DE3735380A1 - Verfahren zur herstellung von photoprotein aequorin unter verwendung eines expressionsvektors, der an der aussenseite des bakterienkoerpers von escherichia coli abgeschieden werden soll - Google Patents

Verfahren zur herstellung von photoprotein aequorin unter verwendung eines expressionsvektors, der an der aussenseite des bakterienkoerpers von escherichia coli abgeschieden werden soll

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Äquorinaktivität unter Verwendung eines Gens für ein Photoprotein Äquorin. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Äquorinaktivi­ tät unter Herstellung eines Äquorinaktivtät aufweisenden Proteins durch Abscheidung eines Proteins mit Äquorinakti­ vität an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escheri­ chia coli unter Verwendung eines Expressionsvektors, der an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escherichia coli abgeschieden werden soll.
Äquorin ist ein Photoprotein, welches Calcium bindet und von photogenen bzw. lichtausstrahlenden Quallen abtrennt, die in der Nähe von Friday Harbor Island, Washington, USA leben.
Werden zwei (oder drei) Moleküle von Ca2+-Ionen mit einem Molekül Äquorin kombiniert, so wird Coelenterazin, welches in dem Äquorinmolekül enthalten ist und in aktiviertem Zu­ stand vorliegt, unter Lichtemission und CO₂-Freigabe oxidiert. Da Ca2+-Ionen für diese Lumineszenz unverzichtbar sind, ist es möglich, durch Verwendung von Äquorin Ca2+ spezifisch quantitativ nachzuweisen. Die Nachweisgrenze von Ca2+-Ionen beträgt etwa 10-9 M.
Bis heute wurde vielfach bestätigt, daß das intrazellulare Ca2+-Ion eine wichtige Rolle bei der Entwicklung vieler zellularer Funktionen spielt, wie bei der Anregung bzw. Sensibilisierung der zellularen Membran, der Muskelkontrak­ tion, der sekretorischen Aktivität der Zellen, der Freiset­ zung von transmittierenden Substanzen, der Wirkung von Hor­ monen, der intrazellularen Bindung und Fusion etc. Um die Beziehung zwischen diesen zellularen Funktionen und dem in­ trazellularen Ca2+-Ion festzustellen, ist es erforderlich, die Konzentration der intrazellularen Ca2+-Ionen im Lauf der Zeit zu bestimmen. Zur Messung der relativen Änderung der intrazellularen Ca2+-Ionen im Lauf der Zeit wird Äquorin verwendet, da das experimentelle System relativ ein­ fach ist und ein Signal der Ca2+-Ionen mit überlegenem SN- Verhältnis aufgezeichnet werden kann.
Hinsichtlich der Menge an Äquorin, die von photogenen Qual­ len abgeschieden wird, werden aus 10 Tonnen Quallen nur et­ wa 200 mg erhalten; die Produktionsmenge ist daher ungenü­ gend, und ein konstanter Nachschub ist nicht gewährleistet.
Zur Beseitigung der oben erwähnten Schwierigkeiten hat die Anmelderin Untersuchungen angestellt und als Ergebnis einen cDNA-Klon des Photoproteins Äquorin von Quallen entspre­ chend dem gentechnologischen Verfahren gefunden und dieses cDNA-Klonplasmid als pAQ 440 (japanische Patentanmeldung 59 (1984)-176 125) bezeichnet. Daraufhin hat die Anmelderin weitere Untersuchungen durchgeführt und gefunden, daß durch Einsetzen des oben erwähnten Gens (pAQ 440) in ein Plasmid mit einem Expressions-Promotor von Escherichia coli und un­ ter Verwendung des entstehenden transformierten Bakterien­ körpers die Photoproteine Äquorine des natürlichen Typs und des gewachsenen Typs im Inneren des Bakterienkörpers von Escherichia coli wirksam produziert werden können (japani­ sche Patentanmeldung 60 (1985)-280 259).
Für eine stabilisierte Produktion des Äquorin-Proteins be­ steht jedoch ein Bedarf an einem Vektor, der das obige Pro­ tein an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escherichia coli abscheidet.
Um die oben erwähnte Aufgabe zu lösen, hat die Anmelderin weitere ausgedehnte Untersuchungen angestellt und als Er­ gebnis ein Verfahren gefunden, gemäß dem ein Gen zur Ab­ scheidung bzw. Sekretion des Außenmembranproteins A von Escherichia coli und ein Promotor eines Lipoproteins (lpp) mit dem obigen pAQ 440 verbunden werden (bzw. gelinkt wer­ den), um dadurch einen Expressionsvektor des Sekretions­ typs zu konstruieren, welcher ein Äquorin-Protein mit Äquorin­ aktivität an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escherichia coli freisetzt, und durch den Einsatz dieses Expressionsvektors wird das im Inneren des Bakterienkörpers von Escherichia coli gebildete Äquorin-Protein wirksam an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escherichia coli freigesetzt, wodurch das Photoprotein Äquorin hergestellt wird.
Aus dem Obigen folgt, daß es Aufgabe der vorliegenden Er­ findung ist, ein Verfahren zur Herstellung eines Äquorin- Proteins zur Verfügung zu stellen, gemäß dem das Protein an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escherichia coli abgeschieden wird. Das Verfahren ist dadurch gekenn­ zeichnet, daß der oben erwähnte Expressionsvektor des Se­ kretionstyps hergestellt und ein Plasmid, welches durch Klonierung in den Vektor erhalten wurde, in Escherichia coli transformiert wird.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die folgende Hauptausfüh­ rungsform (1) und die Ausführungsformen (2) und (3):
  • (1) ein Verfahren zur Herstellung des Photoproteins Äquorin unter Verwendung eines Vektors, der an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escherichia coli abgeschieden wer­ den soll, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Plas­ mid in Escherichia coli transformiert, welches man durch Klonierung in einen Vektor, der an der Außenseite des Bak­ terienkörpers abgeschieden werden soll, erhalten hat, wo­ bei das Photoprotein Äquorin erhalten wird, wobei pAQ 440 als Gen verwendet wird, durch das die Biosynthese des Pho­ toproteins Äquorin von Quallen spezifiziert wird;
  • (2) ein Verfahren gemäß Punkt (1), bei dem ein Plasmid verwendet wird, das ein Gen gebunden enthält, welches für ein Signalpeptid zur Abscheidung des Außenmembranpeptids A (ompA) von Escherichia coli und für ein Äquorin-Gen (pAQ 440) von Escherichia coli, stromabwärts von dem Lipopro­ tein-Promotor (lpp), kodiert;
  • (3) ein Verfahren gemäß Punkt (2), bei dem ein Expres­ sionsvektor mit einem Signalpeptid von β-Lactase von Esche­ richia coli als das Gen, welches für das Signalpeptid ko­ diert, verwendet wird.
Fig. 1 (a) veranschaulicht ein Verfahren zum Einsetzen ei­ nes Äquorin-Gens in einen Expressionsvektor, der an der Au­ ßenseite des Bakterienkörpers gemäß der vorliegenden Erfin­ dung abgeschieden werden soll.
In dieser Figur bedeuten
lppP"Promotorteil von Lipoprotein" und lacP, O"Promotorteil" und "Operatorteil" von β- Galactosidase";
stellt einen Genteil des Signalpeptids von ompA dar.
Fig. 1 (b) veranschaulicht die Struktur des Signalpeptids und des Äquorin-Gens gemäß der Erfindung.
In dieser Figur bedeuten
Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert.
Die Herstellung des Gens (pAQ 440), genauer ausgedrückt die Biosynthese des Photoproteins Äquorin der Qualle, wird in näheren Einzelheiten in der japanischen Patentanmeldung 59 (1984)-176 125 (japanische Offenlegungsschrift 61 (1986)- 135 586) der gleichen Anmelderin beschrieben.
Ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsvektors, der an der Außenseite des Bakterienkörpers abgeschieden werden soll, unter Verwendung von pAQ 440 wird in Beispiel 1 (i) weiter unten beschrieben. Beispielsweise wird der Eco- RI-HindIII-Teil des stark kopierenden Klonierungsvektors pUC8 durch die entsprechenden Restriktionsenzyme digeriert, gefolgt von einer Subklonierung an einem Äquorin-cDNA-Eco- RI-HindIII-Fragment, welches aus dem cDNA-Klon pAQ 440 an den Teilen zur Herstellung von piQ8HE erhalten worden ist.
Als nächstes erfolgt die Herstellung eines Plasmids durch Klonierung in den Vektor, wie im folgenden Beispiel 1 (ii) erläutert wird: Nach der Digerierung von Sca-I-HindIII-Tei­ len von piQ8HE wird ein Sca-I-HindIII-Fragment, welches lpp-Promotor und ompA-Gen, erhalten aus pIN-III ompAI, ent­ hält, in die obigen Teile eingesetzt, wodurch man piPHE er­ hält.
Das Verfahren zur Transformierung des obigen Plasmids in Escherichia coli kann nach einem an sich bekannten Verfah­ ren durchgeführt werden. Das Verfahren zur Herstellung von Äquorin-Protein unter Verwendung der entstehenden Escheri­ chia coli wird im folgenden Beispiel 2 erläutert: Die Escherichia coli werden in einem genau definierten Medium kulti­ viert, anschließend wird zu dem entsprechenden Medium ein In­ duzierreagens zugegeben, so daß man eine bestimmte Konzentra­ tion des Reagens erhält, dann wird ein Gemisch unter festge­ legten Bedingungen (Temperatur und Zeit) zur Bildung einer Kultur gezüchtet, und die entstehenden Bakterienkörper wer­ den durch Zentrifugieren aus der Kultur gesammelt und ge­ reinigt.
Aus den so erhaltenen Bakterienkörpern wird nach einem an sich bekannten Verfahren ein Sphäroplast hergestellt (Nei u. a., J. Biol. Chem., Bd. 240, 3685-3692 (1965)).
Dieser Sphäroplast wird dann nach einem an sich bekannten Verfahren gebrochen, und anschließend werden die Bakterien­ körper und der Sphäroplast und die mit dem Mittel behandelten Bakterienkörper der Messung der Enzymaktivität von Äquorin unterworfen.
Wie in Tabelle I von Beispiel 2 nachstehend gezeigt ist, wird die meiste Aktivität (beispielsweise 95% oder mehr) in dem Überstand der behandelten Bakterienkörper neben dem Sphäroplast der Bakterienkörper festgestellt; somit ist es offensichtlich, daß Äquorin an der Außenseite der Bakterien­ körper abgeschieden worden ist.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung
Beispiel 1 Insertion bzw. Einsetzen von Äquorin-cDNA-Gen in einen lpp- Promotor und Gen, welches für das Signalpeptid von ompA kodiert (vgl. Fig. 1-a) (i) Herstellung von piQ8HE
Die Eco-RI-HindIII-Teile eines starkkopierenden Klo­ nierungsvektors pUC8 werden mit den entsprechenden Enzymen digeriert. Anschließend erfolgt an diesen Tei­ len eine Subklonierung des Eco-RI-HindIII-Fragments einer Äquorin-cDNA, hergestellt aus cDNA-Klon pAQ 440, zur Herstellung von piQ8HE.
(ii) Herstellung von piPHE
Nach der Digerierung von Sca I-HindIII von piQ8HE wird ein Sca-I-HindIII-Fragment, welches einen lpp- Promotor und ein ompA-Gen enthält, erhalten aus pIN- IIIompAI, zur Herstellung von piPHE in diese Teile eingesetzt.
Das nach dem oben erwähnten Verfahren hergestellte piPHE kann ein Äquorin-Protein mit einem Signalpeptid bilden. Fig. 1-b zeigt die Struktur des Signalpep­ tids und des Äquorin-Gens.
Beispiel 2 Verfahren zur Herstellung von Äquorin durch Verwendung von Escherichia coli.
Das oben erwähnte Plasmid piPHE, hergestellt durch Klonie­ rung in den oben genannten Expressionsvektor, der abge­ schieden werden soll, wird in E.-coli-Stamm (JA 221) zur Herstellung eines Proteins mit Äquorinaktivität transfor­ miert.
Zu 10 ml LB-Brühe, welche 100 µg/ml Ampicillin enthält, gibt man die oben erwähnten Bakterienkörper (welche das Plasmid piPHE enthalten) in 1/100 der obigen Menge, welche 12 Stunden lang gezüchtet wurden. Danach wird das Gemisch 2 Stunden bei 37°C gezüchtet. Weiterhin wird ein induzie­ rendes Mittel IPTG (Isopropyl-β-thiogaloitopyranosid) zu dem entstehenden Medium zugegeben, so daß man eine Endkon­ zentration von 1 mM erhält, und anschließend wird das Ge­ misch 4 Stunden bei 37°C weiter gezüchtet.
Die so erhaltene Kultur wird der Bakterienkörper-Zentrifu­ galkollektion mittels eines Rotors (Hitachi RP-20, Waren­ zeichen für eine von der Hitachi Seisakusho Co., Ltd. her­ gestellte Vorrichtung) 10 Minuten lang bei 5000 upm unter­ worfen, und danach werden die entstehenden Bakterienkörper mit M9-Medium gewaschen.
Weiterhin wird ein Sphäroplast gemäß dem Verfahren von Nei u. a. (J. Biol. Chem., Bd. 240, 3685-3692 (1965)) herge­ stellt: Die Bakterienkörper werden zweimal mit kaltem 0,03M-Tris-HCl (pH: 8,1) gewaschen, anschließend wird eine Lösung (10 ml), welche 20%-Sucrase-0,03M-Tris-HCl (pH: 8,1) und 1 mM EDTA enthält, zugegeben, das Gemisch wird 10 Minu­ ten langsam geschüttelt, das entstehende Material wird 10 Minuten der Zentrifugentrennung bei 13.000 upm unterworfen, kaltes Wasser (10 ml) wird zu dem Niederschlag zugegeben, das Gemisch wird 10 Minuten langsam geschüttelt, und das entstehende Material wird auf ähnliche Weise der Zentrifu­ gentrennung unterworfen, um einen Sphäroplast in Präzipita­ ten erhalten. Dieses Material wird in Tris-HCl (1,5 ml) (pH: 7,6) und 10 mM EDTA gelöst, und der Sphäroplast wird durch Ultraschallwellenbehandlung zur Messung der Enzymak­ tivität von Äquorin gebrochen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben. Offensichtlich wird die Hauptmenge der Enzymaktiviät von Äquorin (95% oder mehr) in dem Überstand der behandelten Bakterienkör­ per festgestellt. Somit wurde es ermöglicht, Äquorin außer­ halb der Bakterienkörper herzustellen.
Probe, deren Aktivität gemessen wurdeRLW/5 ml Bakterienkörper1,4 × 10⁷ Sphäroplast1,1 × 10⁵ Überstand des behandelten
Bakterienkörpers1,8 × 10⁷
Anmerkung: In der obigen Tabelle bedeutet "RLW" "relativer Lumineszenzwert" und 1 RLW=1,9×10³ Becque­ rel.
Die Messung erfolgte durch Zugabe von Coelenterazin als Substrat (0,2 ng) und 2-Mercaptoethanol (5 µl) zu dem En­ zymrohextrakt (100 µl) und Gießen von 30 mM CaCl₂ (100 µl) in das Gemisch und anschließende Messung des Gemisches mit­ tels eines Luminophotometers (TD 4000, Warenzeichen für ei­ ne Vorrichtung, hergestellt von der Laboscience Company).

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung eines Photoproteins Äquo­ rin unter Verwendung eines Vektors, der an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escherichia coli abgeschieden werden soll, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Plasmid in Escherichia coli transformiert, welches man durch Klonierung in einen Vektor, der an der Außenseite ei­ nes Bakterienkörpers unter Bildung des Photoproteins Äquo­ rin abgeschieden werden soll, unter Verwendung von pAQ 440 als Gen, das die Biosynthese von Photoprotein-Äquorin von Quallen spezifiziert, erhalten hat.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein Plasmid verwendet wird, welches ein Gen, das ein Signalpeptid zur Sekretion des Außenmem­ branpeptids A (ompA) von Escherichia coli kodiert, und ein Äquorin-Gen (pAQ 440) von Escherichia coli, stromabwärts von dem Lipoprotein-Promotor (lpp), gebunden enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein Expressionsvektor mit einem Si­ gnalpeptid von β-Lactase von Escherichia coli als das Gen, welches für das Signalpeptid kodiert, verwendet wird.
DE19873735380 1986-10-20 1987-10-19 Verfahren zur Herstellung von Photoprotein Äquorin unter Verwendung eines Expressionsvektors, der an der Außenseite des Bakterienkörpers von Escherichia coli abgeschieden werden soll Expired - Fee Related DE3735380C2 (de)

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