2-Hydroxyethyloxy)acetamido]3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6,7-Dimethoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6,7-Dimethoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6,7-Dimethoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6,7-Dimethoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6,7-Diethoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6,7-Diethoxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6,7-Diethoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6,7-Diethoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Propionyl-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Propionyl-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Propionyl-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Propionyl-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(2-Acetoxyethoxy)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(2-Acetoxyethoxy)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(2-Acetoxyethoxy)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(2-Acetoxyethoxy)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)n-Hexyloxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)n-Hexyloxy-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)n-Hexyloxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)n-Hexyloxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Ethylamino-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Ethylamino-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-Ethylamino-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-Ethylamino-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(2-Methoxyethoxy)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(2-Methoxyethoxy)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(2-Methoxyethoxy)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(2-Methoxyethoxy)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(Aminoacetamido)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(Aminoacetamido)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(Aminoacetamido)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(Aminoacetamido)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(Carbamylmethoxy)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(Carbamylmethoxy)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(Carbamylmethoxy)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(Carbamylmethoxy)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(Carboxymethoxy)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(Carboxymethoxy)3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
6(7)-(Carboxymethoxy)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid;
6(7)-(Carboxymethoxy)3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid;
und
ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze sowie die Thioamid-Analoga
der vorstehenden Liste von Verbindungen. Es ist zu beachten, daß die genannten "Y1-
oder Y2"-Substituenten,
die in den meisten der vorgenannten Verbindungen entweder in der
Stellung 6 oder der Stellung 7 (mit "6(7)" bezeichnet)
oder in der Stellung 6 und der Stellung 7 (mit "6,7" bezeichnet)
vorhanden sind, auch in der Ringstellung 5 und/oder 8 vorliegen
können.
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Von
den oben aufgeführten
Verbindungen, die bei dem Verfahren nach der Erfindung als selektive
zytotoxische Mittel oder als Radiosensibilisatoren nützlich sind,
sind die folgenden neu: durch die obige Formel dargestellte Verbindungen,
bei denen I. X = OH, OR oder NR2, wobei
R jeweils unabhängig
ein Alkylanteil mit 1-4 Kohlenstoffatomen, ein Amidanteil oder ein
Morpholino-Anteil ist und ferner mit Hydroxy-, Alkoxy-, Amino- oder
Halogeno-Substituenten substituiert sein kann, n = 0 oder 1 und
Y1 und Y2 jeweils
unabhängig
entweder H, ein Halogen-Rest, Hydrocarbyl (1-4C) einschließlich ungesättigtes
und cyclisches Hydrocarbyl, fakultativ substituiert mit 1 oder 2
Substituenten, die eine Halogeno-, Hydroxy-, Epoxy-, Alkoxy-, Alkylthio-,
Amino- (einschließlich
Morpholino-), Acyloxy-, Acylamido-Gruppe oder deren Thio-Analoga sind,
Alkylsulfonyl, Alkylphosphonyl, Carboxy, Alkoxycarbonyl, Carbamyl
oder Alkylcarbamyl sind, und wobei die Hydrocarbylgruppe fakultativ von
einer einzelnen Ether(-O-)bindung unterbrochen sein kann, oder wobei
Y1 und Y2 jeweils
unabhängig NHR', O(CO)R', NH(CO)R', O(SO)R' oder O(POR)R' ist, wobei R' eine Hydrocarbylgruppe
ist, die fakultativ wie oben definiert substituiert ist; II. X =
NH2, n = 1 und Y1 sowie
Y2 jeweils unabhängig wie in I. definiert sind;
III. X = NH2, n = 1 und Y1 sowie
Y2 jeweils unabhängig H, Hydrocarbyl (7-14C;
gesättigt
oder ungesättigt),
ungesättigtes
Hydrocarbyl (1-6C), wobei jeder Hydrocarbyl-Substituent unsubstituiert
oder substituiert ist mit Halogen, Hydroxy, Epoxy, Alkoxy, Alkylthio,
Amino (einschließlich
Morpholino), Acyloxy, Acylamido und deren Thio-Analoga, Alkylsulfonyl
oder Alkylphosphonyl, und wobei die Hydrocarbylgruppe fakultativ
von einer einzelnen Ether(-O-)bindung unterbrochen sein kann, oder
wobei Y1 und Y2 jeweils
unabhängig
NHR', O(CO)R', NH(CO)R', O(SO)R' Oder O(POR)R' Sind, wobei R' eine Hydrocarbylgruppe
ist, die wie oben definiert substituiert ist.
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B. Herstellung der Verbindungen
nach der Erfindung
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Allgemeine
Verfahren zur Herstellung einiger 3-Amino-Derivate finden sich in den vorgenannten US-PS'en von Ley et al.,
z. B. US-PS 3 980 779. Die Verbindungen werden hergestellt aus Benzofuroxan
der Formel:
durch Umsetzung mit einem
Cyanamidsalz, gefolgt von Ansäuerung
des Reaktionsgemischs. Das Benzofuroxan-Ausgangsmaterial ist nicht
symmetrisch in bezug auf seine eigenen Stellungen 5 und 6 (die die
Stellungen 6 und 7 des resultierenden 3-Aminobenzotriazinoxids sind).
Daher kann ein Gemisch der 6- und 7-substituierten Stoffe resultieren.
Erwünschtenfalls
kann dieses Gemisch unter Anwendung konventioneller Mittel in Einzelkomponenten
aufgetrennt werden, die einen Substituenten in der Stellung 6 oder
7 haben.
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Das
Dioxid kann ebenfalls aus dem Stamm-Monoxid durch Persäure-Oxidation
hergestellt werden (vgl. Robbins et al., J Chem Soc 3186 (1975)
und Mason et al., J Chem Soc B 911 (1970)).
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Ferner
kann das Monoxid hergestellt werden durch:
- (1)
Cyclisierung einer 1-Nitro-2-aminobenzolverbindung unter Einsatz
von H2NCN;
- (2) Oxidation der durch die Strukturformel gegebenen Stammverbindung
oder kontrollierte Reduktion des entsprechenden Dioxids (vgl. Mason,
wie oben, und Wolf et al., J Am Chem Soc 76:355 (1954)).
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3-Amino-1,2,4-benzotriazine
können
entweder durch Cyclisierung einer Stammverbindung (vgl. Schema I
und Arndt, Chem Ber. 3522 (1913)) oder durch Reduktion des Monoxids
oder Dioxids wie oben angegeben erhalten werden.
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Die
3-Hydroxy-1,2,4-benzotriazinoxide können hergestellt werden unter
Einsatz von Peroxid und Wolframoxid (Schema II), ein neues Syntheseverfahren
zur Herstellung der 3-Hydroxy-1,4-dioxid-Verbindung oder konzentrierte
Schwefelsäure
und Natriumnitrat (Schema III).
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C. Formulierung und Verabreichung
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Gemäß den Verwendungen
nach Anspruch 2 oder 3 können
die oxidierten Benzotriazine nach der Erfindung eingesetzt werden,
um hypoxische Tumorzellen in warmblütigen Trägern zu radiosensibilisieren
bzw. selektiv zu vernichten. Eine Einsatzmöglichkeit ist in Verbindung
mit Mitteln, von denen bekannt ist, daß sie selektiv Hypoxie in Tumoren
erzeugen. Solche Verfahren umfassen den Einsatz von Antihypertonika
wie Hydralazin oder von Mitteln, die die vom Blut mitgeführte Sauerstoffmenge
beeinflussen. Diese Verbindungen werden zwar charakteristisch für die Krebsbehandlung
beim Menschen eingesetzt, sie können
aber auch zur Vernichtung von Tumorzellen in anderen warmblütigen tierischen
Spezies wie anderen Primaten, in der landwirtschaftlichen Tierhaltung
z. B. bei Rindern, sowie bei für
den Sport gebrauchten Tieren und Haustieren, z. B. Pferden, Hunden
und Katzen, eingesetzt werden.
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Man
nimmt an, daß Hypoxie
mit allen Arten fester bösartiger
Tumoren einhergeht. Die Verbindungen nach der Erfindung können daher
zur Radiosensibilisierung oder Vernichtung neoplastischer Epithelzellen,
endothelialer Zellen, Bindegewebs-, Knochen-, Muskel-, Nerven- und
Gehirnzellen eingesetzt werden. Beispiele von Tumoren und Sarkomen
umfassen Tumoren wie solche von Epithel-, azidischen, Nischen-,
Basal-, Basalschuppenzellen, Zervikal-, Nieren-, Lebertumoren, Hurthle-,
Lucke-Tumoren, muzinöse
und Walker-Tumoren, und
Sarkome wie Abernathy-Sarkom, Sarkom des weichen Nischenzellenteils,
Angiolith-, Botryoid-, Hirngewebe-Sarkom, Sarkom des Stützgewebes
der Gebärmutterschleimhaut,
faszikuläres
Ewing-Sarkom, Riesenzellen-, Lympho-, Jensen-Sarkom, Knochenrinden-, Raposi-, Knochenmark-
und Synovial-Sarkom.
Spezielle Beispiele von Tumoren, die mit anderen Radiosensibilisatoren
sensibilisiert wurden, sind von G. E. Adams in Cancer: A Comprehensive
Treatise (Verlag F. Becker), Bd. 6, S. 181-223, Plenum, New York,
1977, angegeben worden.
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Die
Verbindungen können
Patienten oral oder parenteral (intravenös, subkutan, intramuskulkär, intraspinal,
intraperitoneal u. dgl.) verabreicht werden. Wenn die Verbindungen
parenteral gegeben werden, werden sie normalerweise in als Dosiseinheit
injizierbarer Form (als Lösung,
Suspension, Emulsion) mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert.
Solche Träger
sind typischerweise nichttoxisch und nichttherapeutisch. Beispiele
für solche
Träger
sind Wasser, wäßrige Träger wie
Kochsalz-, Ringer-, Dextrose- und Hanksche Lösung sowie nichtwäßrige Träger wie
Fettöle
(z. B. Mais-, Baumawollsaat-, Erdnuß- und Sesamöl), Ethyloleat
und Isopropylmyristat. Sterile Kochsalzlösung ist ein bevorzugter Träger, und
die Verbindungen sind hinreichend wasserlöslich, um eine Lösung für alle vorhersehbaren
Bedürfnisse
herstellen zu können.
Der Träger
kann geringe Mengen Zusatzstoffe enthalten, z. B. Stoffe, die die
Löslichkeit,
die Isotonizität
und die chemische Stabilität
verbessern, etwa Antioxidantien, Puffer und Konservierungsmittel.
Wenn die Verbindungen oral (oder rektal) verabreicht werden, werden
sie normalerweise in Form von Dosiseinheiten wie Tabletten, Dragees,
Suppositorien oder Kapseln formuliert. Solche Formulierungen enthalten
typischerweise einen festen, halbfesten oder flüssigen Träger oder ein solches Verdünnungsmittel.
Beispiele für
Verdünnungsmittel sind
Lactose, Dextrose, Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Stärken, Akaziengummi,
Calciumphosphat, Mineralöl, Gelatine,
Syrup, Methylcellulose, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Methylhydroxybenzoat,
Propylhydroxybenzoat, Talkum und Magnesiumstearat.
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Die
dem Patienten verabreichte Menge der Verbindung ist ausreichend,
um den zu behandelnden malignen Tumor zu radiosensibilisieren oder
Zytotoxizität
in ihm zu erzeugen, liegt aber unter der Menge, bei der toxische
Effekte auftreten könnten.
Diese Menge hängt
von der Art des Tumors, der Spezies des zu behandelnden Lebewesens,
der beabsichtigten Indikationsdosis und dem Gewicht oder der Körperoberfläche des Patienten
ab. Die Strahlung kann an Humanpatienten in vielen unterschiedlichen
Fraktionierungseinheiten verabreicht werden, d. h. die Gesamtstrahlungsdosis
wird in Anteilen über
einen Zeitraum von einigen Tagen bis zu einigen Wochen verabreicht.
Diese Einheiten ändern
sich üblicherweise
von einer Dosis täglich
(d. h. fünf mal
pro Woche) über
einen Zeitraum von bis zu sechs Wochen bis zu einmal wöchentlich über vier
bis sechs Wochen. Eine Einzeldosis des Benzotriazins wird vor oder
nach jeder Strahlenbehandlung verabreicht und liegt etwa im Bereich
von 0,01 bis 20 m mol/kg, normalerweise im Bereich von 0,1-2 mmol/kg.
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Zur
Verwendung als selektive zytotoxische Mittel können die Verbindungen nach
der Erfindung entweder für
sich, zusammen mit Strahlung oder anderen krebszellenschädigenden
Mitteln, mit gefäßwirksamen Medikamenten
(z. B. Hydralazin) oder in Verbindung mit Prozessen, die die Menge
des vom Blut transportierten verfügbaren Sauerstoffs verringern,
z. B. Anämie,
oder mit Medikamenten, die die Bindung von Sauerstoff an Hämoglobin
steigern, eingesetzt werden, wobei alle diese Verfahren selektiv
den Grad der Hypoxie im Tumor erhöhen. Wie bereits erwähnt, sind
zwar sämtliche
von der Formel 1 umfaßten
Verbindungen allgemein als Radiosensibilisatoren wirksam, aber als
selektive zytotoxische Mittel sind nur diejenigen Verbindungen wirksam,
die (substituierte oder unsubstituierte) 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxide (d. h. X
= NH2, NHR oder NR2,
wobei R wie oben definiert ist und n = 1) sind.
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Die
folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
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Beispiel
1: Herstellung von 3-Hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid
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Ein
gerührtes
Gemisch aus 1,50 g (9,25 mmol) 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid (1), 100,0 ml Essigsäure und
30,0 ml 30 % Wasserstoffperoxid wurde mit 3,05 g (9,25 mmol) Na2WO4·2H2O aufbereitet. Das Gemisch wurde in einem Ölbad bei
60 °C für 4 Tage
gerührt.
Das orange-gelbliche Gemisch wurde auf ca. 30° abgekühlt und filtriert unter Abtrennung
eines hellgelben nicht-UV-absorbierenden Feststoffs, der wahrscheinlich
gelbe Wolframsäure
war. Die orangefarbene Wasserstoffperoxidlösung in Essigsäure wurde
sorgfältig
bis zur Halbtrockenheit verdampft unter mehrfacher Zugabe von Wasser
und Essigsäure,
so daß der
größte Teil des
Peroxids entfernt wurde. Die eingeengte Lösung wurde bei Raumtemperatur
stehengelassen und ergab vier Ernten eines orangefarbenen Feststoffs,
0,87 g (42 % Ausbeute des Natriumsalzes von (2). UVmax (20
% CH3OH/H2O): 262,2
(ε 39.460):
477 (ε 7.030).
IR (rein): 3530 μ,
350 μ, 2650 μ, 2180 μ und 1635 μ, Analyse (errechnet
für das
Natriumsalz): C7H4N3O3Na 1,25 H2O, 223,64: C 37,6; H 2,93; N 18,79. Gefunden:
C 37,8; H 2,75; N 18,65.
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-
Beispiel
2: Herstellung von 3-Amino-7-trifluoromethyl-1,2,4-benzotriazin-1-oxid
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Eine
Lösung
aus Na (1,13 g, 49,2 mmol) in Ethanol (50 ml) wurde einer Lösung aus
Guanidinhydrochlorid (4,93 g, 51,6 mmol) in Ethanol (50 ml) zugefügt. Nach
1 h wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde einer Lösung aus
4-Chloro-3-nitro-benzotrifluorid (Aldrich, 5,5 g, 24,4 mmol) in
Ethanol (25 ml) zugefügt. Das
Gemisch wurde für
5 h gerührt
und unter Rückflußkühlung erhitzt,
auf 0-5 °C
abgekühlt,
und der ausgefällte
Feststoff wurde aufgefangen. Der Feststoff wurde mit Wasser und
Ethanol gewaschen und luftgetrocknet unter Erhalt von 0,48 g (9
%) von 3 als hellgelber Feststoff, Schmelzpunkt 300 °C. TLC: Rf 0,60 (9:1 Methylenchlorid : Methanol auf
Silikagelplatten). Massenspektroskopie: M+ =
230 (q = 100).
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Beispiel
3: Herstellung von 3-Amino-7-decyl-1,2,4-benzotriazin-1-oxid
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Herstellung von 4-(1-Decyl)2-nitroanilin;
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Essigsäureanhydrid
(400 ml) wurde über
einen Zeitraum von 30 min einer gerührten Lösung aus 4-Decylanilin (Aldrich,
80 g, 0,34 mol) in Hexanen (2,41) zugefügt. Nach Rühren während 1 h wurde das Gemisch abgekühlt und
während
30 min bei 5-10 °C
mit 70 % Salpetersäure
(34 ml) behandelt. Rühren
wurde bei 5-10 °C
für 1 h
und bei 25 °C
für 16
h fortgesetzt. Das Gemisch wurde mit H2O
(1 l) verdünnt,
für 5 h
gerührt,
in ein offenes Gefäß gegossen
und für
16 h stehengelassen. Nach weiterer Verdünnunf mit H2O
(1,5 l) wurde der Feststoff aus einer 85 % Ethanollösung (in
Wasser) aufgefangen und rekristallisiert unter Erhalt von 92 g (84 %)
des Zwischenprodukts als orangefarbener Feststoff, Schmelzpunkt
64 °C.
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Eine
Lösung
(100 ml) aus 85 % ROH (19 g, 0,288 mol) in H2O
wurde mit einer Suspension aus dem oben hergestellten 4-(1-Decyl)2-nitroanilin
(89 g, 0,28 mol) in Methanol (900 ml) kombiniert. Das Gemisch wurde
für 6 h
gerührt,
auf einen pH-Wert von 7-8 mit konzentrierter HCl neutralisiert und
im Vakuum zur Beinahetrockenheit verdampft. Nach Verdünnung mit
H2O (400 ml) wurde der Feststoff aufgefangen
und luftgetrocknet unter Erhalt von 77 g (100 %) des Zwischenprodukts
als orangefarbener Feststoff, Schmelzpunkt 59 °C.
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1,0
g (8,7 mmol) Chloramidinhydrochlorid (das vorher zum Einsatz hergestellt
wurde durch Behandeln einer Etherlösung von Cyanamid mit HCl-Gas
und Auffangen des ausgefällten
Feststoffs) wurde portionsweise während 10 min einer vorerwärmten Schmelze
(190 °C)
von 4-(1-Decyl)2-nitroanilin, das im vorhergehenden Schritt hergestellt
worden war (500 mg, 1,8 mmol), zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde
für 5 min
bei 190 °C
erhitzt, auf 25 °C
abgekühlt,
mit 6N ROH (10 ml) behandelt und für 1 h bei 90-95 °C erwärmt. Nach
Abkühlung
auf 25 °C
wurde der Feststoff aufgefangen, mit H2O
und Ethanol gewaschen und luftgetrocknet unter Erhalt von 0,25 g
(46 %) der Verbindung 4 in Form eines hellgelben Feststoffs; Schmelzpunkt
177 °C (dec.),
Massenspektrometrie: M+ = 285 (q = 100),
302 (q = 13).
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Beispiel
4: Herstellung von 3-Amino-7-carbamyl-1,2,4-benzotriazin-1-oxid
-
Herstellung von 4-Chloro-3-nitrobenzamid:
-
20,2
g (0,1 mol) 4-Chloro-3-nitrobenzoesäure (Aldrich) und Thionylchlorid
(20 ml) wurden kombiniert, für
16 h stehengelassen und unter Rückflußkühlung für 4 h erwärmt unter
Bildung einer klar-roten Lösung.
Die Lösung
wurde im Vakuum verdampft und mit Benzol azeotropisch gemacht. Der
Rückstand
wurde in Acetonitril (20 ml) gelöst
und über
einen Zeitraum von 30 min kaltem (–10 °C) konzentriertem Ammoniumhydroxid
(100 ml) zugefügt.
Nach 3 h bei –10 °C und 16
h bei 25 °C
wurde das Gemisch in ein offenes Gefäß gegossen und konnte bis zur
Trockenheit verdampfen. Der Rückstand
wurde in H2O aufgeschlämmt, und der Feststoff wurde aufgefangen
und luftgetrocknet unter Erhalt von 19,8 g (98 %) des Zwischenprodukts
in Form eines hellgelben Feststoffs, Schmelzpunkt 153 °C.
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Eine
Lösung
aus Na (3,45 g, 0,15 mol) in Ethanol (75 ml) wurde einer Lösung aus
Guanidinhydrochlorid (15,8 g, 0,165 mol) in Ethanol (75 ml) zugefügt. Nach
1 h wurde das Gemisch filtriert, und das Filtrat wurde mit einer
Suspen sion aus 4-Chloro-3-nitrobenzamid (10 g, 0,05 mol), das wie
oben hergestellt war, in Ethanol (50 ml) kombiniert. Das Gemisch
wurde über
einen Zeitraum von 16 h gerührt
und unter Rückflußkühlung erhitzt,
auf 0-5 °C
abgekühlt
und mit konzentriertem HCl (8 ml) angesäuert. Der aufgefangene Feststoff
wurde mit R2CO3 (28
g, 9,2 mol) und H2O (40 ml) zusammengegeben
und das Gemisch für
8 h gerührt
und auf 100 °C
erwärmt.
Nach Abkühlung
auf 25 °C
wurde der Feststoff aufgefangen, mit H2O
gewaschen und luftgetrocknet. Der Feststoff wurde in siedendem Ethylacetat
suspendiert, aufgefangen und mit heißem Ethylacetat gewaschen.
Der Feststoff wurde wiederholt in siedendem Dioxan suspendiert und
aufgefangen (6 × 100
ml). Das kombinierte Filtrat wurde im Vakuum zu einem Feststoff
verdampft. Der Feststoff wurde in 95 % Ethanol suspendiert, aufgefangen
und luftgetrocknet unter Erhalt von 0,44 g (4,3 %) der Verbindung
5 als hellgelber Feststoff, Schmelzpunkt 300 °C. TLC: Rf =
0,23 (Methylenchlorid : Aceton 2:1. Silikalgelplatten); Massenspektrometrie:
M+ = 205 (q = 100).
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Beispiel
5: Herstellung von 7-Acetyl-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid-Oxim
-
Ein
kombiniertes Gemisch aus 7-Acetyl-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid
(hergestellt in Beispiel 5; 50 mg, 0,25 mmol), Hydroxylaminhydrochlorid
(200 mg, 2,88 mmol), Pyridin (1 ml) und Ethanol (1 ml) wurde für 1 h bei
90-95 °C
erwärmt
und dann auf 25 °C
abgekühlt.
Das Gemisch wurde mit 95 % Ethanol (5 ml) verdünnt, und der Feststoff wurde
aufgefangen und luftgetrocknet unter Erhalt von 30 mg (56 %) einer
Verbindung 6 in Form eines hellgelben Feststoffs, Schmelzpunkt 278 °C (dec.).
TLC: Rf = 0,60 (9:1 Methylenchlorid:Methanol); Massenspektrometrie:
M+ = 219 (q = 100).
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Beispiel
6: Herstellung von 3-Amino-6(7)-decyl-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid
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5-(1-Decyl)benzofuroxan:
Ein kombiniertes Gemisch aus 4-(1-Decyl)2-nitroanilin (77 g, 0,28
mol), 5,25 % NaOCl in H2O(476 g, 0,34 mol),
85 % ROH (20,3 g, 0,31 mol), Bn4NHSO4 (4,7 g, 0,014 mol) und CH2Cl2 (2,28 l) wurde für 6 h sehr schnell gerührt und
mit H2O (500 ml) und CH2Cl2 (1 l) verdünnt. Die abgetrennte organische
Phase wurde nacheinander mit 1N HCl (1 l) und Sole (2 × 1 l) gewaschen,
getrocknet (Na2SO4) und
im Vakuum eingeengt unter Erhalt von 70 g (92 %) eines roten Öls.
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Eine
Lösung
aus 5-(1-Decyl)benzofuroxan, das wie oben angegeben hergestellt
war (10 g, 0,036 mol) und Benzyltriethylammoniumchlorid (0,36 g,
0,0016 mol) in DMSO (180 ml) wurde über einen Zeitraum von mehreren
Stunden allmählich
mit Cyanamid (13,0 g, 0,31 mol) und K2CO3 (36,8 g, 0,27 mol) behandelt. Das Gemisch
wurde für
48 h gerührt
und dann filtriert. Das Filtrat wurde mit H2O
(6 l) und Eisessig (40 ml) verdünnt und
mit CH2Cl2 (4 × 500 ml)
extrahiert. Die kombinierte organische Lösung wurde nacheinander mit
5 % NaHCO3-Lösung (1 × 500 ml) und Sole (2 × 500 ml)
gewaschen, getrocknet (Na2SO4)
und im Vakuum bis zur Trockenheit verdampft. Das Rohprodukt wurde
durch Chromatografie auf Silikagel unter Verwendung von CH2Cl2:Methanol (98:2)
gereinigt unter Erhalt von 1,8 g (16 %) von Verbindung 7 als roter
Feststoff, Schmelzpunkt 155 °C
(dec.). Massenspektrometrie: M+ = 318 (q
= 4), 285 (q = 100).
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Beispiel
7: Herstellung von 7-Chloro-3-hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid
-
Ein
Gemisch aus 1,50 g (7,63 mmol) der Verbindung 8 in 100 ml Essigsäure wurde
mit 2,52 g (7,63 mmol) Na2WO42H2O und 30 ml 30 % H2O2 behandelt. Das Gemisch wurde für die Dauer
von 6 Tagen gerührt und
auf 50 °C
erwärmt
und dann langsam bis zur Trockenheit verdampft unter Abtrennung
des H2O2. Der Rückstand
wurde in 250 ml H2O zum Sieden gebracht
und filtriert unter Abtrennung von ca. 25 mg des Ausgangsmaterials
8. Die wäßrigen Lösungen wurden
dann mit 2 × 250-ml-Portionen
Ethylacetat extrahiert. Ein tiefrotes kristallines Material, das
durch TLC und Massenspektralanalyse als Verbindung 10 charakterisiert
wurde, bildete sich in dem obigen Trenngemisch und wurde durch Filtration
aufgefangen unter Erhalt von 60,0 mg eines gelborangefarbenen Feststoffs
(Ausbeute 3,7 %), der wie folgt als Ver bindung 10 charakterisiert
wurde und gute Löslichkeit
in einem Gemisch aus heißem
Isopropylalkohol und Wasser zeigte. Massenspektrometrie: M+ = 212 (q = 100) (Verbindung 10); TLC: Rf = 0,34 (Aceton, Silikalgelplatten).
-
Die
obigen Ethylacetatlösungen,
die nach der Filtration von der H2O-Schicht
getrennt wurden, um 10 abzutrennen, wurden bis zur Trockenheit verdampft.
Der Rückstand
wurde dann mit Isopropylalkohol bei Raumtemperatur behandelt unter
Erhalt eines dunkelorangefarbenen Feststoffs, 0,41 g (25 % Ausbeute)
der Verbindung 9. Massenspektrometrie: M+ =
213 (q = 70); TLC: Rf = 0,22 (Aceton, Silikagelplatten).
Verbindung 9 wurde als das Ammoniumsalz C7H4ClN3O3NH3, Molekulargewicht 230,61, wie folgt charakterisiert.
Die freie Säure
9 wurde in konzentriertem NH4OH gelöst, dann
in Eis gekühlt
und filtriert, um eine Spur der unlöslichen Verbindung 10 zu entfernen.
Das rote Filtrat und Waschflüssigkeiten
wurden bis zur Trockenheit verdampft unter Zurücklassen eines rötlich-orangefarbenen
Feststoffs. Dieser wurde mit 50 ml siedendem 1,2-Dimethoxymethan
behandelt, auf einem Filter aufgefangen und mit weiteren 25 ml heißem 1,2-Dimethylether
gewaschen. Der Feststoff wurde über
P2O5 bei 56 °C/1,0 mm
getrocknet, wobei 0,244 g (87 % Ausbeute) der Verbindung 11 zurückblieben.
-
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- Errechnete Analyse für
C7H4ClN3O3NH3 (230,61): C
36,5; H 3,06; N 24,30. Gefunden: C 36,5; H 3,07; N 23,94. UVmax (H2O): 219 (ε 12.580);
265,4 (ε 40.000
=; 4830486 (ε 6.640).
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Beispiel 8: In-Vivo-Assay
auf Wirksamkeit in Verbindung mit Strahlung
-
Die
Verbindungen nach der Erfindung wurden in vivo auf ihre Wirksamkeit
durch den Assay nach J.M. Brown, Radiation Res (1975) 64:633-47,
getestet. Für
diesen Assay wurden SCCVII-Karzinome
in weiblichen C3H-Mäusen
mit einem Gewicht von 20-25 g eingesetzt. Diese Mäuse wurden
unter speziellen erregerfreien Bedingungen gezüchtet und waren zu Beginn jedes
Experiments 3-4 Monate alt. Der SCVII-Tumor wurde intradermal in
der Flanke aus einer Beimpfung mit 2 × 105 Tumorzellen
gezogen, die aus dem zweiten bis achten In-vitro-Durchgang der Tumorzellen nach
Entfernung aus dem vorherigen In-vivo-Tumor entnommen waren. Es
wurden zwei Tumoren pro Maus implantiert und als Testtumoren verwendet,
nachdem sie ein Volumen von ca. 100 ml erreicht hatten. Zu diesem
Zeitpunkt enthielten die Tumoren ca. 20 % hypoxische Zellen.
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Die
Testverbindung wurde mit einer unveränderlichen Injektionsdosis
von entweder 5 mmol/kg oder 2/3 der LD50 (je
nachdem, welcher Wert niedriger war) getestet. Geeignete Kontrollen
von mit Testverbindung injizierten, aber unbestrahlten Mäusen sowie
von mit Kochsalzlösung
injizierten und bestrahlten Mäusen
wurden ebenfalls vorgesehen. Eine unveränderliche Strahlendosis von
20 Gy wurde in wechselnden Intervallen von 2 h nach bis 3 h vor
der Injektion des Medikaments angewandt. Durch Anwendung dieser
Intervalle geben die Resultate einen Hinweis sowohl auf die optimale
Bestrahlungszeit als auch das Ausmaß der zusätzlichen Zellenvernichtung
gegenüber
dem reinen Bestrahlen. Die Ergebnisse dieser über einen Zeitraum ablaufenden Experimente
unter Einsatz von 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid sind in 2 dargestellt. Sie zeigen eine gesteigerte
Zellenvernichtung gegenüber
einer reinen Bestrahlung, und zwar mehr, als man auf der Basis der Additivität der beiden
individuellen Zytotoxizitäten
erwarten konnte. Die ähnliche gesteigerte
Zytotoxizität
bei Verabreichung des Medikaments vor oder nach der Bestrahlung
weist eher auf eine selektive Toxizität für die hypoxischen Zellen als
auf einen Radiosensibilisierungseffekt des Benzotriazindioxids hin.
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Die
Bestrahlung der SCCVII-Tumoren erfolgte durch Bestrahlen nichtbetäubter, Tumoren
aufweisender Mäuse
in einem Plexiglaskasten. Die Bestrahlungsbedingungen waren: 250
kVp Röntgenstrahlen,
15 mA, FSC 33 cm, zusätzliche
Filterung von 0,35 mm Cu, Halbwertsschicht 1,3 mm Cu, und eine Dosisrate
von 317 rad/min.
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Das
Ausmaß der
Zellenvernichtung wurde aus der Überlebensrate
der sezierten und in Kulturen angelegten Tumorzellen wie folgt bestimmt.
Die Tumoren aufweisenden Mäuse
wurden 24 h nach der Bestrahlung getötet, und Tumoren wurden aus
der Haut herausgeschnitten, in mehrere Stücke geteilt und durch Hochgeschwindigkeits-Zerkleinern
mit einer an einer Schweifsäge
befestigten Rasierklinge zu einem feinen Brei zerkleinert. Dieser
wurde 30 ml Hankscher gepufferter Salzlösung (HBSS), die 0,02 % DNase,
0,05 % Promase und 0,02 % Collagenase enthielt, zugefügt. Die
Suspension wurde für
30 min bei 37 °C
gerührt,
filtriert und für
10 min bei 4 °C
mit 1600 U/min zentrifugiert. Das Zellenpellet wurde erneut in vollständigem Waymouth-Medium
plus 15 % Fetalkälberserum
und einer mit Trypanblau vermischten aliquoten Menge suspendiert
und in einer Blutkörperchen-Zählkammer
gezählt.
Geeignete Verdünnungen
dieses Serums wurden auf Platten in 60- oder 100-mm-Petrischalen
aus Polystyrol (Lux Scientific Corporation) in 5 oder 15 ml Medium
verbracht. Nach einer Inkubationszeit von 13 Tagen wurden die Kolonien
fixiert und gefärbt,
und diejenigen, die 50 Zellen oder mehr enthielten, wurden gezählt. Die
Verdünnung,
die einen durchschnittlichen Zählwert
von 25-100 Kolonien in einer 60-mm-Schale ergab, wurde für die Berechnung
von Resultaten verwendet.
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Beispiel 9: Zytotoxizitäts-Tests
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Zytotoxizitäts-Tests
wurden durchgeführt
unter Einsatz von 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid und verschiedenen
aeroben und hypoxischen Kulturzellen (Human-, Mäuse- und Hamsterzellen). Die
in Schleuderkolben befindlichen Zellen wurden für 1 h bei 37 °C entweder
mit Luft oder Stickstoff, enthaltend 5 % CO2, begast,
bevor die angegebenen Mengen des Medikaments zugefügt wurden.
Die 1A, 1B und 1C zeigen die Ergebnisse hinsichtlich der überlebenden
Mäuse-,
Hamster- und Humanzellen bei unterschiedlichen Konzentrationen von
3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid. Es wurde gefunden, daß nur 1-2
% der Medikamentenkonzentration unter aeroben Bedingungen benötigt wurde,
um eine gleiche Zellenvernichtung unter Hypoxie zu erreichen. Dieses
Verhältnis
der selektiven hypoxischen Toxizität (50-100) ist höher als
für irgendeine bisher
in der Literatur genannte Verbindung.
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Beispiel 10: Bestimmung
von LD50
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LD50 wird in weiblichen BALB/c-Mäusen (Gewicht
20-25 g) nach der intraperitonealen (ip) Injektion bestimmt, es
sei denn, die untersuchte Verbindung hat eine geringe Lipophilität und ist
hochlöslich,
dann wird intravenöse
(iv) Verabreichung angewandt. LD50-Werte
wurden an den Tagen 1, 2, 5 und 60 bestimmt durch Verabreichung
abgestufter Dosen des Medikaments, das unmittelbar vor der Injektion
in physiologischer Kochsalzlösung
gelöst
wurde.
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Beispiel 11: Radiosensibilisierung
in vitro
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Die
Ergebnisse von Assays zur Bestimmung der erforderlichen Konzentration
des Medikaments zum Erhalt eines gesteigerten Sensibilisierungsverhältnisses
von 1,6 bei hypoxischen Kulturzellen sind wie folgt:
Verbindung | C 1,6 (mM) |
7-Chloro-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1-oxid | 3,3 |
6(7)-Methoxy-3-amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid | ~1,0 |
3-Hydroxy-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid | ~2,0 |
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Beispiel 12: Gesteigerte
Tumorzellen-Toxizität
bei Einsatz von Hydralazin
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Hydralazin
ist ein Antihypertonikum, das die glatte Muskulatur um die Blutgefäße entspannt.
Dies bewirkt eine bevorzugte Umleitung des Blutstroms in Normalgewebe
und von Tumoren weg, und bei diesem Vorgang wird in den Tumoren
sofortige Hypoxie erzeugt. Wenn 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid zusammen mit
diesem Mittel verabreicht wird, stellt sich eine massive Steigerung
der Tumorzellenvernichtung ein. Bei diesem Versuch führte weder
Hydralazin noch die vorgenannte Benzotriazinverbindung zu einer
merklichen Zellenvernichtung im SCCVII-Tumor, wogegen die Kombination
beider die Überlebensrate
um einen Faktor 103 reduziert (d. h. nur
1 Zelle aus jeweils 1000 blieb am Leben). Die experimentellen Vorgänge entsprechen
denjenigen aus Beispiel 8, und die Resultate sind in 3 gezeigt.