DE3627743A1 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung von biopolysaccharid-konzentraten mittels kontinuierlicher cross-flow-filtration - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von sterilen Biopolysaccharid-Konzentraten, bei dem eine das Biopolysaccharid enthaltende Fermentationslösung kontinuierlich mittels Cross-Flow-Filtration in einer Membraneinheit bei konstanter Filtrationsrate konzentriert wird. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens und die mit dem Verfahren gewonnenen Biopolysaccharid-Konzentrate.

Biopolysaccharide aus Mikroorganismen haben aufgrund ihrer ausgezeichneten Eigenschaften wie hohe Viskosität, geringe Scher-Anfälligkeit, gute Stabilität gegenüber Salzen und erhöhten Temperaturen und strukturviskoses Verhalten in den letzten Jahren in der Industrie immer mehr an Bedeutung gewonnen.

Die Tabelle 1 enthält eine Liste der zur Zeit technisch eingesetzten Biopolysaccharide. Ein Anwendungsgebiet für die Biopolysaccharide ist die Erdölindustrie und zwar als Zusatz zu den Drill-Lösungen oder zu den Betriebsplatzwässern zum Einpressen in die Lagerstätten für die vermehrte Erdölgewinnung (tertiäre Erdölförderung). Hierbei wird bevorzugt Xanthan eingesetzt.

Ein weiteres Anwendungsgebiet ist der Einsatz als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Lebensmitteln, Farben oder von Kosmetika. Hierfür werden neben Xanthan auch die anderen in der Tabelle 1 genannten Biopolysaccharide eingesetzt. Weiterhin ist noch die Verwendung von Dextran als pharmazeutisches Trägermaterial bekannt.

Wegen der Bedeutung der Biopolysaccharide enthält die Literatur eine Vielzahl von Hinweisen, die sich insbesondere mit der Optimierung der Fermentation befassen.

Nach EP-O 1 30 647 kann Xanthan zur Vermeidung von Aufspaltungen in weniger produzierenden Selektanten nur mit definiertem Medium produziert werden.

EP-O 0 44 659 beschreibt ein Repeated-Draw- and Fill- System, bei dem nach einem Batch-Ansatz ein Rest der Xanthan-Kultur im Fermenter verbleibt und mit frischem Medium für eine erneute Fermentation aufgefüllt wird.

Tabelle 1

Technisch eingesetzte Polysaccharide aus Mikroorganismen

Nach AT 3 73 916 werden während der Anwachsphase essentielle Nährstoffe als wachstumslimitierende Faktoren eingesetzt, während der Produktionsphase werden anschließend die essentiellen Nährstoffe auf den Optimalwert ergänzt und zusätzlich noch das Wachstum regelnde Substanzen zugesetzt.

Nach US 43 11 796 wird während einer kontinuierlichen Kultur von Xanthomonas die Zellzahl erhöht, indem schrittweise wachstumslimitierende Substanzen der umzusetzenden Lösung zugegeben werden.

Nach US 42 18 538 wird die Xanthan-Fermentation in einem 2-Stufen-Prozeß durchgeführt. Zellvermehrung und Xanthan-Produktion sind räumlich auf zwei Reaktoren aufgeteilt.

US 44 07 950 und 44 07 951 beschreiben einen Xanthomonas- Stamm, der auch in kontinuierlicher Kultur nicht degeneriert.

Die Anmeldung GB 0 15 856 beschreibt die Optimierung einer kontinuierlichen Fermentation durch Limitierung von Metallionen.

Bedingt durch die unterschiedlichen Anwendungsgebiete werden auch unterschiedliche Anforderung an die Biopolysaccharide gestellt und zwar insbesondere in Bezug auf Sterilität und Konzentration.

Die Sterilität der Präparate ist eine sehr wichtige Forderung insbesondere für die Anwendung im Bereich der Lebensmittelindustrie. Aber auch in der Erdölindustrie ist die Sterilität eine unabdingbare Forderung, da eine Kontamination mit fremden Mikroorganismen die Verstopfung der Poren im erdölführenden Gestein zur Folge hat.

In vielen Fällen (z. B. Lebensmittelindustrie) ist die mit der Fermentation erhältliche Konzentration der Biopolysaccharide nicht hinreichend. Hierfür wurden bisher durch Fällung und anschließende Trocknung erhaltene Tockenprodukte eingesetzt. Die Trockenprodukte werden vor der Anwendung mit Wasser aufgenommen und auf die jeweils benötigte Konzentration eingestellt.

Nachteilig bei der Herstellung von Trockenprodukten sind die hohen Kosten. So ist z. B. bei der Herstellung von Xanthan-Trockenprodukten das große Wasservolumen nach der Fermentation sehr konstentreibend, da mit einem doppelten Volumen an organischem Lösungsmittel (z. B. Isopropanol oder Methanol) das Xanthan aus der wäßrigen Phase ausgefällt werden muß. Der Verbrauch an organischen Lösungsmitteln bedeutet trotz der teilweisen Wiedergewinnung der Lösungsmittel ein erheblicher Anteil an den Herstellungskosten.

Trockenprodukte können aber nicht überall eignesetzt werden.

So kann z. B. wegen der Strukturveränderung während des Trocknungsprozesses nur Flüssig-Xanthan in der Erdölindustrie eingesetzt werden. Dabei entstehen, wenn die Fermentationslösungen ohne Konzentrierung vom Herstellungsort bis zum Ölfeld transportiert werden müssen, erhebliche Transportkosten. Die Lagerung der Fermentationslösung im Ölfeld in Kesselvolumina, die mindestens denen der Fermentervolumina entsprechen müssen, bedarf erhöhter Investitionskosten.

Die Sterilhaltung der gesamten Transportkette: Fermentation, Transport, Lagerung im Ölfeld, Konditionierung vor dem Einpressen in die Lagerstätte, erfordert bei den benötigten großen Volumina einen erheblichen Aufwand.

Sehr häufig kommt es auch zum "Miteinander-Verklumpen" der Xanthomonas-Zellen nach der log. Phase und während der Konzentrierungs- und Fällungsschritte. Dadurch wird die Injizierbarkeit der so gewonnenen Lösung drastisch durch Verstopfen der Poren reduziert.

Beschriebene Verfahren zur Konzentrierung von Xanthan arbeiten nicht unter sterilen Bedingungen, die Konzentrierung erfolgt durch viele Umpump-Schritte, die zeit- und damit kostenaufwendig sind. Durch die langen Verweilzeiten außerhalb des sterilen Bereiches ist die Gefahr von Kontaminationen, die später das Ölfeld blockieren oder zu Sperrungen für den Nahrungsmittelbereich führen würden, sehr groß.

In der EP 00 69 523 wird nun ein Verfahren der Konzentratherstellung mit Hilfe der Cross-Flow-Filtration beschrieben. Das dort geschilderte Verfahren ist ein sogenanntes "Batch-Verfahren". Dabei wird die Fermentationslösung in eine separate Membraneinheit gegeben und dort konzentriert.

Der Nachteil dieses Verfahrens ist, daß durch das Umfüllen die Sterilität des Produktes nicht mehr gewährleistet ist. Außerdem bringt dieses Verfahren, relativ schlechte Resultate. So wird im Beispiel 1 eine Konzentrierung beschrieben, bei der nach 100 Stunden, was etwa 70 Durchläufen durch die Membraneinheit entspricht, eine Konzentrierung nur um den Faktor 2,8 erreicht wird. Gleichzeitig stieg die Viskosität nur um etwa den Faktor 2 an, was auf Schädigung (Qualitätsminderung) des Xanthans während des Prozesses schließen läßt. Im Beispiel 2 konnte durch eine leichte Erhöhung der Temperatur und Verdoppelung des Drucks auf 18,5-20 bar der Zeitbedarf für die Konzentrierung gesenkt werden. Der Konzentrierungsfaktor in diesem Beispiel beträgt etwa 3,0 bei einer gleichzeitigen relativen Verschlechterung der Viskosität (wie Beispiel 1).

Bemerkenswert ist am Beispiel 2 noch, daß während der Konzentrierung die Durchflußrate durch die Membraneinheit um fast 60% abfällt. Im Beispiel 5 beträgt der Abfall der Flußrate sogar über 90%. Der Abfall der Flußrate deutet auf Verstopfungen in der Membraneinheit hin.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man sehr leicht sterile und auch hochviskose Biopolysaccharidkonzentrate erhält, wenn man eine Fermentationslösung kontinuierlich mittels Cross-Flow-Filtration in einer Membraneinheit bei konstanter Filtrationsrate konzentriert. Die Konzentrierung erfolgt in einem einmaligen Durchlauf durch die Membraneinheit. Bevorzugt erfolgt die Konzentrierung bei einer Temperatur von 40°C bis ca. 80°C. Eine Temperatur von 50°C bis 70°C ist besonders bevorzugt. Die Zuführung der Fermentationslösung erfolgt am besten aus einer kontinuierlichen Fermentation wobei der Fermenter ebenfalls kontinuierlich mit sterilisierter Nährlösung gespeist wird. Die Konzentrierungsrate ist wenigstens 2fach, kann aber problemlos je nach Bedarf auf das 5- bis 7fache oder noch mehr gesteigert werden.

Geeignet ist das Verfahren zur Herstellung von Konzentraten der Biopolysaccharide aus der Gruppe Xanthan, Alginat, Curdlan, Scleroglucan, Pullulan und Dextran. Bevorzugt wird das Verfahren zur Herstellung von Xanthankonzentraten, wobei das Xanthan durch Fermentation von Xanthomonas campestris gewonnen wird. Bevorzugt eingesetzt werden dabei Mutanten oder Selektanten von Xanthomonas campestris. Ganz besonders bevorzugt ist Xanthomonas campestris, der unter der Bezeichnung DSM 3806 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Griesebachstraße 8 in D-3400 Göttingen, hinterlegt wurde.

Die Fermentation erfolgt bevorzugt ohne den Zusatz von Antischaummittel, da diese zur Abnahme der Filtrationsleistung der Membraneinheit führen können. In einem solchen Fall erfolgt die Abtrennung des Schaums durch eine Antischaumzentrifuge.

Die Fermentationslösung die der Membraneinheit zur Konzentrierung zugeführt wird, besitzt üblicherweise eine Viskosität von mehr als 10 000 cps. Viskositäten von 15 000 bis 20 000 cps gelten als bevorzugt. Das nach der Konzentrierung erhaltene Produkt besitzt eine Viskosität von wenigstens 20 cps. Viskositäten beim Produkt von 80 000 cps sind bevorzugt. Es sind aber auch Viskositäten von mehr als 100 000 cps erhältlich.

Für verschiedene Anwendungen kann sich die Notwendigkeit ergeben, daß dem Konzentrat noch ein Biozid zur Verbesserung der Lagerfähigkeit zugesetzt werden muß. Die Zugabe des Biocids erfolgt normalerweise nach der Konzentrierung in einem der Membraneinheit nachgeschalteten Mischer, wobei statische Mischer bevorzugt eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es leicht und unter sterilen Bedingungen Biopolysaccharid-Konzentrate herzustellen die anschließend stabilisiert werden können, so daß die Lagerung und der Transport der konzentrierten Lösungen unter sterilen Bedingungen kein Problem mehr darstellt. Die so erhaltenen Konzentrate ändern sich in ihren physikalischen Eigenschaften nicht, d. h., sie sind nach Verdünnung ohne Verstopfung der Poren im Ölgestein direkt injizierbar.

Überraschenderweise wurde zusätzlich gefunden, daß auch die Xanthomonas-Zellen während der Konzentrierung und der anschließenden Lagerung bzw. bei dem Transport nicht mehr aneinanderlagern und somit die Filtereigenschaften nicht beeinträchtigt werden. Die Zellen bleiben als Einzelzellen im Konzentrat und können ohne Anstieg des Injektionsdrucks im Ölfeld eingepreßt werden.

Die Konzentrierung Biopolysaccharidlösungen mit Hilfe der Cross-Flow-Filtration wird vorteilhaft in einem Schritt durchgeführt. Dabei wird der mittlere Transmembrandruck so gewählt (ca. 2-6 bar), daß der gesamte Abtrennungsprozeß in einer Stufe erfolgt und somit eine Rückführung der vorkonzentrierten Lösung nicht nötig ist. Durch hohen Druck und große Fließgeschwindigkeit im Filtermodul wird erreicht, daß eine Konzentrierung z. B. um den Faktor 5 in einer Stufe erfolgen kann. Die dabei angewendete Temperatur liegt vorteilhaft bei 50°C. Dieses erhöht die Filtrationsgeschwindigkeit, und gleichzeitig wird die Kontaminationsgefahr erniedrigt, da nicht sehr viele Mikroorganismen bei diesen Temperaturen sich vermehren können.

Um eine bessere Durchmischung und damit Produktion von Xanthan mit gleicher Molekülstruktur zu erhalten, erfolgt die kontinuierliche Fermentation erfindungsgemäß, mit vergrößerten axial wirkenden Rührern, z. B. vom Typ Ekato-Intermig, mit einem Durchmesser von 0,7-0,8 des Fermenterdurchmessers.

Der gesamte Prozeß, von der Vorbereitung der Nährlösung über Sterilisation der Nährlösung, Fermentation, Erhitzung auf 50°C, Konzentrierung mit Hilfe der Cross- Flow-Filtration, Kontitionierung mit Stabilisierungsmittel, läßt sich vorteilhaft in einer fest miteinander verrohrten Kompakteinheit durchführen. Dadurch ist eine hohe Sicherheit in der Prozeßführung gewonnen, die es erlaubt, in kurzer Zeit auch unter die Fermentation ungünstigen Bedingungen überall die Produktion von Xanthan-Konzentrat durchzuführen. In einer solchen Kompakteinheit können auch rekombinante (genetisch manipulierte) Mikroorganismen zum Einsatz kommen.

Die Bereitstellung von Konzentration führt auch zu wesentlich geringeren Kosten bei der Herstellung von Trockenprodukten durch die Einsparung von Lösungsmitteln für die Fällung.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung eines sterilen Biopolysaccharid- Konzentrats durch kontinuierliche Fermentation und anschließend kontinuierliche Konzentrierung der Fermentationslösung in einer steril geführten Kompakteinheit. Die steril geführte Kompakteinheit ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einem steril führbaren Reaktorsystem

• a) in einem Medium-Tank die Fermentations-Nährlösung ansetzt,
• b) die Nährlösung in einem Wärme-Austauscher-System kontinuierlich sterilisiert,
• c) durch kontinuierliche Fermentation eines Biopolysaccharid bildenden Mikroorganismus in einem sterilen Bioreaktor mit vergrößertem, axial wirkendem Mischer eine Biopolysaccharid-Lösung herstellt, wobei Wachstum und Biopolysaccharid- Bildung parallel erfolgen,
• d) die Biopolysaccharid-Lösung mit Hilfe der Cross- Flow-Filtration kontinuierlich bei erhöhter Temperatur konzentriert,
• e) und gegebenenfalls dem Konzentrat mittels eines statischen Mischers ein stabilisierendes Agent (Biocid) zusetzt.

Bevorzugtes Biopolysaccharid in diesem Verfahren ist das Xanthan.

Xanthan enthält Glucose, Mannose, Glucuronsäure, Acylreste und acetalverknüpftes Pyruvat. Es gehört zu einer Vielzahl von Biopolymeren, die seit längerer Zeit für den technischen Einsatz optimiert werden und auch bereits breite Anwendung finden (Tabelle 1).

Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Herstellung eines sterilen, hochviskosen Biopolysaccharid- Konzentrates bestehend aus einer fest verschweißten Kompakteinheit, beinhaltend (Vergleiche Zeichnung 4):

• - einen Mediumtank (1)
• - eine kontinuierliche Sterilisationsanlage (2)
• - eine unten gerührte Fermentationseinheit (3)
• - einen kontinuierlich arbeitenden Wärmeaustauscher (4)
• - eine kontinuierlich betriebene Cross-Flow-Membraneinheit (5) und gegebenenfalls
• - einen kontinuierlich gefahrenen statischen Mischer (6)

Vor Beginn der Herstellung des sterilen, hochviskosen Biopolysaccharid-Konzentrates in dem integrierten System wird die fest verschweißte Kompakteinheit als Gesamtanlage sterilisiert.

Bevorzugt eingesetzt wird die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Herstellung von Xanthan-Konzentraten.

Die einzelnen Teile des Reaktorsystems sind fest über Rohre miteinander verbunden. Bevorzugt ist die Verbindung durch verschweißen, weil dadurch die Sterilität des Reaktorsystems am besten zu gewährleisten ist.

Wenn notwendig kann das Reaktorsystem noch eine Antischauzentrifuge enthalten.

Es ist vorteilhaft, wenn die kontinuierliche Fermentation zur Bildung einer stabilen, homogenen Xanthan- Lösung unter Verwendung eines Axial-Rührsystems mit vergrößertem Rührdurchmesser durchgeführt wird.

Durch die vorliegende Erfindung ist es möglich die Biopolysaccharidkonzentrate direkt beim Anwender in der jeweilig benötigten Konzentration herzustellen. Die Konzentrate können dann direkt im Herstellungsprozeß für Lebensmittel, Farben usw. eingesetzt werden. Es fallen keine Kosten mehr für Lagerung und Transport der Biopolysaccharide mehr an. Weiterhin ergibt sich die Möglichkeit das Reaktorsystem in einem transportablen Container einzubauen. Ein solcher Container wird dann zu Beispiel zu einem Ölfeld gebracht, wo dann die Biopolysaccharide in den gewünschten Mengen und Konzentrationen vor Ort produziert werden.

Beispiel 1

Von einer Abimpfung des Stammes Xanthomonas campestris Ko 19/23 (DSM 3806) werden Zellen mit der Impflösung von einer Arbeitskonserve in einem 1-l-Erlenmeyerkolben mit 200 ml Vorkultur-Nährlösung übertragen. Die Vorkultur- Nährlösung besteht aus: Hefeextrakt (0,3%), Bacto- Pepton Difco (0,5%), Malzextrakt Difo (0,3%), Leitungswasser, pH=7,0 mit KOH eingestellt, 20 Minuten bei 121°C im Autoklaven sterilisiert; nach Abkühlen werden 10 ml einer fünfprozentigen sterilen Glucose- Lösung zugesetzt.

20 Kolben mit Xanthomonas campestris werden über Nacht auf der Schüttelmaschine bebrütet und nach 18 Stunden von der Schüttelmaschine auf einen 300 l-Fermenter (200 l Arbeitsvolumen) übertragen. Die Nährlösung besteht aus Hefeextrakt 0,8%, Saccharose 5%, Glutaminsäure 0,2%, Desmophen 40 ml. Der pH-Wert wird mit 45%iger NaOH-Lösung auf 6,5 eingestellt. Der Sterilisation wird 30 Minuten bei 121°C durchgeführt. Die Fermentationsbedingungen sind: Temperatur 28°C, Belüftungsrate 0,5 vvm, Rührung 800 Upm, Druck 0,2 bar Überdruck, Laufzeit 50 Stunden. Nach dieser Zeit beträgt die Viskosität 18 000 cps (cps=Centipoise; Viskosität).

Für die Konzentrierung der Xanthan-Kulturlösung bei 50°C wird das Pellicon-System, ein spiralförmig gewickeltes Ultrafiltrationsmodul der Fa. Millipore, eingesetzt. Es ist so konstruiert, daß mehrere Ultrafiltrationsmembranen alternierend mit Kunststoff-Separatoren konzentrisch um einen hohlen Kern gewickelt sind. Das Produkt fließt am oberen Ende in das Modul, strömt tangential abwärts, parallel zur Modulachse. Diese Konfiguration besitzt breite freie Kanäle, so daß die Fließraten sehr hoch gehalten werden können. Als Filtermaterial werden 4,6 m² Polysulfon mit einer Ausschlußgrenze von 100 000 MG eingesetzt. Das Ergebnis ist in Fig. 1 wiedergegeben. Bis zu einer fünffachen Konzentrierung ist keine Abnahme der Konzentrierungsgeschwindigkeit (Flußrate) zu beobachten.

Beispiel 2

Die Anzucht der Xanthanlösung erfolgt wie im Beispiel 1. Die Viskosität der Kulturlösung beträgt nach 55 Stunden 20 000 CPS.

Für die Konzentrierung der Xanthan-Kulturlösung bei 50°C wird das Millipore-Kassettensystem Prostak mit einer Durapore-Membran (Polyvinylidendifluorid; 0,2 µm, 0,83 m²) eingesetzt. Die Ultrafiltrationseinheit wird ohne Vorfilter betrieben. Membran und Gerät werden vor dem Gebrauch bei 121°C über 30 Minuten sterilisiert. Die Fließgeschwindigkeit durch die Membran während der Konzentrierung bleibt mit etwa 35 l/m² · h auch bei einem hohen Eindickungsgrad um den Faktor 5 konstant.

Beispiel 3

Die Anzucht der Xanthanlösung erfolgt wie in den Beispielen 1 und 2. Die Viskosität der Xanthanlösung vor Beginn der Konzentrierung beträgt 19 600 cps. Für die Konzentrierungsversuche bei unterschiedlichen Temperaturen wird das Pellicon-System, wie im Versuch 1, eingesetzt.

Um den Einfluß der Temperatur auf die Filtrationsleistung auszutesten, wird ein Fermenteransatz mit einer Monopumpe im Kreis durch das Pellicon-Spiralsystem gepumpt und sowohl Permeat als auch Retentat in den Fermenter zurückgegeben, wo beide Flüssigkeiten wieder gleichmäßig gemischt werden.

Der mittlere Transmembrandruck [(P _Eingang - P _Ausgang ) : 2-P _Permeat ] beträgt 3,15 bar (P _Eingang = 6,7; P _Ausgang = 0,4; P _Permeat = 0), so daß der Konzentrierungsfaktor nach einmaligem Umpumpen 5 beträgt, d. h. 80% der Eingangslösung werden als Permeat abgegeben, 20% als Konzentrat. Die Temperatur im Fermenter wird auf 30°C eingestellt und der Filtrationsversuch bei dieser Temperatur durchgeführt. In diesem Versuch beträgt die Filtrationsrate 24 l/m² · h. Anschließend wird die Temperatur in der Membraneinheit auf 35°C erhöht und erneut die Filtrationsrate bestimmt. Sie ist auf 25 l/m² gestiegen. Der nächste Versuch wird bei 40°C durchgeführt. Als Ergebnis steigt die Filtrationsleistung auf 26 l/m² · h. Bei 45°C wird eine Filtrationsleistung von 28 l/m² · h, bei 50°C eine Filtrationsleistung von 39 l/m² · h und bei 55°C eine Filtrationsleistung von 40 l/m² · h erreicht (vgl. Fig. 2).

Beispiel 4

Die Herstellung des sterilen, hochviskosen Xanthan- Konzentrates erfolgt in einem integrierten System, bestehend aus einer fest verschweißten Kompakteinheit, beinhaltend: (Vergleiche Zeichnung 4)

• - einen Mediumtank (1)
• - eine kontinuierliche Sterilisationsanlage (2)
• - eine unten gerührte Fermentationseinheit (3)
• - einen kontinuierlich arbeitenden Wärmeaustauscher (4)
• - eine kontinuierlich betriebene Cross-Flow-Membraneinheit (5) und
• - einen kontinuierlich gefahrenen statischen Mischer (6)

Vor Beginn der Herstellung des sterilen, hochviskosen Xanthan-Konzentrates in dem integrierten System wird die fest verschweißte Kompakteinheit als Gesamtanlage sterilisiert.

Dabei wird die kontinuierliche Sterilisationsanlage (2) mit einer Wasserfüllung in der Produktleitung mit 5 bar- Dampf bei 140°C sterilisiert. Die gleichzeitige Sterilisation der übrigen Anlagenteile 3, 4, 5 und 6 erfolgt mit 1,4 bar-Dampf bei 120°C. Dabei fließt der Dampf von der Fermentations-Echtheit (3) zum Wärmeaustauscher der kontinuierlichen Sterilisationsanlage (2 c) sowie über die Produktleitung durch den kontinuierlich arbeitenden Wärmeaustauscher (4), die kontinuierlich betriebene Cross-Flow-Membraneinheit (5) und den kontinuierlich gefahrenen statischen Mischer (6). Die Sterilisationszeit für alle Anlagen-Teile der Kompakteinheit beträgt 60 Minuten.

Die Impfgutanzucht erfolgt wie im Beispiel 1. Der Impfgutkolben wird 24 Stunden bei 28°C auf der Schüttelmaschine bei 290 Upm bebrütet, 20 Kolben der Vorkultur dienen als Impfgut für den 300 l Fermenter.

Die Nährlösung für die Produktion, bestehend aus Hefeextrakt (0,8%), Saccharose (5,0%), Glutaminsäure (0,2%), pH-Wert 6,5 mit NaOH, wird in einem offenen Kessel angesetzt und kontinuierlich über die kontinuierliche Sterilisationseinheit (Spiralaustauscher für Vorheizen (2 a), Sterilisation (2 b) und Kühlen (2 c) für 60 sec bei 140°C sterilisiert: Im Vorheizer wird mit bereits steriler Nährlösung auf 70°C vorgeheizt (Wärmerückgewinnung beträgt 80%). Im Sterilisator wird indirekt mit 5-bar-Dampf auf 140°C aufgeheizt. Die zu sterilisierende Nährlösung durchfließt die Heißhaltestrecke für 60 sec, und wird im ersten Austauscher vorgekühlt. Eine Temperatursonde am Ende der Heißhaltestrecke und eine Abschaltautomatik sorgen dafür daß bei Abfall der Temperatur innerhalb des Systems die Nährlösung nicht in den Fermenter gepumpt, sondern im Kreis gefahren wird.

Im letzten Austauscher wird mit Kaltwasser die vorgekühlte Nährlösung auf Arbeitstemperatur (28°C) vorgekühlt. Anschließend wird die Nährlösung in verschweißten Leitungen direkt dem Fermenter zugeführt. Eintritt der Nährlösung in den Fermenter ist unterhalb des untersten vergrößerten axial wirkenden Intermig-Rührers.

Nach Befüllen des Fermenters mit 200 l Nährlösung wird die Zuführung vorerst gestoppt und der Batch-Ansatz von der Schüttelmaschine beimpft.

Nach Beimpfen des Fermenters werden folgende Bedingungen eingehalten: 800 Upm Rührung, 100 l/min Belüftungsrate, 0,2 bar Überdruck, 28°C Temperatur. Eine Antischaumzentrifuge (3 a) vom Typ Ekato mit 900 Upm Umlaufgeschwindigkeit zerstört in dieser Phase den Schaum.

56 Stunden nach Beimpfung wird eine optimale Viskosität von 20 000 cps erzielt und das Verfahren auf kontinuierliche Fermentation umgestellt, indem über die kontinuierliche Sterilisationseinheit 5 l/h sterile Nährlösung unterhalb des untersten Rührers zugegeben und gleichzeitig über eine Pumpe von der Oberfläche 5 l/h Xanthan- Lösung abgezogen werden. Nach einer Adaptionszeit von 40 h ist die Viskosität der abfließenden Kulturlösung konstant, die Zellzahl ist konstant, die Abgaswerte sind konstant, d. h., die Kultur ist im Steady State. Fig. 3 zeigt den Xanthan-Gehalt der abgezogenen Kulturlösung.

Die aus dem Bioreaktor mittels einer Monopumpe abgezogene Xanthanlösung wird in einem Wärmeaustauscher mit Heißwasser auf 50°C erhitzt und über ein Pellicon- System der Firma Millipore konzentriert. Das spiralförmig gewickelte Ultrafiltrationsmodul hat eine 1,0 m² Polysulfon-Membran mit einer Ausschlußgrenze von 100 000 MG. Mit einem mittleren Transmembrandruck von 4,5 bar [(P _Eingang + P _Ausgang ) : 2-P _Permeat ] werden in einer Stufe die 5 l/h auf ca. 1 l/h konzentriert. Das Permeat verläßt das System, während das sterile, hochviskose Xanthan-Konzentrat über einen statischen Mischer mit Formalin vermischt wird, so daß eine Xanthanlösung mit 1% Formalin stabilisiert und mit einem Gehalt von 6,2% die Kompakteinheit verläßt. Dieses Xanthan-Konzentrat kann z. B. in sterile Container direkt abgefüllt und unter sterilen Bedingungen transportiert, gelagert (bei Zimmertemperatur) und weiterverarbeitet werden. Die kontinuierliche Fermentation und die kontinuierliche Cross-Flow-Filtration laufen 600 Stunden im Steady State ohne Kontamination und ohne Unterbrechung für Reinigungsarbeiten.

Das so hergestellte Xanthan-Konzentrat hat eine Viskosität von 100 000 cps. Der Xanthangehalt beträgt 8,1%, gemessen als Isopropanol-Xanthan-Präzipitat. Sowohl die zweiprozentige Xanthan-Lösung nach der Fermentation wie auch das 8,1%ige Xanthan-Konzentrat nach der Cross- Flow-Filtration sind nach entsprechender Verdünnung ohne Druckanstieg in beliebiger Menge durch ein 1,2 µm Membranfilter (Schleicher & Schüll) filtrierbar, was beweist, daß die Struktur des Xanthans sich bei der Konzentrierung nicht verändert hat.

Beispiel 5

Die Vorkultur, die kontinuierliche Sterilisation der Nährlösung und das Anfahren der Kultur erfolgen wie im Beispiel 4. Nach 60 Stunden Laufzeit wird dann in zwei Schritten die Verdünnungsrate von 0,025 h^-1 (5 l/h Austauschrate) auf 0,05 h^-1 (10 l/h Austauschrate) erhöht. Nach weiteren 20 Stunden wird erneut das Steady State erreicht.

Die Konzentrierung erfolgt in diesem Beispiel mit einem Millipore-Kassettensystem Prostak mit einer Durapore- Membran (Polyvinylidendifluorid, 0,2 µm). Es wird 300 Stunden kontinuierlich eine 4,5%ige Formalin-stabilisierte Xanthan-Lösung produziert, ohne Kontamination und ohne Unterbrechung für Reinigungsarbeiten.

Claims (10)

1. Verfahren zur Herstellung eines sterilen Biopolysaccharid- Konzentrats, dadurch gekennzeichnet, daß man eine das Biopolysaccharid enthaltende Fermentationslösung kontinuierlich mittels Cross-Flow- Filtration in einer Membraneinheit bei konstanter Filtrationsrate konzentriert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1 wobei die Konzentrierung oberhalb 40°C erfolgt.

3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 und 2 bei dem die Konzentrierung der Fermentationslösung bei einem einmaligen Durchlauf durch die Membraneinheit wenigstens 2fach ist.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung von Konzentraten von Biopolysacchariden aus der Gruppe Xanthan, Alignat, Curdlan, Scleroglucan, Pullulan und Dextran.

5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Herstellung von Xanthan-Konzentraten aus Fermentationslösungen von Xanthomonas campestris.

6. Sterile Biopolysaccharid-Konzentrate hergestellt mit dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5.

7. Steriles Xanthan-Konzentrat hergestellt mit dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5.

8. Verwendung der Biopolysaccharid-Konzentrate nach den Ansprüchen 6 und 7 in der tärtiären Erdölförderung, als Verdickungsmittel oder Trägermaterial in der Lebensmittel-, Farben- und der Pharmazeutischen- Industrie oder zur Herstellung von Biopolysaccharid-Trockenprodukten.

9. Vorrichtung zur Herstellung eines sterilen, hochviskosen Biopolysaccharid-Konzentrates bestehend aus einer fest verschweißten Kompakteinheit, beinhaltend:

• - einen Mediumtank (1)
• - eine kontinuierliche Sterilisationsanlage (2)
• - eine unten gerührte Fermentationseinheit (3)
• - einen kontinuierlich arbeitenden Wärmeaustauscher (4)
• - eine kontinuierlich betriebene Cross-Flow- Membraneinheit (5) und gegebenenfalls
• - einen kontinuierlich gefahrenen statischen Mischer (6).

10. Vorrichtung nach Anspruch 9 zur Herstellung von Xanthan-Konzentraten.