DE3688974T2

DE3688974T2 - Expressionssysteme zur überproduktion gewünschter proteine.

Info

Publication number: DE3688974T2
Application number: DE86906582T
Authority: DE
Inventors: Bernard Allet; Eric H Kawashima
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1985-10-09
Filing date: 1986-10-09
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2006-10-10
Also published as: EP0241539A4; ATE93893T1; JPS63500984A; EP0241539A1; EP0241539B1; CA1297050C; DE3688974D1; WO1987002384A1

Description

Technischer Bereich der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Expressionssysteme zur Überproduktion gewünschter Proteine und ein Verfahren zur Stabilisierung von mRNA in solchen Expressionssystemen. Insbesondere betrifft sie rekombinante DNA-Moleküle, die vom Bacteriophagen T4 stammende, zur Expression gewünschter Proteine in unerwartet hohen Ausbeuten nützliche DNA-Sequenzen umfassen, Wirte und solche rekombinanten DNA-Moleküle umfassende Expressionssysteme. Diese Erfindung betrifft auch ein Expressionssystem, das durch eine solche DNA-Sequenz, eine synthetische Oligonucleotidsequenz und eine geeignete Terminationssequenz charakterisiert wird. Solche Expressionssysteme sind bei der Expression gewünschter Proteine in unerwartet hohen Ausbeuten und bei der mRNA-Stabilisierung nützlich und erleichtern daher die Expression gewünschter Proteine in hohen Ausbeuten.

Fachwissenschaftlicher Hintergrund der Erfindung

DNA-Rekombinationsverfahren haben die Herstellung von Proteinen und Polypeptiden, zum Beispiel von zuvor in signifikanten Mengen nicht verfügbaren Interferonen und verschiedenen Hormonen, ermöglicht, indem Wirtszellen gezüchtet werden, die mit einer diese Proteine oder Polypeptide codierenden DNA-Sequenz transformiert worden sind, und das erzeugte Protein isoliert wird. Obgleich ein großer Fortschritt beim relativ kostengünstigen Erhalt größerer Proteinmengen ereicht worden ist, gibt es noch einen beträchtlichen Spielraum für Verbesserungen.
Die produzierte Menge eines Proteins in einer Wirtszelle wird durch drei Hauptfaktoren bestimmt: die Zahl der Kopien seines Gens innerhalb der Zelle, die Effizienz, mit der diese Genkopien transkribiert werden und die Effizienz, mit der die erhaltene Messenger-RNA ("mRNA") translatiert wird. Eine Optimierung jedes dieser Faktoren ist wünschenswert, wenn ein Protein zu einem vernünftigen Preis zur Verfügung gestellt werden soll.
Ein Expressionssystem zur Herstellung eines gewünschten Proteins besteht üblicherweise aus sieben Grundelementen:
(i) Einem rekombinanten DNA-Molekül (z. B. einem Plasmid), das eine für eine stabile Replikation und Kontrolle der Kopienzahl erforderliche Region (die Replikon- Region) enthält.
(ii) Einem selektierbaren Marker, zum Beispiel einem eine Antibiotika-Resistenz auf den Wirt übertragenden Gen.
(iii) Einem Promotor zur Transkriptions-Initiation und -Kontrolle.
(iv) Einer ribosomalen Bindungsstelle zur Initiation der Translation an der geeigneten ATG-Triplet (Trinucleotid)-Sequenz.
(v) DNA-Sequenzen, die mit einer effizienten mRNA- Translation kompatibel sind.
(vi) Einem geeigneten Wirt.
(vii) Geeigneten Wachstumsbedingungen.
Jedes dieser Elemente kann sowohl allein, als auch gemeinsam mit anderen die Expression beeinflussen. Die Eigenschaften des zu exprimierenden Proteins, wie seine Größe, die Anzahl von Cysteinen, seine Faltungseigenschaften und die Löslichkeit des Proteins im Wirtsmilieu oder in den Medien, können zum Beispiel einen wesentlichen Einfluß auf die Wirkungsweise eines Expressionssystems haben. Selbst die Antibiotika-Resistenz-Marker, von denen eigentlich zu erwarten wäre, daß sie sehr wenig mit der Stärke der Expression eines nicht verwandten Gen-Produkts zu tun haben, können eine Plasmid-Instabilität bewirken und letztendlich die Expression beeinflussen. Da eine ein gewünschtes Protein codierende DNA-Sequenz und die davon stammende mRNA-Sequenz üblicherweise eine große Zahl von (z. B. mehr als 100) aufeinander folgende Aminosäuren codieren, wird die Effizienz der mRNA-Translation auch eine wesentliche Wirkung auf die Expression haben. Aus den vorstehend beschriebenen Gründen ist es wichtig, die Konstruktion des Expressionssystems mit der besten Kombination der vorstehend beschriebenen sieben Elemente zu planen.
Die Effizienz von Transkription und Translation (die zusammen die Expression ausmachen) hängt teilweise von den Nucleotid-Sequenzen ab, die üblicherweise vor (stromaufwärts) der gewünschten codierenden Sequenz oder dem gewünschten Gen liegen, von den Sequenzen innerhalb der Gencodierenden Sequenzen und von den den gewünschten codierenden Sequenzen folgenden (stromabwärtsliegenden) Sequenzen. Die stromaufwärts liegenden Nucleotid-Sequenzen oder Expressions-Kontrollsequenzen definieren zum Beispiel unter anderem den Ort, mit dem die RNA-Polymerase zur Initiation der mRNA-Transkription in Wechselwirkung tritt (die Promotor-Sequenz), und an den die Ribosomen binden (die ribosomale Bindungsstelle) und zur Initiation der Translation mit der mRNA (dem Produkt der Transkription) in Wechselwirkung treten. Auch die Sequenzen der codierenden Sequenz und die stromabwärts von ihr liegenden können, vermutlich aufgrund der von der mRNA gebildeten Sekundär-Strukturen, die Stärke der Expression beeinflussen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde festgestellt, daß unter Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das eine vom Bacteriophagen T4 stammende DNA-Sequenz umfaßt als Teil eines Expressionssystems, eine besonders effiziente Expression gewünschter Proteine erhalten werden konnte.
Die vorstehend erwähnte Sequenz (nachstehend als "Sequenz I" bezeichnet), die ein Deletionsderivat des T4- hagen-Protein 32 (gp 32)-Gens ist (vgl. H. M. Krisch und B.
Allet, Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (1982), 4937-41), ist bisher nicht als ein wirksamer Promotor der DNA-Expression beschrieben worden. Ferner wurde auch unerwartet festgestellt, daß in E. coli eine in ein gewünschtes Protein translatierbare mRNA ungewöhnlich stabil ist, wenn sie an der erfindungsgemäßen, von T4-stammenden DNA-Sequenz initiiert wird.
Obwohl es nicht gewünscht wird, an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß die Existenz von drei oder vier benachbarten Abschnitten innerhalb der DNA- Sequenz, von denen jeder der Reihe nach als ein Promotor wirken kann (d. h. zur Initiation der Transkription von mRNA), zumindest ein Grund für diese Effizienz der in der Erfindung verwendeten DNA-Sequenz ist und daß diese verschiedenen Promotoren mehrere RNA-Polymerase-Moleküle binden "sequester" können, wodurch mehr mRNA-Moleküle als bei einem einzelnen Promotor initiiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend die DNA-Sequenz
(hier nachstehend als Sequenz I bezeichnet).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein gewünschtes Polypeptid codiert und mit dem stromabwärts-liegenden Ende der Sequenz I funktionell verbunden ist. Die DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Polypeptid codiert, kann ein Gen sein. Der Begriff "funktionell verbunden" schließt ein vorhandenes, geeignetes Startsignal (zum Beispiel ATG) vor der DNA-Sequenz, die das gewünschte Produkt codiert, und die Beibehaltung des richtigen Leserasters ein, um die Expression der DNA-Sequenz unter der Kontrolle der Expressionskontrollsequenz und die Produktion des von der DNA- Sequenz codierten gewünschten Produkts zu ermöglichen, und er schließt auch die Möglichkeit ein, daß die Sequenz I durch eine Sequenz X (wie nachstehend beschrieben), an die ein gewünschtes Produkt codierende DNA-Sequenz gebunden ist. Wenn ein Gen, das in ein rekombinantes DNA-Molekül inseriert werden soll, kein geeignetes Startsignal enthält, sollte ein solches Startsignal vor dem Gen inseriert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ein gewünschtes Polypeptid codiert und mit dem stromabwärts-liegenden Ende der Sequenz I durch eine Oligonucleotid-Sequenz X (in der X eine Gruppe von 1 bis 15 Basen ist) funktionell verbunden ist. Ein Fachmann kann zur Optimierung der Stärke der Expression unter bestimmten Umständen oder zur Übertragung weiterer wünschenswerter Eigenschaften auf die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle verschiedene Basen- Kombinationen innerhalb der Definition von X wählen. Die Sequenz X wird vorzugsweise aus der Gruppe von CGATACT, CGCGATACT, ATACTAAA, ATACT, CGCGATACTAAA, CGATACTAAA und CGATTCC ausgewählt.
Synthetische Oligonucleotid-Linker können zur Verknüpfung der Sequenz I mit einer ein bestimmtes Polypeptid codierenden DNA-Sequenz in einem rekombinanten DNA-Molekül verwendet werden. Der synthetische Oligonucleotid-Linker wird durch bekannte Verfahren chemisch synthetisiert und am stromabwärts liegenden Ende der Sequenz I angefügt. Der Linker umfaßt zur Verwendung bei der Verknüpfung mit der Sequenz I vorzugsweise eine Restriktionsenzym-Spaltstelle an seinem stromaufwärts liegenden Ende. Zum Beispiel in den erfindungsgemäßen Ausführungsformen, in denen die Sequenz I unter Verwendung der ClaI-Spaltung isoliert wird, trägt der Linker an seinem stromaufwärts liegenden Ende eine entsprechende ClaI-Stelle. Nach der Spaltung des synthetischen Oligonucleotid-Linkers mit dem Restriktionsenzym kann es daher leicht mit der Sequenz I verknüpft werden. Der Linker umfaßt vorzugsweise auch eine Restriktionsstelle an seinem stromabwärts liegenden Ende, so daß er leicht mit den die gewünschten Polypeptide codierenden DNA-Sequenzen verknüpft werden kann. Wenn ein Teil des zur Codierung des gewünschten Polypeptids erforderlichen Gens durch eine Spaltung zur Verknüpfung mit dem Linker eine Deletion aufweist, kann der synthetische Oligonucleotid-Linker so konstruiert sein, daß er die erforderliche DNA-Sequenz liefert (einschließlich eines geeigneten Startsignals). Nach der Insertion von Sequenz I durch die Verwendung eines solchen synthetischem Oligonucleotid-Linkers (d. h. eines Linkers, der eine Gruppe von Basen innerhalb der Definition von X und, falls erforderlich, eine Gruppe von Basen zur Rekonstruktion des Gens umfaßt, dessen Expression gewünscht wird, das jedoch durch das Restriktionsenzym gespalten worden ist) kann die erhaltene DNA-Sequenz, in der das Gen über die Sequenz X mit der Sequenz I funktionell verbunden ist, zum Beispiel, wie nachstehend dargestellt, schematisch veranschaulicht werden: Sequenz I - X - Gen. In der vorstehenden schematischen Veranschaulichung wird vorausgesetzt, daß das erforderliche Startsignal am stromabwärts liegenden Ende von X oder am stromaufwärts liegenden Ende des Gens vorhanden ist.
Wenn das das gewünschte Polypeptid codierende Gen das menschliche Tumor-Nekrose-Faktor (HTFN)-Gen ist, sind die bevorzugten Sequenzen X CGATACT, CAATAAA und CGATTCC. Polynucleotid-Sequenzen, die die an eine dieser bevorzugten Sequenzen X geknüpfte Sequenz I, eine Gruppe von zur Rekonstruktion des HTNF-Gens erforderlichen Basen und ein durch Spaltung mit AvaI deletiertes ATG-Startsignal umfassen, können durch Verknüpfung eines der nachstehenden synthetischen Oligonucleotid-Linkers mit der Sequenz I hergestellt werden: CA1, CA-his, CA3, CA5, Δ2 und CA13 (vgl. Tabelle 1). Die erhaltene Sequenz kann anschließend, wie vorstehend beschrieben, in ein rekombinantes DNA-Molekül inseriert werden. Das erhaltene rekombinante DNA-Molekül kann anschließend zur Produktion des HTNF-Polypeptids in einen geeigneten Wirt, z. B. in E. coli eingeführt werden. (Eine Besprechung des menschlichen Tumor-Nekrose-Faktors ist in der US-Patentanmeldung mit der fortlaufenden Nr. 684595, eingereicht am 21. Dezember 1984, zu finden).
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das die Sequenz I umfaßt und ferner (a) eine Oligonucleotidsequenz X, (b) eine Transkriptionsterminations-Sequenz, vorzugsweise den T4-Gen 32-Transkriptions-Terminator (hier nachstehend als "Ter" bezeichnet, vgl. Tabelle 1) oder eine andere geeignete Terminations-Sequenz (zum Beispiel den cry-Transkriptions-Terminator von Bacillus thuringiensis vs. Kurstaki HD-1 (Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 3233-37) oder den TJ-Transkriptions-Terminator vom Bacteriophagen ΦX174 (Hayashi et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 5937-48) oder (c) sowohl die vorstehende Sequenz X als auch die vorstehende Transkriptionsterminations-Sequenz. Die Konstruktion einer solchen bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform kann, zum Beispiel, wie folgt schematisch veranschaulicht werden: Sequenz I - X - Gen - Ter. In der vorstehenden schematischen Veranschaulichung ist das erforderliche Startsignal selbstverständlich am stromabwärts liegenden Ende von X oder am stromaufwärts liegenden Ende des Gens vorhanden. Dieses Molekül ist zur Expression von DNA-Sequenzen, die gewünschte Produkte codieren, in geeigneten Wirten nützlich.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch einen Wirt oder ein Expressionssystem, das ein rekombinantes DNA- Molekül umfaßt, das eine Sequenz I umfaßt, die funktionell mit einer ein gewünschtes Polypeptid codierenden DNA-Sequenz verbunden ist, und die Verwendung eines solchen Wirts oder Expressionssystems zur Stabilisierung der mRNA und zur Expression eines gewünschten Proteins. In bevorzugten Wirten und Expressionssystemen wird das rekombinante DNA-Molekül natürlich auch eine der vorstehend beschriebenen X-Sequenzen, eine der vorstehend beschriebenen Transkriptionsterminations-Sequenzen oder beide umfassen. Tabelle 1: Synthetische Oligonucleotiode

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1A stellt die Herstellung von Plasmid pL-pTAK 21Δ aus den Plasmiden p236 und pTAK 21Δ dar. Es zeigt auch die Herstellung von Plasmid pL-pTAK 21Δ-Cla+ aus pL-pTAK 21Δ. In dieser Figur und in den Fig. 1B und 1C zeigt ein Symbol K nach der Stelle an, daß die Stelle mit dem "Klenow"-Fragment der DNA-Polymerase I in Gegenwart der vier Desoxyribonucleosid-Triphosphate behandelt worden ist.
Fig. 1B stellt die Herstellung von Plasmid pBR322- pLT4 HTNF (Gn) aus dem Plasmid pBR322-Trp-IFNγ-(Gn) dar. Es zeigt auch die Herstellung von Plasmid pAT153-pLT4 HTNF (Gn) (Tet)+ aus dem Plasmid pBR322-pLT4 HTNF (Gn).
Fig. 1C stellt die Herstellung von Plasmid pAT153- pLT4 HTNF T4-ter aus dem Plasmid pAT153-pLT4 HTNF (Gn)-Sal dar, die Herstellung von Plasmid pAT153-T4-HTNF-T4-ter aus dem Plasmid pAT153-pLT4 HTNF T4-ter und die Herstellung von Plasmid pAT153-T4-HTNF-(Gn) aus dem Plasmid pAT153-p-T4 HTNF (Gn) (Tet)+.
Fig. 2 stellt die Struktur von Plasmid pLT4-CA3(5)cts-T4-ter dar.
Fig. 3 stellt die DNA, die entsprechende RNA und Aminosäure-Sequenzen vom Plasmid 153-T4-CA5-Dra-T4-ter von der Dra I-AATTC-EcoRI-Stelle bis zur am Ende des T4-ter- ITNF-Gens liegenden EcoRI-Stelle dar.
Fig. 4 stellt die DNA, die entsprechende RNA und Aminosäure-Sequenzen vom Plasmid 153-pL-CA3-cts-T4-ter von der PstI-Stelle bis zur am 3'-Ende des T4-Terminators liegenden EcoRI-Stelle dar.
Fig. 5 stellt eine vom Bacteriophagen T4 stammende DNA-Sequenz dar, die als ein Promotor wirkt (hier nachstehend als T4-Promotor bezeichnet). Wie in der Figur dargestellt, kann die T4-Sequenz entweder an der PstI- (3607) oder DraI-Stelle (3232) mit pBR322-Sequenzen verknüpft werden. In Fig. 5 werden auch die Ergebnisse von durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysierten S1-Kartierungs- Experimenten dargestellt. Die RNA-Proben wurden aus Zellen hergestellt, die die Plasmide pLT4-CA5, T4-CA5(Dra), pLT4- CA3, T4-CA3(Dra) und T4-CA5(Pst) trugen. Sämtliche dieser Plasmide wiesen den T4-Gen-32-Transkriptions-Terminator auf (hier nachstehend als T4-ter- oder Ter-Plasmide bezeichnet). In der Figur weisen Pfeile auf eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle in der PL-DNA-Sequenz und auf vier solcher Stellen in der T4-DNA-Sequenz hin.
Fig. 6(a) stellt die Northern Blot-Analyse der aus den angegebenen Stämmen (sämtlich Ter) gewonnenen RNA-Proben dar.
Fig. 6(b) stellt die angegebenen, wie in (a) analysierten Proben zum Nachweis der RNA unter Verwendung der radioaktiven HTNF-Gen-Sonde dar.
Fig. 7 stellt eine Deletionskarte des T4-Promotors dar, in der die DNA-Sequenzen von Taq-T4, Bal4, Bal8, Bal11 und eine partielle DNA-Sequenz von Bal10 identifiziert werden. Fig. 7 stellt auch die Ergebnisse der Gradienten-SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese der HTNF-Protein-Proben dar, die aus Zellen hergestellt wurden, die Taq-4-, Bal4-, Bal8- und Bal11-Sequenzen umfassende Plasmide trugen.
Fig. 8 stellt die Ergebnisse der SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese der exprimierten Proteinmengen von HTNF- Varianten dar. Alle verwendeten Plasmide weisen den T4- Terminator auf. Der Pfeil verweist auf die 17,5 kDalton- HTNF-Bande.
Fig. 9 stellt die Ergebnisse der Gradienten-SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese der HTNF- Expression während des Zellwachstums von E. coli W3110-Zellen dar, die T4-CA3- Ter- und T4-CAS-Ter-Plasmide enthalten.
Fig. 10 zeigt eine Autoradiographie der Ergebnisse der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der synthetisierten Proteine von E. coli W3110-Kulturen, die T4-CA5-Ter-, T4- CA3-Ter-, T4-CA5-(Gn)- und T4-CAS-ΔTer-Plasmide tragen, nach Beendigung der RNA-Transkription durch Zusatz von Rifampicin. Der obere Pfeil weist auf ein stabiles 32 kDalton OmpA- Protein und der untere auf ein stabiles 7,5 kDalton- Lipoprotein. Die horizontale Linie mit dem Kreis stellt das HTNF-Protein dar.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Sequenz I kann durch in der Fachwissenschaft gut bekannte Verfahren, zum Beispiel unter Verwendung eines automatischen Synthesegeräts, wie des automatischen Synthesegeräts "380A" von "Applied Biosystems", chemisch synthetisiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Sequenz I, wie in Beispiel 1 nachstehend beschrieben, vom Plasmid pTAK 21Δ (Fig. 1A) erhalten werden (vgl. Gorski et al., Cell 43 (1985), 461-69).
Wenn die Verwendung eines synthetischen Oligonucleotid-Linkers oder Transkriptions-Terminators, z. B. des T4-Gen-32-Transkriptions-Terminators (vgl. Tabelle 1) gewünscht wird, kann der Linker oder Terminator durch bekannte Verfahren, z. B. die Verwendung des automatischen Synthesizers "380A" von "Applied Biosystems", wie nachstehend in den Beispielen 2 und 3 beschrieben, synthetisiert werden.
Es ist selbstverständlich, daß die DNA-Sequenzen, die die gewünschten Polypeptide codieren, die unter Verwendung dieser Erfindung in großer Ausbeute produziert werden können, Nucleotide enthalten können, die nicht Teil des eigentlichen, das bestimmte Polypeptid codierenden Gens sind. Zum Beispiel können die DNA-Sequenzen im gleichen Leseraster an einen Teil einer mindestens ein eukaryotisches oder prokaryotisches Trägerprotein codierenden oder an eine mindestens eine eukaryotische oder prokaryotische Signalsequenz codierenden DNA-Sequenz oder Kombinationen davon fusioniert werden. Solche Konstruktionen können bei der Expression der gewünschten DNA-Sequenz helfen, die Reinigung verbessern oder die Sekretion und vorzugsweise die Reifung eines gewünschten Polypeptids aus der Wirtszelle ermöglichen. Die DNA-Sequenz kann in anderen Ausführungsformen ein ATG- Startcodon, allein oder zusammen mit weiteren Codons, direkt an die die erste Aminosäure eines gewünschten Polypeptids codierende Sequenz fusioniert werden. Solche Konstruktionen ermöglichen die Produktion beispielsweise eines Methionyl- oder anderen Peptidyl-Polypeptids. Dieses N-terminale Methionin oder Peptid kann anschließend, falls erforderlich, durch verschiedene bekannte Verfahren intra- oder extrazellulär abgespalten werden, oder das Polypeptid kann zusammen mit dem Methionin oder weiteren daran geknüpften, Fusionsprodukten in verschiedenen Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden.
In Anbetracht des vorstehend beschriebenen wird ein Fachmann verstehen, daß, wenn nicht anders angegeben, eine Bezugnahme auf eine ein gewünschtes Polypeptid codierende DNA-Sequenz DNA-Sequenzen, wie beispielsweise die im vorstehenden Abschnitt beschriebenen einschließen kann.
Ein Fachmann kann unter bestimmten Umständen zur Optimierung der exprimierten Mengen oder zur Übertragung weiterer wünschenswerter Eigenschäften auf die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle verschiedene Basen-Kombinationen innerhalb des Definitionsbereichs von X auswählen. Neben den Sequenzen, die, wie vorstehend beschrieben, innerhalb des Definitionsbereichs von X hergestellt worden sind, können auch andere Teile der synthetischen Oligonucleotid-Linker-Sequenzen durch verschiedene Verfahren modifiziert werden, um weitere Sequenzen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Molekülen herzustellen. Solche Verfahren schließen, zum Beispiel (1) eine Stellen-spezifische Mutagenese ein (vgl. B. A. Oostra et al., Nature 304 (1983), 456-59, ferner (2) eine stellenspezifische Manipulation an der ClaI-Stelle innerhalb der Sequenz X (z. B. die Verwendung eines Klenow-Fragments zur Auffüllung mit Nucleotiden oder eine S1/Bal-Spaltung zur Deletion von Nucleotiden) und (3) eine Insertion von synthetischen Oligonucleotid-Fragmenten. Es wurden zur Herstellung der erfindungsgemäßen Plasmide die Verfahren (2) und (3) verwendet.
Verfahren zur Expression von Proteinen sind gut bekannt. Sie schließen die Transformation eines geeigneten Wirts mit einer DNA-Sequenz ein, die Züchtung des Wirts unter geeigneten Wachstumsbedingungen und die Entnahme des gewünschten Polypeptids aus der Kultur. Besonders bevorzugt sollen die Wirtszellen die stationäre Phase erreichen können, bevor das gewünschte Polypeptid gesammelt wird. Ein Fachmann kann aus bekannten Verfahren die auswählen, die ohne den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung zu verlassen für die Expression eines bestimmten Gens am wirksamsten sind.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können in vielen verschiedenen Vektoren verwendet werden. Diese schließen zum Beispiel Vektoren ein, die aus Abschnitten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen, zum Beispiel verschiedene bekannte Derivate von SV40, bekannte bakterielle Plasmide, z. B. Plasmide von E. coli, einschließlich col E1, pcR1, pBR322, pMB9 und ihre Derivate, Plasmide mit einem breiteren Wirtsspektrum, z. B. RP4 und Phagen-DNA-Moleküle, z. B. die zahlreichen Derivate des Phagen X, wie NM 989 und weitere DNA-Phagen, z. B. M13 und filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen, sowie von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA-Molekülen stammende Vektoren, beispielsweise Plasmide, die für die Verwendung von Phagen-DNA oder weiteren Expressions-Kontrollsequenzen modifiziert worden sind. Die bevorzugten Vektoren sind pBR322-Derivate.
Innerhalb jedes spezifischen Clonierungs- oder Expressionsvehikels können verschiedene Stellen zur Insertion der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ausgewählt werden. Diese Stellen werden üblicherweise durch die dort spaltende Restriktionsendonuclease bezeichnet und sind dem Fachmann vertraut. Es sind auch verschiedene Verfahren zur Insertion von DNA-Sequenzen in diese Stellen zur Erzeugung rekombinanter DNA-Moleküle gut bekannt. Diese schließen, zum Beispiel, ein dG-dC- oder dA-dT-"Tailing" ein, eine direkte Ligierung, synthetische Linker, Exonucleasen und Polymerase-gebundene Reparaturreaktionen mit einer anschließenden Ligierung oder die Verlängerung des DNA-Stranges mit der DNA-Polymerase und einer geeigneten einzelsträngigen Matrize mit einer anschließenden Ligierung. Es ist natürlich selbstverständlich, daß ein für die Erfindung nützliches Clonierungs- oder Expressionsvehikel keine Restriktionsspaltstelle zur Insertion des gewählten DNA-Fragments aufweisen muß. Das Vehikel könnte stattdessen durch alternative Verfahren mit dem Fragment verknüpft werden.
Der Vektor oder das Expressionsvehikel und insbesondere die darin gewählten Stellen zur Insertion des gewählten DNA-Fragments und die in dieser Erfindung verwendeten, Expressions-Kontrollsequenzen werden durch verschiedene Faktoren bestimmt, z. B. die Zahl der durch ein bestimmtes Restriktionsenzym spaltbaren Stellen, die Größe des exprimierten Proteins, die Expressionseigenschaften, zum Beispiel die Lage der Start- und Stopcodons relativ zu den Vektorsequenzen und weitere den Fachleuten vertraute Faktoren. Die Wahl eines Vektors, einer Expressions- Kontrollsequenz und einer Insertionsstelle für eine gewünschte Proteinsequenz werden durch eine Balance dieser Faktoren bestimmt, wobei in einem gegebenen Fall nicht jede Wahl gleich wirksam ist.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird zur Durchführung der Insertion der Sequenz I in bin DNA-Molekül, das eine ein bestimmtes Polypeptid codierende DNA-Sequenz umfaßt, ein synthetischer Oligonucleotid Linker verwendet. Es wurde festgestellt, daß die mit den Linkern CA-his, CA5 oder Δ2 (Tabelle I) konstruierten Plasmide sehr große Mengen HTNF-Protein exprimieren. Obwohl keine Festlegung auf irgendeine Theorie erwünscht ist, wird angenommen, daß die Wahl eines geeigneten synthetischen Oligonucleotid-Linkers höchstwahrscheinlich die Effizienz der Translation durch eine Erhöhung oder Verminderung der Häufigkeit der Basenpaarung von homologen Sequenzen auf der mRNA beeinflußt.
Obgleich die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen einen Promotor umfassen, kann solchen DNA-Sequenzen ein weiterer Promotor, vorzugsweise stromaufwärts von solchen DNA- Sequenzen, angefügt werden. Derartige nützliche Promotoren schließen, zum Beispiel T4-Promotoren ein, die frühen und späten Promotoren von SV40, das lac-System, das trp-System, das TAC- oder TRC-System, die Haupt-Promotorregionen des Phagen λ, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, den Promotor der 3-Phosphoglycerat-Kinase oder weiterer glycolytischer Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase, z. B. Pho5, die Promotoren der Hefe-α-Paarungsfaktoren und weitere Sequenzen, die dafür bekannt sind, daß sie die Genexpression von Prokaryotischen und eukaryotischen Zellen oder ihrer Viren kontrollieren und verschiedene Kombinationen davon. In Säugerzellen ist es ferner möglich, durch Verknüpfung des Gens mit dem die Dehydrofolat-Reduktase codierenden und durch Anwendung einer Selektion auf Eierstockzellen des chinesischen Hamsters als Wirt die Expressionseinheiten zu vervielfältigen.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Sequenz I stromabwärts von einem PL-Promotor inseriert (vgl. Bernhard, H. et al., Gene 5 (1979), 59-76, und europäische Patentanmeldung mit der Nummer 81 30 1413.1, Veröffentlichungsnummer 0 041 767).
Es wird vorgezogen, den PL-Promotor nicht zu verwenden, es sei denn, dies ist vorteilhaft, da die Verwendung des PL-Promotors das Spektrum verwendbarer Wirte auf die mit λ-Repressoren beschränken kann. Die Verwendung der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenz I stromabwärts von einem PL- Promotor ist jedoch meistens vorteilhaft, da sie gelegentlich zu einer erhöhten Expression führen kann. Dies ist zum Beispiel bei der Expression von Maus-Interleukin-3 (vgl. Kindler, V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 1001-05), von menschlichem Interleukin-2 (vgl. europäische Patentanmeldung mit der Nummer 84 30 0439.1, Veröffentlichungsnummer 0 118 977) und vom Maus-Tumor-Nekrose-Faktor (Fransen et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 4417-30) festgestellt worden.
Gelegentlich werden jedoch bei Verwendung der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenz ohne einen PL-Promotor Expressionsniveaus erreicht, die vergleichbar mit oder höher sind als die, die mit der Kombination der DNA-Sequenz und dem PL-Promotor erreicht werden. Unter diesen Umständen kann auf den PL-Promotor verzichtet werden. Es wurde festgestellt, daß dies bei der HTNF-Expression zutraf, bei der das Expressionssystem durch den T4-Gen-32-Transkriptions- Terminator und die Sequenz I gekennzeichnet ist, wenn die Sequenz I unter Verwendung eines bevorzugten, erfindungsgemäßen synthetischen Oligonucleotid-Linkers in das rekombinante DNA-Molekül eingefügt worden ist.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Sequenz I in Kombination mit dem T4-Gen-32- Transkriptions-Terminator verwendet (vgl. Tabelle 1). Die Ter-Sequenz liegt am stromabwärts liegenden Ende des das gewünschte Polypeptid codierenden Gens, und das Gen ist an seinem stromaufwärts liegenden Ende funktionell mit der Sequenz I verknüpft. Der Terminator ist ein DNA-Signal, das an einer bestimmten Stelle auf der DNA-Matritze die Beendigung der am T4-Promotor initiierten mRNA-Synthese bewirkt, wodurch mRNA-Moleküle (Transkriptionseinheiten) mit bestimmten Größen produziert werden. Bei Verwendung dieser Kombination ist die am T4-Promotor initiierte mRNA ungewöhnlich stabil, und es werden sehr große Mengen eukaryotischer Proteine synthetisiert.
Zur Erhöhung der Stabilität von mRNA-Molekülen im erfindungsgemäßen Verfahren können weitere Transkriptionsterminations-Sequenzen verwendet werden. Eine erhöhte mRNA- Stabilität wird üblicherweise durch mRNA-Sekundärstrukturen einschließende Mechanismen erreicht. Es ist zum Beispiel gezeigt worden, daß die cry-Transkriptionsterminations- Sequenz von Bacillus thuringiensis vs. Kurstaki HD-1 ein invertiertes Repeat-Signal enthält und die Transkription dieser Sequenz zum Einschluß einer entsprechenden Haarnadel- ("stem-and-loop")-Struktur am 3'-Ende der mRNA führt. Diese Struktur schützt daher anscheinend die mRNA-Moleküle vor exonucleolytischern Abbau vom 3'-Ende her und erhöht dadurch die Halbwertszeit der mRNA (Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 3233-37). Der Tj-Terminator des Bacteriophagen ΦX174 kann andererseits durch einen Mechanismus die mRNA-Stabilität erhöhen, in dem eine Haarnadel-Sekundärstruktur nicht das primäre Erfordernis für die Erhöhung der Aktivität ist (vgl. Hayashi et al., Nucleic Acids Res. 13 (1985), 5937-48). Ohne auf irgendeine Theorie festgelegt sein zu wollen, wird angenommen, daß die erfindungsgemäße T4-Gen-32-Transkriptionterminations-Sequenz die Bildung einer Haarnadelstruktur auf der mRNA ermöglicht und daß diese Haarnadel den posttranskriptionellen exonucleolytischen mRNA-Abbau von 3' nach 5' vermindert, wodurch die mRNA-Stabilität und die Synthesemenge des Proteins des Zielgens erhöht wird.
In einer stärker bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein synthetischer, aus einer Gruppe von CA-his, CA5 und Δ2 (vgl. Tabelle 1) ausgewählter Oligonucleotid-Linker verwendet, um die Insertion der Sequenz I in ein DNA-Molekül zu erreichen, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die das HTNF-Polypeptid codiert und die an ihrem stromabwärts liegenden Ende an eine Sequenz fusioniert ist, die den T4-Gen-32-Transkriptions-Terminator umfaßt.
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das das gewünschte, mit einer Expressions-Kontrollsequenz funktionell verbundene Gen enthält, kann zur Transformation einer Vielzahl von geeigneten Wirten verwendet werden, wodurch solchen Wirten (Transformanten) die Expression des Gens oder eines Fragments davon und die Produktion des Polypeptids oder eines Teils davon, das durch die Hybrid-DNA codiert wird, ermöglicht wird. Das rekombinante DNA-Molekül kann auch zur Transformation eines Wirts verwendet werden, wodurch es dem Wirt bei der Replikation ermöglicht wird, als eine Quelle von gewünschten Genen und Fragmenten davon weitere rekombinante DNA-Moleküle zu produzieren.
Eine Vielzahl von Wirten ist ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren nützlich. Diese Wirte schließen zum Beispiel Bakterien ein, wie E. coli (zum Beispiel E. coli HB101 oder E. coli MC1061), Bacillus, Streptomyces und Pseudomonas, Pilze, wie Hefen, und tierische Zellen, wie CHO-Zellen, Mauszellen, Zellen vom Schwein, Rind, von Geflügel oder Fisch, Pflanzenzellen in Gewebekultur, menschliche Gewebezellen, oder weitere auf dem Fachgebiet bekannte Wirte. Für eine bestimmte Anwendung sollte ein Wirt ausgewählt werden, in dem der innerhalb der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthaltene Promotor wirksam ist.
Die Auswahl eines geeigneten Wirts zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren wird durch mehrere auf dem Fachgebiet bekannte Faktoren bestimmt. Diese schließen, zum Beispiel, die Kompatibilität mit dem gewählten Vektor ein, die Toxizität der Coprodukte, die Leichtigkeit der Gewinnung des gewünschten Polypeptids, die Expressionseigenschaften, die biologische Sicherheit und die Kosten. Aufgrund nur eines Faktors kann es keine absolute Wahl des Wirts für ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül oder Polypeptid geben. Stattdessen muß ein Ausgleich dieser Faktoren mit der Einsicht erreicht werden, daß gegebenenfalls nicht sämtliche Wirte gleich wirksam bei der Expression eines bestimmten rekombinanten DNA-Moleküls sind. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wurden E. coli W3110 und die Plasmide pLT4-CA3 cts T4-ter und T4-CA5 T4-ter verwendet. E. coli W3110, 153 pLT4-CA3 cts T4-ter, ein bevorzugter E. coli, wurde am 29. August 1985 unter der Hinterlegungsnummer DSM 3460 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) hinterlegt. Eine zweiter bevorzugter E. coli, nämlich E. coli W3110, 153 T4-CA5 T4-ter wurde am 29. August 1985 unter der Hinterlegungsnummer DSM 3461 bei der DSM hinterlegt.
Zu den unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen hergestellten Polypeptiden gehören menschliches Interleukin-2 und menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor. Weitere gewünschten Polypeptide können in ähnlicher Weise hergestellt werden.
Zur Ermöglichung eines besseren Verständnisses der Erfindung werden nur zu Anschauungszwecken die nachstehenden Beispiele beschrieben. Sämtliche Temperaturen in den Beispielen sind in Grad-Celsius angegebenen.

Beispiel 1

Herstellung von Plasmid PL-pTAK 21Δ'-CLA+

Zur Herstellung von Plasmid pL-PTAK 21Δ'-Cla+ wurde das Plasmid p236 (vgl. Fig. 1A, europäische Patentanmeldung mit der Nummer 81 30 1413.1, Veröffentlichungsnummer 0 041 767, und Remaut, E. et al., Gene 15 (1981), 81-93) zunächst mit der Restriktionsendonuclease EcoRI gespalten. Die Stelle wurde mit der DNA-Polymerase in Gegenwart von sowohl dATP als auch dTTP aufgefüllt und anschließend mit der Restriktionsendonuclease PstI gespalten. Das kleinere erhaltene Fragment, das eine Größe von etwa 1150 Basenpaaren aufwies und die PL-Sequenz enthielt, wurde isoliert.
Parallel dazu wurde ein zweites Plasmid pTAK 21Δ herangezogen (Fig. 1A) (vgl. Gorski et al., Cell 43 (1985), 461-69), das den gewünschten Abschnitt der T4-DNA in derselben Orientierung, wie die PL-Sequenz in p236, und ferner eine einzige ClaI-Stelle innerhalb der regulatorischen Region aufweist. Dieses Plasmid enthält ein Deletionsderivat (T4Δ) des Phagen T4-Protein 32-(gp 32)-Gens. T4Δ definiert eine Deletion des Phagen T4-Protein 32-Gens, das die Promotor-Region, der die ersten 7 aminoterminalen Codons (0,38 kB) nachfolgen, mit den letzten 8 carboxyterminalen Codons, denen der Transkriptions-Terminator (0,12 kB) nachfolgt, über einen BamHI-Linker verbindet. Das Plasmid pTAK 21Δ wurde mit ClaI gespalten und die Spaltstelle mit der DNA-Polymerase in Gegenwart von dGTP und dCTP aufgefüllt. Anschließend wurde mit PstI gespalten und das längere erhaltene Fragment gereinigt.
Das kleinere der beiden Fragmente, die vom die PL-Sequenz enthaltenden Plasmid erhalten wurden, wurde mit dem größeren der beiden Fragmente, die vom die T4-Sequenz enthaltenden Plasmid erhalten wurden, ligiert, wodurch pLpTAK 21Δ' (vgl. Fig. 1A) erhalten wurde. Dies stellte die PstI-Stelle wieder her und verband auch die modifizierte ClaI-Stelle mit der modifizierten RI-Stelle, um eine EcoRI- Stelle, jedoch keine ClaI-Stelle wiederherzustellen. pL-pTAK 21Δ' weist neben der Deletion T4Δ, eine weitere Deletion zwischen den EcoRI- und ClaI-Stellen von pTAK 21Δ auf, die den T4-Promotor entfernt, der zuvor von Krisch und Allet erkannt wurde (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 4937-41).
Plasmid pL-pTAK 21Δ'-Cla+ (vgl. Fig. 1A) wurde durch Stellen-spezifische Mutagenese unter Verwendung des Moleküllücken- ("gapped molecule")-Verfahrens aus dem Plasmid pL-pTAK 2Δ' hergestellt (vgl. Oostrea, B. A. et al., Nature 304 (1983), 456-59), wobei die Sequenz 5'- AAAAATAAAAATGTTTAAA durch 5'-AAAAAGGAAATCGATATGTTTAAA, die in pL-pTAK 21Δ' vorhanden ist, ersetzt wurde. Dadurch wurde eine ClaI-Stelle zwischen der Shine-Dalgarno (SD)- Sequenz und dem ATG-Initiationscodon der T4-regulatorischen Region eingeführt.

Beispiel 2

Herstellung von Plasmid pAT153-pLT4 HTNF-(Gn) tet+

Zur Herstellung des Plasmids pAT153-pLT4 HTNF-(Gn) tet+ wurde mit dem Plasmid pBR322-Trp-IFN-γ-(Gn) begonnen (vgl. europäische Patentanmeldung mit der Nummer 85 90 2003.4, Veröffentlichungsnummer 0 174 999), das eine, wie nachstehend beschriebene, DNA-Sequenz zwischen HindIII und BamHI aufweist: 5'-AAGCTTGCACCCAA(G)&sub1;&sub6;A(G)&sub7;ATCC (diese G- reiche Sequenz wird hier nachstehend als (Gn) bezeichnet). Die Sequenzen zwischen BamHI und PstI (im Uhrzeigersinn) stammen von pBR322; die Zahl (375) identifiziert die BamHI- Stelle von pBR322 (vgl. Fig. IB). Es wurde festgestellt, daß die Zerstörung der ClaI- oder HindIII-Stelle von pBR322 (durch Auffüllen der Stelle mit Klenow) den TetR-Phänotyp nicht beeinflußte Plasmid pBR322-Trp-IFN-γ-(Gn) wurde mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und PstI gespalten. An das isolierte Fragment (in Fig. 1B als das DNA-Fragment dargestellt, das im Plasmid pBR322-Trp-IFN-γ-(Gn) im Uhrzeigersinn zwischen der HindIII- und der PstI-Stelle liegt) wurden zur Herstellung von Plasmid pBR322-pLT4 HTNF (Gn) (vgl. Fig. 2) die nachfolgenden drei weiteren Fragmente ligiert: (a) das 1280 Bp große PstI-ClaI-Fragment, das durch Restriktionsspaltung mit PstI und ClaI aus dem Plasmid pL-pTAK 21Δ- Cla+ (vgl. Fig. 1A) isoliert worden war; (b) ein synthetischer Oligonucleotid-Linker, der eine der Sequenzen in Tabelle 1 enthielt und der ClaI- und AvaI-Enden aufwies; und (c) ein DNA-Fragment (vgl. Fig. 1B iii HTNF cDNA (AvaI- HindIII)), das das HTNF-Gen enthielt. Die in den vier Moleküle verknüpfenden Ligierungsgemischen ("four-way"-Ligierungsgemischen) verwendeten synthetischen Linker sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die Nucleotid-Sequenz des HTNF-cDNA-Clons ist veröffentlicht worden (vgl. Marmenout et al., Eur. J Biochem. 152 (1985), 515-22; Pennica, D. et al., Nature (London) 312 (1984), 724-29; Shirai, T. et al., Nature (London) 313 (1985), 803-06; Wang, A. M. et al., Science 228 (1985), 149- 54. Eine einzige AvaI-Stelle liegt innerhalb der ersten sieben Aminosäuren des reifen Proteins. Eine einzige HindIII- Stelle liegt 125 Bp stromabwärts vom Translations-Terminationssignal. Durch Restriktionsendonease-Spaltung mit
AvaI und HindIII wurde das letztgenannte Fragment aus einem Plasmids isoliert, das das clonierte HTNF-cDNA-Gen enthielt (vgl. Marmenout et al., Eur. J Biochem. 152 (1985), 515 und die internationale Anmeldungsnummer PCT/EP85/00721, internationale Veroffentlichungsnummer WO86/03751). Es wurde einer von mehreren Synthetischen Oligonucleotid-Linkern, wie in Tabelle 1 dargestellt, zur Wiederherstellung der sieben N- terminalen Aminosäuren des AvaI-HindIII-Fragments der HTNF- Sequenz und zur Insertion des Fragments in den pLT4-Vektor Verwendet.
Diese Oligonucleotide wurden auf dem automatischen Synthesegerät "380A" von Applied Biosystems synthetisiert.
Nach der Standard-Entfernung der Schutzgruppen wurden die Oligonucleotid-Rohprodukte durch C-28 SEP-PAK (Waters/Millipore Inc.) entsalzt, anschließend auf einem präparativen 7 M Harnstoff/15% Polyacrylamidgel (vgl. Maniatis, T. et al., Biochemistry 14 (1975), 3787-94) gereinigt. Jede spezifische Genkonstruktion wird durch den für ihre Synthese verwendeten Oligonucleotid-Linker gekennzeichnet. In dieser Reihe spezifizieren CA1, CA3, CA5 und CA13 alle die natürliche HTNF- Aminosäure-Sequenz, jedoch mit unterschiedlichen Codon-Verwendungen. Δ2 steuert die Synthese eines Proteins, dem die ersten beiden Aminosäuren fehlen, und CA-his führt als zweite Aminosäure des reifen Proteins einen Histidinrest, anstelle von Arginin ein. Dies wird durch eine einzige Basenpaar-Mutation, die von der Clonierung des CA1-Linkers stammt, bewirkt.
Zur Herstellung von pAT153-pLT4 HTNF-(Gn) tet+ wurde Plasmid pAT153 (vgl. Twigg, A. et al., Nature 283 (1980), 216-18) mit EcoRI gespalten, mit dTTP, dATP und der DNA- Polymerase aufgefüllt und anschließend mit PstI gespalten. Anschließend wurde das längere der beiden Fragmente gereinigt. Als nächstes wurde das Plasmid pBR322-pLT4 HTNF (Gn) (hergestellt durch die vorstehend beschriebene, vier Moleküle verknüpfende Ligierung ("four-way"-Ligierung)) mit BamHI gespalten, mit den vier dNTPs und der DNA-Polymerase aufgefüllt und anschließend mit PstI gespalten. Dieses Fragment wurde zum Erhalt von pAT153-pLT4 HTNF-(Gn) tet+ einem Tetracyclin-resistenten Plasmid, das den menschlichen Tumor-Nekrose-Faktor produziert, an das EcoRI (aufgefüllt)- PstI-Fragment von pAT153 ligiert.

Beispiel 3

Herstellung von T4-Ter-Derivaten

Zur Herstellung eines den T4-Gen-32-Transkriptions- Terminator enthaltenden Plasmids (T4-ter oder ter Plasmide) wurde Plasmid pAT153-pLT4 HTNF (Gn)-Sal produziert (vgl. Fig. 1C), dieses Plasmid wurde gespalten und das erhaltene Fragment von etwa 1100 Bp an ein Fragment des Plasmids pAT153 und ferner auch an einen synthetischen Oligonucleotid-Linker, der die T4-ter-Sequenz umfaßt, ligiert (vgl. Tabelle 1 und Krisch, H. M. und Allet, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 4937-41). Diese drei Moleküle verknüpfende Ligierung führte zum Plasmid pAT153-pLT4 HTNF-T4- Ter.
Plasmid pAT153-pLT4 HTNF (Gn)-Sal wurde durch Einführung einer SalI-Stelle unmittelbar nach dem TGA- Translations-Terminations-Codon von pAT153-pLT4 HTNF (Gn) hergestellt. (Die Einführung der SalI-Stelle kann durch jedes Verfahren der Stellen-spezifischen Mutagenese erreicht werden, zum Beispiel durch das Verfahren mit der Moleküllücke (vgl. Oostra, B. A. et al., Nature 304 (1983), 456- 59). Als Folge davon wurden die HTNF-Sequenzen 5'- TGAGGAGGACGAAcAT durch 5'-TGAGTCGACGAACAT ersetzt.
Anschließend wurde das Plasmid pAT153-pLT4 HTNF (Gn)- Sal mit der Restriktionsendonuclease SalI gespalten und die Stelle mit Klenow aufgefüllt. Es wurde anschließend mit PstI gespalten. Das erhaltene Fragment von etwa 1100 Bp wurde durch Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Das Plasmid pAT153 wurde parallel dazu mit EcoRI und anschließend mit PstI gespalten, und durch Agarose-Gelelektrophorese das größere Fragment isoliert.
Anschließend wurde ein Synthetischer Oligonucleotid- Linker hergestellt, der die T4-Gen-32-Transkriptionsterminations-Sequenz umfaßte (vgl. Krisch, H. M. und Allet, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 4937-41), eine EcoRI- Stelle an einem Ende und eine mit Klenow behandelte HindIII- Stelle am anderen Ende aufwies (vgl. Tabelle 1). Dieser Oligonucleotid-Linker wurde auf einem automatischen Synthesegerät "380A" von "Applied Biosystems" synthetisiert. Nach der Standard-Entfernung der Schutzgruppen wurden die Oligonucleotid-Rohprodukte durch C-28 SEP-PAK (Waters/Millipore Inc.) entsalzt. Anschließend wurden die Oligonucleotide auf einem präparativen 7 M Harnstoff/15% Polyacrylamidgel (vgl. Maniatis, T. et al., Biochemistry 14 (1975), 3787-94) gereinigt.
Das PstI-SalI-Fragment von pAT153-pLT4 HTNF (Gn)- SalI, das EcoRI-PstI-Fragment von pAT153 und der synthetische, die ter-Sequenz enthaltende, EcoRI-HindIII-Oligonucleotid-Linker wurden zur Herstellung des Plasmids pAT153- pLT4 HTNF T4-ter ligiert.

Beispiel 4

Herstellung von Δ-DL-Derivaten

Zur Untersuchung der Wirkungen der alleinigen Verwendung des von T4 stammenden DNA-Abschnitts wurde der von Lambda-PL stammende Abschnitt zwischen der PstI-Stelle (Kartierungs-Position 3607 von pBR322) oder der DraI-Stelle (Kartierungs-Position 3232 von pBR322) und der EcoRI-Stelle an der Verbindung zwischen den von PL und T4 stammenden DNA- Sequenzen entfernt (vgl. Fig. 1B).
Beispielsweise zur Entfernung des von Lambda PL stammenden Abschnitts von Plasmid pAT153-pLT4 HTNF (Gn) (vgl. Fig. 1B) zur Herstellung von Plasmid pAT153-T4 HTNF (Gn) (vgl. Fig. 1C) wurde zunächst Plasmid pAT153-pLT4 HTNF (Gn) durch ein Gemisch der Restriktionsenzyme EcoRI und PstI (oder DraI) gespalten, das sowohl eine Ampicillin als auch eine Tetracyclin-Antibiotika-Resistenz überträgt, wodurch ein Gemisch von zwei Fragmenten, die in Gegenwart von dATP und dTTP mit dem Klenow-Fragment behandelt wurden, erhalten wurde. Die DNA-Fragmente wurden anschließend durch Agarose- Gelelektrophorese getrennt, danach gereinigt, mit sich selbst ligiert, und das größere Fragment von etwa 3600 Bp (EcoRI-PstI) oder 3200 Bp (EcoRI-DraI) wurde in E. coli W3110 vermehrt (vgl. Bachmann, B. J., Bacter. Rev. 36 (1972), 525), wodurch die in Fig. IC als pAT153-T4-HTNF-(Gn) dargestellten Plasmide erzeugt wurden.
Diese Manipulation, die die Lambda PL-DNA-Sequenzen entfernt, deletiert auch einen Teil des beta-Lactamase-Gens (Ampicillin-Resistenz-Gens). Das erhaltene Plasmid ist daher Ampicillin-empfindlich und Tetracyclin-resistent.

Beispiel 5

Herstellung von Plasmid pAT153-pLT4-HTNF-CA3-cts-T4-(ter oder Gn)

Zur Herstellung eines Plasmids, das sowohl das hitzeinduzierbare Repressorgen vom Bacteriophagen Lambda (cts-Gen) als auch den Temperatur-gesteuerten PL-Promotor enthielt, war es notwendig, das das cts-Gen enthaltende, etwa 1100 Bp große Fragment aus der Bacteriophagen Lambda-DNA vom Stamm cI857ind S7 (New England Biolabs, Katalog #301-1, Lambda-DNA) zu isolieren. Zur Isolierung dieses 1100 Bp-Fragments wurde die Lambda-DNA mit der Restriktionsendonuclease BglII gespalten, mit den vier dNTP-Molekülen und der DNA-Polymerase aufgefüllt und anschließend mit PstI gespalten.
Anschließend wurde ein Plasmid-Derivat von pAT153- pLT4 HTNF (Gn) tet+ durch Insertion eines den PL-Promotor enthaltenden, 270 Bp PstI-EcoRI-DNA-Fragments in pAT153-pLT4 HTNF (Gn) hergestellt, wodurch das 1150 Bp PstI-EcoRI- Fragment ersetzt wurde, das den beta-Lactamase-Promotor, eine aminoterminale Hälfte des beta-Lactamase-Gens und den ursprünglichen PL-Promotor enthielt, wodurch ein Plasmid hergestellt wurde, das Ampicillin-empfindlich ist: Plasmid pAT153-pLT4 HTNF (Gn) tet+ amp&supmin;. Anschließend wurde dieses Plasmid mit PstI und DraI gespalten, das größere Fragment isoliert und an das das cts-Gen enthaltende 1100 Bp- BglII (aufgefüllt)-PstI-Fragment ligiert. Durch diese Ligierung entstand Plasmid pAT153-pLT4-HTNF-cts-(Gn). Derivate, in denen (Gn) durch T4-ter ersetzt ist, können in einer Weise hergestellt werden, wie sie in Beispiel 3 zur Herstellung von Plasmid pAT153-pLT4-HTNF-cts-T4-ter (vgl. Fig. 2) beschrieben wird.

Beispiel 6

Bestimmung der Struktur des T4-Promotors

Zur Bestimmung der Struktur des T4-Promotors wurden RNA-Proben von Zellen isoliert, die die nachstehend beschriebenen Ter-Plasmide enthielten: pLT4-CA5, T4-CA5 (Dra), pLT4-CA3, T4-CA3(Dra) und T4-CA5(Pst). Anschließend wurden die Initiationsstellen der Transkription identifiziert und durch S1-Kartierung und Northern Blot-Analyse die Transkript-Größen bestimmt.

RNA-Isolierung

Zur Isolierung von RNA-Proben wurde das Extraktionsverfahren mit heißem Phenol von J. H. Miller verwendet (Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) (1972)). Nach der Behandlung sämtlicher Puffer mit 0,1 Volumen-% Diethylpyrocarbonat (DEP) wurden die Puffer 10 Min. auf 80ºC erhitzt.
Die die T4-Plasmide enthaltenden Zellen wurden bei 37ºC bis zu einer OD&sub5;&sub7;&sub5; von 1,0 in einem Komplexmedium (10 ml) gezüchtet. Anschließend wurde DEP (0,1 Volumen-%) zugesetzt und die Zellen durch Zentrifugation gesammelt.
Weitere die pLT4-Plasmide enthaltende Zellen wurden bei 30ºC in dem Komplexmedium (20 ml) gezüchtet. Bei einer OD&sub5;&sub7;&sub5; von etwa 0,6 wurde ein 10 ml-Aliquot der das pLT4- Plasmid-enthaltenden Zellen auf 42º übertragen, und anschließend ließ man die beiden Kulturen (30º und 42º) eine weitere Stunde wachsen. Anschließend wurde DEP (0,1 Volumen-%) zugesetzt, und diese Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt.
Nach der Zentrifugation wurden die Pellets von jedem Zellgemisch in 2 ml 20 mM Na-acetat, pH-Wert 5,5, 1 mM Na- EDTA und 0,5% SDS bei 600 resuspendiert. Anschließend wurde vorerhitztes Phenol (2 ml), das in demselben Na-acetat- Puffer, pH-Wert 5,5, gesättigt war, zugesetzt, die Gemische 15 Sek. auf einem Vortex stark geschüttelt, 30 Sek. bei 60ºC inkubiert und erneut 30 Sek. auf einem Vortex geschüttelt. Nach einer erneuten Zentrifugation (5 Min., 4ºC) wurden die oberen wäßrigen Phasen gesammelt und die vorstehend beschriebene Phenol-Behandlung wiederholt.
Anschließend wurden 0,2 ml 3M Na-acetat, 10 mM Na- EDTA und 6,5 ml Ethanol zu den wäßrigen Phasen zugesetzt, die Gemische 10 Min. bei 70ºC inkubiert und 20 Min. bei 15000 UpM (4ºC) zentrifugiert. Die Pellets von jedem Gemisch wurden in vacuo getrocknet, in 0,3 ml 0,3 M Na-acetat, 1 mM Mg-acetat, 1 mM Na-EDTA erneut gelöst, und anschließend wurden die Gemische in Eppendorf-Röhrchen überführt und mit Ethanol ausgefällt. Die Niederschläge wurden anschließend einmal in 80% Ethanol gewaschen, getrocknet und anschließend in 100 ul destilliertem Wasser erneut gelöst.

S1-Kartierung

Es wurde ein S1-Kartierungsexperiment zur genauen Bestimmung der Initiationsstelle(n) der Transkription innerhalb der PL- und T4-DNA-Sequenzen entwickelt.
Zunächst wurde 5 ul RNA, die wie vorstehend beschrieben isoliert worden war, mit 45 ul 0,3 M Na-acetat und 1 mM EDTA gemischt. Das Gemisch wurde anschließend mit Ethanol ausgefällt und einmal in 80% Ethanol gewaschen, der Niederschlag wurde getrocknet und anschließend in 20 ul 40 mM Pipes, pH-Wert 6,4, 0,4 M NaCl und 1 mM Na-EDTA resuspendiert. pLT4-HTNF-cts-Plasmid-DNA (Fig. 2) wurde parallel dazu mit ClaI gespalten, und die Stellen am 5'-Ende wurden unter Verwendung der T4-Polynucleotid-Kinase mit γ-³²P-ATP markiert. Nach der Spaltung mit PstI wurde zur Isolierung des die PL- und T4-DNA-Sequenzen enthaltenden 405 Bp- Fragments ein 5% Polyacrylamidgel verwendet. Anschließend wurden die isolierten Fragmente in Wasser (50 ul) gelöst, die Gemische zur Trennung der Stränge 2 Min. auf 95ºC erhitzt, und anschließend wurde das erhaltene Gemisch schnell abgekühlt. Als nächstes wurden den RNA-Proben 2 ul Aliquots der 5'-markierten DNA zugesetzt, wie vorstehend beschrieben in Pipes-Puffer resuspendiert, und anschließend wurden die RNA- und DNA-Gemische 90 Minuten bei 65ºC inkubiert.
Anschließend wurde den Gemischen S1-Puffer (200 ul 0,03 M Na-acetat, pH-Wert 4,6, 0,25 M NaCl, 1 mM ZnSO&sub4;) und 2000 Einheiten S1-Nuclease zugesetzt. Die Reaktionsgemische wurden 30 Min. bei 37ºC inkubiert, anschließend wurden die Proben mit Ethanol ausgefällt, der Niederschlag wurde mit Ethanol gewaschen und schließlich zur Sequenzierung in denaturierendem Polyacrylamidgel in Probenpuffer gelöst (vgl. A. M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560-64). Als Größenstandards wurden eine Reihe von Fragmenten, die durch Sequenzierung des an der ClaI-Stelle markierten 405 Bp-Fragments erhalten worden waren, auf dasselbe Sequenzierungsgel aufgetragen.
Wie in Fig. 5 dargestellt, wurden vier mRNA- Startstellen (entsprechend vier Promotoren, die durch die Zahlen in den Kreisen bezeichnet werden) innerhalb der T4- DNA und eine (wie erwartet) innerhalb der PL-DNA identifiziert. Entlang der in der Figur gezeichneten Sequenz wird die Abkürzung P. B. zur Bezeichnung verschiedener "Pribnow- Boxen" verwendet. Diese Pribnow-Boxen sind starke Bindungsstellen für die RNA-Polymerase. Die Abkürzung e. s. wird in der Figur zur Bezeichnung der Eintrittsstellen für die RNA-Polymerase verwendet. Auf die Lage dieser Stellen wurde durch die Analogie zur Konsensus-Struktur der E. coli- Promotoren geschlossen.
Wie aus dem Autoradiogramm von Fig. 5 hervorgeht, treten die vier mRNA-Arten, die von pLT4-CA5-, T4-CA5(Dra)-, pLT4-CA3-, T4-CA3 (Dra)- und T4-CA5(Pst)-Sequenzen umfassenden Plasmiden stammen, als unterschiedlich intensive Banden auf. Die unten aufgeführten Zahlen 1 bis 4 bezeichnen jede der vier RNA-Transkriptions-Einheiten, von denen jede eine andere Länge aufweist und von einer unterschiedlichen RNA- Polymerase-Bindungsstelle in der T4-DNA-Sequenz initiiert.
Wenn das T4-Fragment an die DraI-Stelle von pBR322 (T4-Dra-Plasmid) fusioniert ist, ist die der mRNA 4 entsprechende Bande interessanterweise die auffallendste. Im Gegensatz dazu ist die mRNA 1 vorherrschend, wenn das T4- Fragment mit der PstI-Stelle von pBR322 (T4-Pst-Plasmid) verbunden ist. Dies läßt vermuten, daß der durch die PstI- Verbindung geschaffene Promotor 1 stärker ist, als der durch die DraI-Verbindung gebildete, und auch stärker als der Promotor 4. Die HTNF-Protein-Expressions-Mengen von T4-Dra- und T4-Pst-Sequenzen umfassenden Plasmiden sind jedoch nicht unterscheidbar (nicht dargestellt) Ferner zeigen die pLT4- Derivate (CA3 und CA5) nur die am PL-Promotor beginnenden mRNA-Moleküle, als wenn in Gegenwart von PL praktisch keine mRNA-Transkripte am (an den) T4-Promotor(en) initiieren würden. Ergebnisse von Northern Blot-Analysen (nachstehend beschrieben), die bei der S1-Kartierung nicht beobachtete Transkripte nachwiesen, zeigen, daß diese Interpretationen falsch sind. Daher ist das S1-Kartierungs-Verfahren, obwohl es zur Identifizierung von Transkriptions-Initiationsstellen nützlich ist, zur quantitativen Analyse von Transkripten, die von mehreren Promotoren ausgehen, ungeeignet.

Northern Blot-Analyse

Zur genaueren Feststellung der Zahl von einzelnen, an er T4-Promotor-Sequenz initiierenden RNA-Arten wurde eine Nothern Blot-Analyse durchgeführt, und es sollte so die ermutete, multiple Promotor-Struktur der T4-Sequenz bestäigt werden. Zur Durchführung der Northern Blot-Analyse wurden die, wie vorstehend beschrieben, isolierten RNA-Proben nächst durch 15 minütige Behandlung bei 60ºC in Ladungspuffer (50% Formamid, 2,2 M Formaldehyd, 20 mM Borat, pH-Wert 8,4, 1 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau) denaturiert. Die denaturierten Proben wurden auf mit 20 mM Borat, PH-Wert 8,4 und 1 mM EDTA gepufferte, horizontale 1,2% Agarose - 2,2 M Formaldehyd-Gele aufgetragen, und anschließend wurde 5 Stunden bei 80 V eine Elektrophorese durchgeführt. Nach Durchtränkung in TAE-Puffer (40 mM Tris-acetat, PH-Wert 7,4, 1 mM Na-EDTA) wurden die Gele via Electroblots gemäß den Empfehlungen des Herstellers auf Gene Screen Plus (New England Nuclear)-Membranfilter überführt.
Es wurden durch Nick-Translation aus dem 610 Bp-Clal- HindIII-Fragment (Fig. 2, (Gn) Plasmid), das das HTNF-Gen (TNF-spezifische Sonde) enthielt, und dem 280 Bp-PstI-EcoRI- Fragment (PL-Promotor-Sonde) ³²P-markierte Sonden hergestellt. Anschließend wurde die RNA auf den Membranfiltern 2 Stunden bei 42ºC prähybridisiert (6 · SSC, 50% Formamid, 5 · Denhardts-Lösung, 0,1% SDS und 250 ug/ml mit Ultraschall behandelte Lachs-Sperma-DNA). Anschließend wurde die RNA mit den markierten Sonden 18 Stunden bei 42ºC hybridisiert (Prähybridisierungs-Puffer plus 250000-500000 cpm/ml Sonde). Schließlich wurden die Membranfilter mit 2 · SSC gespült, 20-30 Min. bei 55ºC in 0,2 · SSC gewaschen, und anschließend wurden die Filter Röntgenfilmen exponiert.
Unter Verwendung der nur PL-DNA-Sequenzen umfassenden Nick-translatierten Sonde wurde in den T4-RNA-Proben, wie erwartet, kein Transkript nachgewiesen. Die pLT4-RNA-Proben zeigten eine einzelne RNA-Art von 760 Basen, die vermutlich einem Transkript entspricht, das am PL-Promotor beginnt, sich über das HTNF-Gen erstreckt und am Ter endet. Die pLT4- RNA-Probe von der induzierten Kultur (42ºC) zeigt ein starkes Signal, das in der nicht-induzierten Kultur (30ºC) Schwach sichtbar ist. Bei der nur HTNF-codierende Sequenzen umfassenden Sonde zeigen sämtliche der T4- und pLT4-Proben eine einzelne Bande von 540 Basen, die mRNA-Molekülen entsprechen, die innerhalb der T4-Sequenzen an der mRNA 4 beginnen, sich in das HTNF-Gen erstrecken und am Ter enden. Ferner zeigt die pLT4-Probe (42ºC) das PL-Transkript von 760 Basen; und die T4-Pst-Probe überlagert eine Species, die ein wenig größer als 540 Basen ist und vermutlich aus einem an der mRNA 1 initiierten Transkript besteht.
Diese Interpretationen werden durch Fig. 6B bestätigt, in der homologe Plasmide (CA3) mit Ter oder (Gn) verglichen werden. Die (Gn)-Plasmide (denen ein authentischer Terminator fehlt) erzeugen keine einzelnen mRNA-Moleküle. Die Northern Blot-Analyse weist stattdessen, insbesondere bei der pLT4-Probe, mehr diffuse Banden von größeren Molekulargewichten nach. In der T4-(Gn)-Probe akkumuliert eine signifikante Menge des HTNF-RNA-Materials in einem Bereich, das einem am T4-Promotor beginnenden und in der Nähe des (Gn)-Schwanzes endenden Transkripts entsprechen würde (zu beachten ist, daß der (Gn)-Schwanz 125 Bp stromabwärts vom TGA-Stop-Codon liegt, während Ter diesem Codon benachbart ist).
Es ist auffallend, daß die Northern Blot-Analyse zwei Transkripte nachweist, die bei der S1-Kartierung nicht beobachtet werden, d. h. das T4-Transkript in den pLT4-RNA-Proben und das mRNA-4-Transkript in der RNA von T4-Pst-Plasmiden. Da die S1-Kartierung mit der gesamten, nicht-fraktionierten RNA durchgeführt wurde, waren in dem Gemisch mit der einzelnen DNA-Probe durch mehrere Transkriptions-Initiationsstellen erzeugte mRNA-Moleküle unterschiedlicher Größe vorhanden. RNA-Moleküle, die lange Homologie-Bereiche mit der DNA-Sonde aufwiesen, konnten Moleküle mit kürzerer Homologie während der Hybridisierungen verdrängen, insbesondere, da mehr RNA als DNA vorhanden war. Durch diesen Mechanismus wären weiter stromaufwärts am PL-Promotor initiierte RNA-Transkripte relativ zu den stromabwärts an den T4- Promotoren initiierten Transkripten in den S1-Kartierungs- Experimenten überrepräsentiert. Eine derartige Unausgewogenheit wurde anscheinend in der Northern Blot-Analyse eliminiert, die elektrophoretisch getrennte RNA-Moleküle nachwies, wodurch die verschiedenen RNA-Arten verläßlicher identifiziert wurden. Ferner sind T4-CA3- und T4-CA5-Transkripte genauso im Überschuß vorhanden, obwohl das von CA3 erhaltene HTNF-Protein in signifikant geringeren Mengen als das von CA5 vorliegt, wie nachstehend dargestellt wird. Dies zeigt an, daß nicht die Transkription, sondern die Translation die Expression von CA3 begrenzt.

Beispiel 7

Bestimmung der Wirkung einer multiplen Promotor-Struktur

Zum Testen der Wirkung der multiplen - im Gegensatz zu einer einzigen - Promotor-Struktur auf die Genexpression wurden mit Bal31-Nuclease Deletionsderivate von T4-Δ-Ter (Fig. 7) hergestellt und hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Förderung der Proteinsynthese mit dem ursprünglichen Plasmid verglichen.
Taq-T4 wurde aus T4-Δ2 und danach Bal4, 8, 10 und 11 aus Taq-T4 erhalten. Nach dem Auffüllen der ClaI-Stelle von T4-Δ2 zwischen der SD und dem Initiationscodon ATG mit Klenow zur Vermeidung einer Spaltung durch Taq1 wurden die T4-Sequenzen stromaufwärts von der einzigen Taq1-Stelle auf der T4-DNA entfernt. Anschließend wurden die Endpunkte der Taq-T4-Deletion durch eine AsuII-Stelle (durch eine DraI- Taq-K-Verbindung) miteinander verknüpft. Bal4, 8, 10 und 11 wurden aus Taq-T4 durch Abverdau von der einzigen AsuII- Stelle mit Bal31, durch Anfügen von XbaI-Linkern (5'- CTCTAGAG) mit einer anschließenden XbaI-Spaltung und durch eine erneute Ligierung der linearen Moleküle gewonnen.
Die DNA-Sequenzen der erhaltenen Derivate wurden durch das Verfahren von Maxam und Gilbert bestimmt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 560-64). Taq-T4, Bal4 und Bal8 weisen sämtlich einen intakten Promotor 4 auf (e. s. 4, P. B. 4 und mRNA 4) (Fig. 7), es wurden jedoch Elemente der anderen drei Promotoren deletiert. Der rechte Endpunkt der Bal11-Deletion liegt innerhalb e. s 4, das daher inaktiviert ist. Bal10 weist die Ribosomen-Bindungsstelle auf, der vollständige T4-Promotor ist jedoch deletiert worden.
Eine Analyse durch densitometrische Abtastung des in Fig. 7 dargestellten Gels zeigte an, daß das ursprüngliche Plasmid 53% der Gesamtmasse des E. coli-Proteins als HTNF exprimiert, während Proteinmengen von 38-41% bei den Bal4- und Bal8-Derivaten, in denen die drei Promotoren fehlen, gemessen werden. Bal10 und 11 exprimieren keine nachweisbaren HTNF-Mengen. Die Ergebnisse der S1-Kartierung und der Northern Blot-Analysen stimmen, zusammen mit der Deletions- Analyse, mit der Anordnung von verschiedenen wirksamen Promotoren innerhalb des T4-DNA-Fragments überein. Ferner zeigt die Deletionsanalyse, daß die Struktur von Tandem- Promotoren zur Überproduktion eines gewünschten Proteins beiträgt.

Beispiel 8

Bestimmung der Wirkung von verschiedenen synthetischen Oligonucleotid-Linkern auf die exprimierten Proteinmengen

Zur Analyse der Proteinexpression von HTNF-Varianten wurden zunächst die Plasmide T4-CA1, T4-CA-his, T4-CA3, T4- CAS, T4-CA13, T4-Δ2, pLT4-CA1, pLT4-CA-his und pLT4-CA13 in einem λ&spplus;. E. coli-c600-Abkömmling thr-1, leuB6, thi-1, supE44, lacY1, tonA21, hsr&supmin;, hsm&spplus; vermehrt. Zur Plasmid- Erzeugung wurden die E. coli-c600-Transformanten bei 37ºC in mit Ampicillin (40 ug/ml) oder Tetracyclin (5 ug/ml) versetzter LB-Brühe (1% Bactotrypton, 0,5% Bacto-Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH-Wert mit NaOH auf 7,0 eingestellt) gezüchtet.
Nach der Selektion von, wie vorstehend beschrieben vermehrten Plasmiden zur HTNF-Proteinexpression wurde W3110, ein prototropher E. coli K12-(λ&supmin;, F&supmin;) (vgl. B. J. Bachmann, Bact. Rev. 36 (1972), 525-57), transformiert (vgl. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982)). Die Transformanten wurden in einem Komplexmedium, das Casaminosäuren, Hefeextrakt, Glycerin und das geeignete Antibiotikum (Ampicillin (40 ug/ml) oder Tetracyclin (5 ug/ml)) enthielt, unter heftigem Schütteln in Schüttelkolben gezüchtet (240 Umdrehungen pro Minute auf einem "G10 Gyrotory Shaker", New Brunswick Scientific). Die E. coli W3110-Transformanten, die Plasmide trugen, die den nicht-induzierbaren T4-Promotor enthielten (Plasmide T4-CA1, CA-his, CA3, CA5, GA13 oder Δ2), wurden über Nacht bei 37ºC bis zu einer OD&sub5;&sub7;&sub5; zwischen 6 und 10 gezüchtet. Bei Einschluß des Wärme-induzierbaren cts-Gens in ein pLT4-Plasmid wurden die Zellen bei 30ºC gezüchtet. Bei Wärme-Induktions-Experimenten, die zur Feststellung bestimmt waren, ob eine zusätzliche Proteinexpression durch Aktivierung des PL- Promotors in pLT4-Transkripten erreichbar ist, wurden Aliquots der Kultur bei 30ºC bis zu einer OD&sub5;&sub7;&sub5; von 2,0 gezüchtet, anschließend wurde ein Aliquot bei 42ºC gezüchtet, und man ließ die beiden Proben (30ºC und 42ºC) mindestens 2 Stunden weiter wachsen.
Anschließend wurden Proteinproben (etwa 2 · 102 OD&sub5;&sub7;&sub5; Äquivalente) von den gezüchteten Zellen zur Analyse durch Gradienten-SDS-Polyacrylamid-Ge-elektrophorese hergestellt. Zur Durchführung der Gradienten-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden zunächst im Komplexmedium (1 ml) gezüchtete Zellen zentrifugiert (in Eppendorf-Röhrchen), die Zellen wurden in 500 ul Probenpuffer (so mM Hepes, PH-Wert 8, 30 mM NaCl, 4% SDS, 4 M Harnstoff, 1% β-Mercaptoethanol, 0,05% Bromphenolblau) resuspendiert, das Gemisch wurde 10 Min. auf 95ºC erwärmt und anschließend 10 Min. mit 15000 UpM zentrifugiert. Es wurden Aliquots des Überstandes (2-4 ul, 10&supmin;²-10&supmin;¹ OD&sub5;&sub7;&sub5;-Äquvalenten entsprechend) auf Gradienten (10-20%)-SDS-Polyacrylamidgele aufgetragen (vgl. U. K. Laemmli, Nature 227 (1970), 680-85) und anschließend mit Coomassie-Brilliant-Blau angefärbt Die Ergebnisse der Elektrophorese-Analyse zeigten überraschenderweise, daß die mit den Oligonucleotid-Linkern CA-his, CA5 oder Δ2 (Tabelle 1) konstruierten Plasmide als pLT4-Konstrukte große Mengen HTNF-Protein unter Temperaturbedingungen (30ºC) exprimierten, die keine Transkription vom Wärme-induzierbaren PL-Promotor induzieren. Diese große Exressionsmenge wurde vollständig beibehalten, wenn die PL- Sequenzen zur Erzeugung der entsprechenden T4-Konstrukte deletiert wurden (vgl. Fig. 1B und 1C). Die Ergebnisse der Elektrophorese-Analyse zeigten im Gegensatz dazu, daß die die CA1-, CA3- oder CA13-Linker (Tabelle 1) enthaltenden Plasmide wenig HTNF exprimierten, wenn die PL-Sequenzen zur Erzeugung der entsprechenden T4-Konstrukte deletiert wurden; diese Plasmide exprimierten als pLT4-Konstrukte auch wenig HTNF unter Temperaturbedingungen (30ºC), die keine Transkription vom Wärme-induzierbaren PL-Promotor induzieren.
Typische Ergebnisse der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese sind in Fig. 8 dargestellt. Sämtliche Plasmide, auf die in der Figur Bezug genommen wird, weisen den T4-Terminator auf. Der Pfeil weist auf die 17,5 kDalton-HTNF-Bande hin. Die Marker-Proteine sind die SDS-PAGE-Standards von niedrigem Molekulargewicht (Katalog # 161-0304, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), wie in Fig. 7.
T4-CA1 und T4-CA-his unterscheiden sich nur durch eine Base (vgl. Tabelle 1) im frühen Teil des Gens. Diese Mutation ersetzt im Protein einen Arginin- durch einen Histidin-Rest. Wie in Fig. 8 durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gezeigt, beeinflußt diese einzige Veränderung wesentlich die exprimierte Proteinmenge des Gens.
Die Figur zeigt auch, daß die Plasmide T4-CA3 und T4- CA5 unterschiedliche Expressionsniveaus aufweisen. Diese Plasmide codieren dasselbe HTNF-Polypeptid, weisen jedoch in der Nähe des Aminoterminus drei Veränderungen in der Codon- Verwendung auf (Tabelle 1). Solche Veränderungen sind aufgrund der Redundanz im DNA-Code möglich, die es einem Fachmann erlaubt, unter bestimmten Nucleotiden auszuwählen, ohne die Aminosäure zu ändern, die durch die Sequenz codiert wird. Ferner weist T4-CA5 drei dem ATG-Initiationscodon voranstehende A-Reste auf. Diese Reste sind wahrscheinlich für ehe Expressionsniveaus nicht wesentlich, da sie in T4-CA- Bis- und T4-Δ2-Genen, die trotzdem stark exprimiert werden (Fig. 8), deletiert sind.
Fig. 8 stellt auch die nach der Hitze-Inaktivierung des cts-Repressor-Gens mit den pLT4-Abkömmlingen von CA1, CA-his und CA13 erhaltenen Protein-Muster dar. Ein aktiver PL-Promotor erhöht die Expression von pLT4-CA1 und (in einem geringeren Ausmaß) pLT4-CA13, jedoch nicht die von pLT4-CA- his. Es werden ähnliche Ergebnisse (nicht dargestellt) bei pLT4-CA3 (Erhöhung) und pLT4-CA5 (keine Erhöhung der Expression am PL-Promotor) beobachtet. Eine wirksame Translation der konstitutiven T4-Transkripte, die aus pLT4-CA-his und pLT4-CA5 enthaltenden Plasmiden hergestellt wurden, hat wahrscheinlich die Fähigkeit der Zellen zur Akkumulation von mehr HTNF-Protein vor der PL-Induktion erschöpft, wodurch der zusätzliche Beitrag des PL-Transkripts in der Protein- Synthese maskiert wurde.
In DNA-Rekonstruktions-Experimenten (dazu bestimmt, zufällige Mutationen durch ein Verfahren zu kontrollieren, das das Zusammenfügen von Plasmid-Fragmenten enthält, von denen bekannt ist, daß sie keine Mutationen aufweisen), in denen die Paare von AvaI- oder ClaI-Fragmenten der verschiedenen Plasmide ausgetauscht wurden, wurde festgestellt, daß die DNA-Sequenzen innerhalb der synthetischen Linker (Tabelle 1) allein für die unterschiedlichen, in Fig. 8 dargestellten Expressionsniveaus verantwortlich waren.
Diese Ergebnisse zeigen an, daß geringfügige Unterschiede in den DNA-Sequenzen von Linkern gravierende Folgen auf die Stärke der Expression eines gewünschten Proteins haben. Obwohl keine Festlegung auf irgendeine Theorie erwünscht ist, wird angenommen, daß die Veränderung der DNA- Sequenz des synthetischen Oligonucleotid-Linkers höchst wahrscheinlich die Protein-Expression auf der Translationsebene durch einen Mechanismus beeinflußt, der die mRNA- Sekundär-Struktur einschließt, d. h. eine Basenpaarung von homologen Sequenzen auf der mRNA.

Beispiel 9

Wirkung des T4-Gen-32-Transkriptions-Terminators auf die Stärke der Protein-Expression

Zur Analyse der Wirkung des T4-Gen 32-Transkriptions- Terminators auf die Stärke der Expression eines gewünschten Proteins wurden die HTNF-Produktionsniveaus von (Gn) und Ter enthaltenden Plasmiden verglichen. Diese Plasmide wiesen entweder einen 24mer Poly-G-Schwanz in 3'-Richtung zur HindIII-Stelle ((Gn) Plasmide) oder eine synthetische T4- Terminator-Sequenz (vgl. Tabelle 1) auf, die unmittelbar nach dem HTNF-Translations-Terminations-Signal eingeführt worden war, wodurch die 125 Bp der 3'-nicht-translatierten DNA deletiert worden waren (Ter-Plasmide). Durch densitometrische Abtastmessungen von Polyacrylamid-Gelen wurde festgestellt, daß die Ter-Plasmid-Konstruktionen beständig mehr HTNF-Protein als die entsprechenden (Gn)-Plasmid-Konstruktionen exprimierten.
Fig. 9 stellt die Analyse von Protein-Proben dar, die zu verschiedenen Zeitpunkten während der Fermentation in Komplexmedium von die T4-CA3-Ter- oder T4-CA5-Ter-Plasmide enthaltenden Bakterien genommen wurden. Während der exponentiellen Wachstumsphase (OD&sub5;&sub7;&sub5; von etwa 1 bis 5) ist der HTNF-Gehalt, bezogen auf die Protein-Gesamtmasse, um einen Faktor von mindestens 2 (nach Beurteilung durch densitometrische Abtastmessungen) niedriger als während der stationären Phase (OD&sub5;&sub7;&sub5; höher als 5). Die gleiche Wirkung wird beobachtet, wenn das Komplexmedium durch LB-Brühe oder M9- Medium ersetzt wird. Diese Wirkung ist bei T4-CA5 weniger deutlich, worin Ter deletiert oder durch (Gn) ersetzt worden ist (nicht dargestellt)
Der Grund für diesen unerwarteten Unterschied wurde in den in Fig. 10 dargestellten mRNA-Stabilitäts-Untersuchungen ersichtlich, mit denen die Fähigkeit der exponentiell wachsenden Zellen zur Synthese von Proteinen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Beendigung der Transkription durch Rifampicin-Zusatz überprüft wurde. Wie nachstehend besprochen wird, stabilisiert der T4-Transkriptions- Terminator die an den T4-Promotoren begonnene mRNA und ist für die beiden, bei den Ter-Plasmiden beobachteten Expressionsweisen verantwortlich.
Zur Einschätzung der mRNA-Stabilität der verschiedene Terminator-Sequenzen aufweisenden T4-Plasmide wurden zunächst Kulturen von E. coli W3110 gezüchtet, die T4-CA5-Ter, T4-CA3-Ter, T4-CA5-(Gn) und T4-CA5-ΔTer trugen. Plasmid T4- CA5-ΔTer wurde durch Deletion des synthetischen, in T4-CA5- Ter (vgl. Fig. 1C) vorhandenen T4-Terminators erhalten. Diese HTNF-Plasmide enthaltenden Zellen wurden bei 37ºC in 25 ml mit 0,2% Casaminosäuren versetztem M9-Medium bis zu einer OD&sub5;&sub7;&sub5; von 0,5 gezüchtet. Anschließend wurde zentrifugiert und in 20 ml des gleichen Mediums resuspendiert, mit dem Unterschied, daß die Konzentration an Casaminosäuren um das 10fache niedriger war.
Die Zellen wurden anschließend 10 Min. bei 37ºC inkubiert, und es wurde ein 2,5 ml Aliquot der gezüchteten Zellen zur Pulse-Chase-Markierung in ein separates Röhrchen transferiert. Gleichzeitig wurde Rifampicin zum Rest der Kultur (200 ug/ml Endkonzentration) zugesetzt. Zur Durchführung der Pulse-Chase-Markierung für die 0 Min. Kontrolle wurden zunächst dem 2,5 ml Aliquot 5 uCi ¹&sup4;C-Aminosäure- Gemisch (Amersham) zugesetzt, und das Zellwachstum wurde s Min. bei 37ºC fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt wurden im Überschuß (0,2% Endkonzentration) kalte Aminosäuren zugesetzt, und der Chase wurde 5 Min. fortgesetzt. Die Zellen wurden anschließend zentrifugiert und in 30 ul SDS-Gel- Proben-Puffer resuspendiert. Es wurden Aliquots der mit Rifampicin behandelten Kultur 15 Min., 30 Min., 45 Min. und 60 Min. nach Rifampicin-Zusatz entnommen. Jedes Aliquot wurde durch Pulse-Chase, genau wie vorstehend für die 0 Min.- Kontrolle beschrieben, analysiert.
Die radioaktiven Protein-Proben wurden anschließend 10 Min. auf 95ºC erhitzt, 10 Min. bei 15000 UpM zentrifugiert, und im Anschluß daran wurde in 12,5% SDS-Polyacrylamid-Gelen eine Elektrophorese durchgeführt. Anschließend wurden die Gele mit einer das Autoradiogramm verstärkenden Lösung (NEF-974, New England Nuclear) durchfeuchtet, getrocknet, und es wurden mit ihnen Röntgenfilme belichtet.
Fig. 10 stellt ein Autoradiogramm der Ergebnisse einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Protein-Proben dar, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beendigung der RNA-Transkription entnommen worden waren. Zum Zeitpunkt Null, d. h. dem Zeitpunkt des Rifampicin-Zusatzes, wurden sämtliche E. coli-Proteine, einschließlich HTNF, synthetisiert. Nach Beendigung der Transkription wurden nur Proteine, die aus den zuvor synthetisierten, stabilen mRNA- Molekülen hergestellt worden waren, nachgewiesen. Zwei E. coli-Proteine, das 32 kDalton-OmpA-Protein und ein 7,5 kDalton-Lipoprotein, wurden aus der stabilen mRNA synthetisiert (vgl. Hirashima, A. et al., J. Mol. Biol. 79 (1973), 373-89) und dienten als interne Kontrollen in den HTNF-mRNA- Stabilitäts-Untersuchungen. Wie der Figur zu entnehmen ist, synthetisierten T4-CA5-Ter und T4-CA3-Ter HTNF-Protein bis zu 30 Min. nach Rifampicin-Zusatz, während dies bei T4-CA5- (Gn) und T4-CA5-ΔTer nicht so war. In jedem Fall ist der Abfall der HTNF-Produktion vergleichbar mit dem Abfall des OmPA-Proteins und des Lipoproteins, die eine mRNA-Halbwertszeit von mehr als 10 Min. aufweisen. Diese Ergebnisse weisen nach, daß der T4-Terminator die an T4-Promotoren beginnende mRNA stabilisiert.
Die mRNA-Stabilität ist für die beiden Arten der Protein-Expression verantwortlich, die für T4-CA3-Ter und T4-CA5-Ter beobachtet werden (Fig. 9). Während der exponentiellen Wachstumsphase spiegelt ein Pool von HTNF-mRNA ein Gleichgewicht zwischen den Zellteilungsraten und der stabilen mRNA-Synthese wieder. Wenn sich die Zellteilungsrate vermindert (stationäre Phase), werden stabile mRNA-Moleküle vermutlich weiter synthetisiert und in der Zelle akkumuliert. Dieser Mechanismus ermöglicht es den T4-Promotoren, sehr hohe mRNA-Mengen zu etablieren und somit sehr große Proteinmengen zu produzieren.
Obwohl hier vorstehend eine Anzahl von erfindungsgemäßen Ausführungsformen beschrieben sind, ist es ersichtlich, daß die grundlegenden Konstruktionen zur Lieferung weiterer, die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen verwendenden Ausführungsformen verändert werden können. Daher ist klar, daß der Schutzbereich dieser Erfindung nicht durch die bestimmten Ausführungsformen, die hier vorstehend beispielhaft dargestellt wurden, sondern durch die hier angefügten Ansprüche definiert wird.

Claims

1. Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls zur Steuerung der Expression eines Nicht-Bakteriophagen T4-Proteins in großen Ausbeuten in einem prokaryotischen Wirt, wobei das rekombinante DNA-Molekül die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zu 3' Reihenfolge verbundenen Elemente umfaßt: DNA-Sequenz I, DNA-Sequenz X, DNA-Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein

und die DNA-Sequenz X 1 bis 15 Nucleotide umfaßt.

2. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zu 3' Reihenfolge verbundenen Elemente: DNA-Sequenz I, DNA-Sequenz X, DNA- Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein codiert, wobei die DNA-Sequenz I umfaßt:

und die DNA-Sequenz X ausgewählt wird aus

und wobei das rekombinante DNA-Molekül die Expression des Nicht-Bakteriophagen T4-Proteins in großen Ausbeuten in einem Prokaryotischen Wirt steuert.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz X ausgewählt wird aus

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, außerdem umfassend einen Nicht-Bakteriophagen T4-Promotor, wobei das DNA-Molekül die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zu 3' Reihenfolge verbundenen Elemente umfaßt Nicht-Bakteriophagen T4-Promotor, DNA-Sequenz I, DNA-Sequenz X, DNA-Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein codiert.

5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 4, wobei der Promotor ein PL Promotor ist.

6. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, wobei das Nicht-Bakteriophagen T4-Protein menschliches Interleukin 2 oder menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor ist.

7. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, außerdem umfassend eine Transkriptionsterminations-Sequenz, wobei das rekombinante DNA-Molekül die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zu 3' Reihenfolge verbundenen Elemente umfaßt: DNA-Sequenz I, DNA-Sequenz X, DNA- Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein codiert, Transkriptionsterminations-Sequenz

8. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 7, wobei die Transkriptionsterminations-Sequenz der T4-Bakteriophagen-Gen 32-Transkriptionsterminator ist.

9. Prokaryotischer Wirt, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 2 oder 4 bis 8 transformiert ist.

10. Verfahren zur Verbesserung der Expression eines Nicht- Bakteriophagen T4-Proteins, wobei man einen prokaryotischen Wirt züchtet, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, das die Expression eines Nicht- Bakteriophagen T4-Proteins in großen Ausbeuten in einem prokaryotischen Wirt steuern kann, und wobei das rekombinante DNA-Molekül die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zu 3' Reihenfolge verbundenen Elemente umfaßt: DNA-Sequenz I, DNA-Sequenz X, DNA-Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein codiert, wobei die DNA-Sequenz I umfaßt:

und die DNA-Sequenz X 1 bis 15 Nucleotide umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die DNA-Sequenz X ausgewählt wird aus

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das rekombinante DNA- Molekül außerdem einen Nicht-Bakteriophagen T4-Promotor umfaßt, und wobei das rekombinante DNA-Molekül die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zu 3' Reihenfolge verbundenen Elemente umfaßt: Nicht-Bakteriophagen T4-Promotor, DNA-Sequenz I, DNA-Sequenz X, DNA-Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein codiert.

13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Nicht-Bakteriophagen T4-Promotor ein PL-Promotor ist.

14. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Nicht-Bakteriophagen T4-Protein menschliches Interleukin 2 oder menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor ist.

15. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das rekombinante Molekül außerdem eine Transkriptionsterminations-Sequenz umfaßt, und wobei das rekombinante DNA-Molekül die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zur 3' Reihenfolge verbundenen Elemente umfaßt DNA-Sequenz I, DNA-Sequenz X, DNA-Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein codiert, Transkriptionsterminations-Sequenz

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Transkriptionsterminations-Sequenz der T4-Bakteriophagen-Gen 32-Transkriptionsterminator ist.

17. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das rekombinante DNA- Molekül außerdem einen Nicht-Bakteriophagen T4-Promotor umfaßt, und wobei das rekombinante DNA-Molekül die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zu 3' Reihenfolge verbundenen Elemente umfaßt: Nicht- Bakteriophagen T4-Promotor, DNA-Sequenz I, DNA-Sequenz X, DNA-Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein codiert.

18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei der Promotor ein PL- Promotor ist.

19. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Nicht-Bakteriophagen T4-Protein menschliches Interleukin 2 oder menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor ist.

20. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das rekombinante DNA- Molekül außerdem eine Transkriptionsterminations-Sequenz umfaßt, und wobei das rekombinante DNA-Molekül die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zu 3' Reihenfolge verbundenen Elemente umfaßt: DNA-Sequenz 1, DNA-Sequenz X, DNA-Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein codiert, Transkriptionsterminations-Sequenz.

21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Transkriptionsterminations-Sequenz der T4-Bakteriophagen-Gen 32-Transkriptionsterminator ist.

22. Verwendung eines prokaryotischen Wirts für die Expression eines Nicht-Bakteriophagen T4-Proteins in großer Ausbeute, wobei der Wirt mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wird, das die folgenden, funktionell in nachstehender 5' zu 3' Reihenfolge verbundenen Elemente umfaßt: DNA-Sequenz I, DNA-Sequenz X, DNA- Sequenz, die ein Nicht-Bakteriophagen T4-Protein codiert, wobei die DNA-Sequenz I umfaßt:

und die DNA-Sequenz X 1 bis 15 Nucleotide umfaßt.