DE3621127C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrich­ tung zur Beurteilung des morphologischen Zustandes sowie des Fermentationsfortschrittes agglomerierender Biosus­ pensionen.

Die Suche nach neuen, durch Biosynthese hergestellten Wirkstoffen erscheint für solche Systeme besonders aus­ sichtsreich, die bisher weniger intensiv überprüft wur­ den. Ein Grund für das hier weniger intensive screening solcher Systeme dürfte auch mit in den Schwierigkeiten liegen, die mit der Fermentation einiger dieser potenti­ ellen Wirkstofflieferanten verbunden sind. So können manche perfekten und imperfekten Pilze zwar noch im Schüttelkolben bis zum Einsetzen der Wirkstoffproduktion fermentiert werden. Sie erweisen sich jedoch als sehr scherempfindlich, und die rheologischen Eigenschaften dieser Suspensionen verändern sich mit dem Fermenta­ tionsfortschritt teilweise extrem in Richtung eines Gel-ähnlichen Zustandes analog dem Bingham-Bereich nicht-Newton′scher Fluide. So gelingt es mitunter noch nicht einmal, einige der als interessant befundenen Spe­ zies zur Gewinnung von Bemusterungsproben auch im Tech­ nikumsfermenter bis zur Wirkstoffproduktion genügend ungeschädigt zu züchten. Bei zu wenig Durchmischung der Suspension bilden sich zwar die für den Beginn einer Wirkstoffproduktion günstigen Zellagglomerate, dann sind jedoch die Versorgung bzw. die Entsorgung der Zellen an­ scheinend zu schlecht. Bei intensiverer Durchmischung ist zwar die Nährstoffversorgung und die Abfuhr von Me­ taboliten ausreichend, es setzt jedoch oft keine Wirk­ stoffproduktion ein, weil die Agglomerate mechanisch sehr stark belastet und offensichtlich damit auch zu sehr geschädigt werden.

Bei der Fermentation von agglomerierenden und/oder Hy­ phen-bildenden Biosuspensionen in technischem Maßstab ist es oft schwierig, allein mit Hilfe der durch Analy­ sen bestimmten Konzentrationswerten eine optimale Pro­ zeßführung zu erreichen. Wachstum und insbesondere die Produktion von Wirkstoffen hängen auch vom morphologi­ schen Zustand des Biosystems ab, z. B. in welchem Aus­ maß Agglomerate gebildet/zerstört werden, oder welche Bindungsmechanismen sich zwischen den einzelnen Agglo­ meraten ausbilden können.

Zur Beurteilung des Fermentationsfortschrittes bzw. des Auftretens von Störungen erscheint es daher nicht nur wünschenswert, die Konzentration von Nährstoffen, Metaboliten oder Sauerstoff zu messen, sondern auch den morphologischen Zustand der Agglomerate beurtei­ len zu können, d. h. einen aussagefähigen Maßstab für den Suspensionszustand zu haben. Dies gilt sowohl für den Technikumsmaßstab wie für die technische Anwen­ dung. Ferner würde so auch das scale-up bei der Ein­ führung neuer Produktionen oder Verfahren erleichtert.

Manche Biosuspensionen, so auch die hier erwähnten Pilzsuspensionen werden bei der Fermentation vollkom­ men undurchsichtig, so daß alle optischen Beurtei­ lungsmöglichkeiten entfallen. Da die Agglomerate bis zu einigen Millimetern groß werden, sind normale Viskosimeter zur Beurteilung der rheologischen bzw. morphologischen Eigenschaften der Agglomerate nicht geeignet. Hinzu kommt, daß bei den normalen Viskosi­ metern mit ihren relativ kleinen Abmessungen, bezogen auf die Festigkeitseigenschaften der Bioagglomerate ziemlich große Scherspannungsgefälle erzeugt werden müssen, um in den zähen Suspensionen zum Messen aus­ reichende Scherkräfte zu erzeugen.

Die europäische Patentschrift E P 00 36 801 B 1 be­ schreibt ein Gerät zum automatischen essen der Vis­ kosität von Flüssigkeiten, insbesondere von Suspen­ sionen wie Blut. Es enthält ein Viskosimeterrohr, das in einer geneigten Lage gehalten wird und eine Kugel einschließt. Über die Falldauer der Kugel wird die Viskosität bestimmt. Dieses Gerät ist nicht ge­ eignet, die morphologischen Eigenschaften von Bio­ suspensionen zu beurteilen, da mit der einen Kugel weder das Nichtmehreinsinken, noch die unterschied­ lichen Sinkgeschwindigkeiten geometrisch gleicher, unterschiedlich schwerer Fallkorper in ein und der­ selben Probe bestimmt werden können.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein nicht-optisches Verfahren sowie eine Vorrichtung an­ zugeben, mit denen Änderungen der Agglomerateigen­ schaften in nicht-durchsichtigen Biosuspensionen durch Messung des morphologischen Verhaltens des Gesamt­ systems: Substrat + agglomerierende Kultur unter ste­ rilen Bedingungen, d. h. mit der Möglichkeit, die Probe in den Fermenter zurückzugeben, über die gesamte Fer­ mentationsdauer erfaßt werden können.

Es reicht ein vergleichendes Meßverfahren aus, wenn die Meßdaten ausreichend reproduzierbar sind und nicht zu stark von anderen Parametern beeinflußt werden.

Diese Aufgabe wird durch das in Anspruch 1 gekennzeich­ nete Verfahren bzw. die in Anspruch 5 gekennzeichnete Vorrichtung gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Fig. 1-3 und anhand eines in Fig. 3 dargestellten Ausführungs­ beispiels näher erläutert.

Es wurde gefunden, daß die morphologischen Eigenschaf­ ten agglomerierender Biosuspensionen durch das Bestim­ men der Sinkgeschwindigkeit bzw. des Nichtmehreinsin­ kens von Fallkörpern gleicher Abmessung, jedoch unter­ schiedlichen Verhältnisses Φ von Sinkkörperdichte zur Dichte der Suspension beurteilt werden können. Dabei sind die Abmessungen des Fallkörpers und des Spaltes zwischen Körper und Meßgefäßwand so zu wählen, daß die vom Fallkörper verdrängten Agglomerate eine möglichst deutliche Kraftwirkung auf die Agglomerate im Spalt ausüben, daß sich jedoch eine dem Zustand im Fermenter noch ausreichend ähnliche Agglomeratstruktur erhalten kann, d.h. die Spaltweiten sollen etwa von der glei­ chen Größenordnung sein wie die sich gegen Fermenta­ tionsende einstellenden Agglomerate aus Biomaterial. Das Verhältnis Φ der Dichte des Fallkörpers ρ zu der Dichte der Biosuspension p ⁰ kann dabei von Φ nur wenig < 1 (z. B. 1,01) bis etwa Φ ≈ 3 reichen.

Das Dichteverhältnis Φ, bis zu dem der Fallkörper nicht mehr einsinkt, ist ein Maß für die Größe des rheologi­ schen Bereiches, in dem die Kohäsionskräfte und die von den Agglomeraten aufeinander ausgeübten Kräfte größer als die vom Fallkörper ausgeübten Scherkräfte sind (analog dem Bingham-Bereich der Kontinuumsmechanik für homogene Fluide).

Die Nichtproportionalität der Sinkgeschwindigkeit zum Dichteverhältnis Φ bei schwereren (d. h. einsinkenden) Fallkörpern ist dann ein Maß für die Abweichungen der rheologischen Eigenschaften des Gesamtsystems aus Sub­ strat + Agglomerat + evtl. vorhandener anderer, nicht agglomerierter Partikel von einem Newton′schen Fluid. Dabei macht sich ein Einfluß der Agglomerate besonders im Bereich kleinerer Werte von Φ, d. h. bei kleinen Sinkgeschwindigkeiten bemerkbar, da hier die durch die Agglomerationskräfte gekoppelten Teilchen der Verdrän­ gerströmung noch teilweise auszuweichen vermögen,so daß auch die makroskopische Agglomeratstruktur damit teil­ weise erhalten bleibt. Bei größeren Dichteverhältnissen Φ werden die Sinkgeschwindigkeiten so groß, daß sich dann verstärkt die rheologischen Eigenschaften des Sub­ strats selbst auswirken.

Ein weiteres Beurteilungskriterium für den morphologi­ schen Zustand agglomerierender Biosuspensionen liefert die Bestimmung der Zunahme der Sinkgeschwindigkeit von Fallkörpern gleichen Gewichts bei mehrfacher, rascher Wiederholung der Messung in derselben Suspensionsprobe. In der frisch in das Meßgefäß eingefüllten Probe können sich die kohäsiven Bindungen im Substrat (z. B. durch Polysaccharide) wie auch die zwischen den einzelnen Biopartikeln weitgehend auswirken. Durch die mit dem wiederholten Meßvorgang bewirkten Schervorgänge werden diese als Folge der Kohäsionskräfte erst nach einer gewissen Zeit entstehenden Ordnungszustände gestört, die Sinkgeschwindigkeit steigt.

Wird auch für Fallkörper mit unterschiedlichem Dichte­ verhältnis Φ die Zunahme der Sinkgeschwindigkeit als Folge der Wiederholung des Meßvorganges mit Fallkörpern jeweils gleichen Gewichtes gemessen, so erhält man ein weiteres Beurteilungskriterium über den morphologischen Agglomeratzustand. Eine Zunahme im Bereich kleiner Dichteverhältnisse Φ wird verstärkt durch die Schädi­ gung der Bindungsmechanismen zwischen den Agglomeraten, d.h. durch die Änderung ihres morphologischen Zustandes verursacht. Bei größerem Dichteverhältnis Φ und damit auch größerer Sinkgeschwindigkeit werden sich im wesentlichen nur noch eventuelle Änderungen im Sub­ strat, d. h. im Molekularbereich, auswirken.

Zur besseren Beurteilung von Meßergebnissen mit Hilfe von Diagrammen erscheint es zweckmäßig, nicht die Sink­ geschwindigkeiten, sondern den Kehrwert, d.h. die Fall­ zeiten, aufzutragen. Die Abbildung 1 zeigt die Änderung solcher Fallzeiten in Sekunden Durchlaufzeit/Meter Weg von Fallkörpern unterschiedlichen Dichteverhältnisses Φ bei der Fermentation eines imperfekten Pilzes mit den Parametern: Fermentationsdauer in Tagen sowie jeweils 1. und 5. Messung in derselben Suspensionsprobe in rascher Folge mit gleich schweren Fallkörpern. Abbildung 2 zeigt in Abhängigkeit von der Fermentationsdauer die Änderung des Bereichs des Dichteverhältnisses Φ, in dem die Fallkörper nicht mehr einsinken (analog dem Bingham-Bereich bei homogenen Fluiden) und des Berei­ ches, in dem die Fallkörper mit einer noch gut meß­ baren Geschwindigkeit einsinken. Man erkennt, daß sich aus den Änderungen dieser Meßwerte Beurteilungskrite­ rien für den morphologischen Agglomeratzustand der Sus­ pension ergeben.

Ein weiteres Beurteilungskriterium ist die Abnahme der Sinkgeschwindigkeit eines Fallkörpers mit der Länge des Fallweges, nachdem er die Anlaufstrecke durchlaufen hat, insbesondere wenn mehrere gleichschwere Fallkörper nacheinander durch dieselbe Probe fallen bzw. dann nicht mehr bis zur untersten Meßebene gelangen. Dieser Effekt wird verursacht einmal durch die natürliche Sedimentation von spezifisch schwereren Agglomeraten und zum anderen durch ein Vorsichherschieben bzw. den Mittransport von Agglomeraten in der Schleppströmung durch die Fallkörper. Beide Ursachen sind in ihrem Aus­ maß abhängig von den morphologischen Eigenschaften der Agglomerate.

Es wurde ferner gefunden, daß sich ausreichend reprä­ sentative und reproduzierbare Meßwerte für die Sinkge­ schwindigkeit eines Fallkörpers nur ergeben, wenn die­ ser annähernd koaxial in dem Meßzylinder nach unten sinkt. Mit einer Annäherung an die Wand werden die Kräfteverhältnisse, aus denen die Sinkgeschwindigkeit resultiert, nicht reproduzierbar gestört.

Wegen der Undurchsichtigkeit vieler agglomerierender Biosuspensionen ist für ein allgemein anwendbares Beur­ teilungsverfahren des morphologischen Zustandes nur eine nicht-optische Meßmethode zur Bestimmung der Sink­ geschwindigkeit der Fallkörper anwendbar. Es wurde gefunden, daß für diese Meßaufgabe als Fallkörper Ku­ geln aus nicht magnetisierbarem Material geeignet sind, die durch Verlagerung des Massenschwerpunktes außerhalb des Kugelmittelpunktes (d. h. beim Sinken in der Suspen­ sion unterhalb) am Drehen um eine waagrechte Achse ge­ hindert werden und in deren Mittelebene normal zur Ach­ se Mittelpunkt - Schwerpunkt am Umfang ein magneti­ sierbarer Ring (z. B. Eisendraht) eingebettet ist. Mit Hilfe von Induktionsschleifen, die in die Wand des Meß­ zylinders eingebaut werden, kann dann der Zeitpunkt des Passierens der Mittelebene einer Fallkugel durch diese Zylinderebene als elektro-magnetisches Signal festge­ stellt werden. Die mittlere Sinkgeschwindigkeit der Kugel ergibt sich dann aus der Zeitdifferenz des Durch­ tritts durch zwei Meßquerschnitte vorgegebenen Abstan­ des. Durch Anordnung mehrerer Induktionsschleifen längs des Meßzylinders läßt sich auch die Änderung der mitt­ leren Fallgeschwindigkeit mit der Länge des Fallweges bestimmen.

Zur zuverlässigen und reproduzierbaren Bestimmung des Durchtrittszeitpunktes der Fallkugel durch eine solche Meßebene, ist es ferner erforderlich, daß die Fallkör­ per mit Hilfe einer Leitvorrichtung koaxial geführt werden. Ein koaxialer Stab zur mittigen Führung von mit einer entsprechenden Zentralbohrung versehenen Fallkör­ pern verursacht beim nicht zu vermeidenden Eindringen von Substrat und evtl. auch von kleineren Suspensions­ teilchen in den Spalt zwischen Bohrung und Stab eine zu große Verfälschung der Meßergebnisse. Es wurde gefunden, daß zur genügend genauen koaxialen Führung der Fallkör­ per eine Anordnung von mindestens 3 Längsdrähten, die einen Kreis < dem Fallkörper-⌀ umschreiben, geeignet ist, wobei ihr freier Abstand voneinander jedoch < als der Fallkörper-⌀ sein muß.

Die morphologische Struktur der agglomerierenden Bio­ suspension soll möglichst im gleichen Zustand beur­ teilt werden, wie er auch im Fermenter vorhanden ist. Eine Förderung durch Pumpen über Leitungen oder Dros­ seln würde jedoch leicht zu Strukturänderungen der agglomerierten Teilchen führen. Diese Gefahr wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch vermieden, daß zum Füllen des Meßzylinders mit der zu beur­ teilenden Suspension die untere Öffnung des Zylinders direkt in das Gemisch im Fermenter eingetaucht und daß dann die Suspension mit Hilfe eines Hubkolbens ohne größere Umlenkung oder Drosselung direkt in den Meß­ zylinder hochgesaugt wird.

Agglomerierende Biosuspensionen neigen oft auch stark zur Wandanhaftung. Solche Anhaftungen an den Fallkör­ pern, an den Führungsdrähten oder an der Innenwand des Meßzylinders würden die Sinkgeschwindigkeit der Fall­ körper beeinflussen. Zur Verhinderung dieses Störein­ flusses werden bei dem erfindungsgemäßen Beurteilungs­ verfahren neben der bevorzugten Verwendung nicht netz­ barer Materialoberflächen (z. B. Teflon) die Zylinder­ wand und die Führungsdrähte vor dem Einfüllen frischer Suspension mit Hilfe des oben erwähnten Hubkolbens ab­ gereinigt.

Die Neigung der Biosuspensionen zu Wandanhaftungen kann bis zum vollständigen Überwachsen auch größerer Öffnun­ gen, wie der des Meßzylinders, führen. Um dies zu ver­ meiden, wird daher der Meßzylinder nach Abschluß einer Meßserie ganz aus der Suspension herausgezogen und nach vollständiger Entleerung am unteren Ende von ei­ nem längsverschieblichen Deckel verschlossen. Durch An­ heben dieses Deckels nach dem Einsaugen der Probe wird auch verhindert, daß während der Messung Agglomerate aus dem Meßzylinder nach unten in den Fermenter weg­ sedimentieren können. Letzteres würde insbesondere beim Messen der Abnahme der Sinkgeschwindigkeiten mit der Länge des Fallweges zu Verfälschungen der Ergeb­ nisse führen.

Aus der Art der Messung und insbesondere der der Probe­ nahme ergibt sich die Notwendigkeit, die Apparatur fest im Fermenterdeckel einzubauen. Zur Sicherung der Steri­ lität muß daher die gesamte Apparatur nach außen abgedichtet und dampfsterilierbar sein.

Die Abbildung 3 zeigt eine Ausführungsform der erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung zur on-line Beurteilung der Änderung der morphologischen Eigenschaften der Agglo­ merate einer Biosuspension mit dem Fermentationsfort­ schritt am Beispiel für einen imperfekten Pilz.

Kernstück ist der mit Hilfe des Anpassungsflansches 3 (mit Dichtung 26) vertikal auf dem Fermenterdeckel 1 ausgerichtete Meßzylinder 14, in dem die Fallkugeln 25 nach ihrem Start mit Hilfe des hydraulisch gesteuerten Auslösers 24 aus der aus drei entsprechend geformten Federn bestehenden Kugelhalte- Auslöse- und Wiederein­ sammelvorrichtung 23 in der Biosuspension nach unten bis in die Sammelvorrichtung 30 sinken. Im Meßzylinder 14 werden die Fallkörper 25 dabei von den Führungs­ drähten 11 längs der Mittelachse geführt. Der Zeitpunkt des Durchtritts des (durch Tieferlegen des Fallkörper- Schwerpunktes in der Mittelwaagrechten stabilisierten) Eisenringes einer der Fallkugeln 25 durch einen Meß­ querschnitt des aus nichtmagnetisierbarem Material be­ stehenden Meßzylinders 14 wird mit Hilfe der an dieser Stelle außen am Zylinder 14 angebrachten Induktions­ schleife 27 gemessen.

Die in der Fallkörperhalte- Auslöse- und Wiedereinsam­ melvorrichtung 23 übereinanderliegenden einzelnen Fall­ kugeln 25 mit, je nach Meßprogramm jeweils unterschied­ lichem Gewicht bzw. mit gleichem Gewicht, werden nach­ einander mit Hilfe des vom Hydraulikkolben 20 bewegten Ausstoßers 24 für den einzelnen Meßvorgang ausgelöst.

Im Ruhezustand ist der im Flansch 3 längsverschiebli­ che und über Dichtungsringe 2 gegen den Fermenter sowie durch den elastischen Faltenbalg 5 steril nach außen abgedichtete Doppelmantel, bestehend aus dem Meßzylin­ der 14 und dem Außenrohr 4, die oben fest über die Flanschverbindung 6 und unten längsverschieblich über den Ring 34 mit Dichtung 28 verbunden sind, nach oben gezogen, so daß er nicht in das Fermentationsgemisch eintaucht. Ferner ist im Ruhezustand der im Meßzylinder 14 über die Dichtringe 9 abgedichtete und zugleich ge­ führte Hubkolben 8 durch Anlegen von Unterdruck am Stutzen 17 im oberen Abschlußdeckel 15 nach oben gezo­ gen. Dadurch werden auch die durch den Kolben 14 gehen­ den Drähte 11, die durch die vom untergeschraubten Deckel 22 festgehaltenen Dichtungen 21 gegen den Kolben abgedichtet sind, mit Hilfe der Federn 10 zwischen dem Hubkolben 8 und dem verschieblichen Deckel 12, in dem die Drähte 11 fest verschraubt sind, so weit mit ange­ hoben, daß der unten an den Drähten 11 befestigte Ver­ schluß 30 den Meßzylinder 14 gegen den Fermenterinhalt abschließt. Der Verschluß 30 ist zugleich Sammelvor­ richtung für die bereits durch die Meßstrecke gefalle­ nen Kugeln. Unten im Verschluß 30 ist eine Bohrung 31 angebracht zur vollständigen Entleerung der Meßappara­ tur nach dem Wiedereinsammeln der Fallkugeln mit Hilfe der Vorrichtung 23. Die Bohrung 31 dient auch als Ab­ fluß von Kondensat beim Sterilisieren durch direkte Dampfzufuhr (s. u.).

Die Öffnung 31 ist im Ruhezustand ebenfalls von einer Fallkugel 25 verschlossen, so daß keine Spritzer und kein Schaum aus dem Fermentationsgemisch in den Meß­ zylinder gelangen können. Wie bekannt, können solche Spritzer zu örtlichen Fehlentwicklungen der Fermenta­ tion oder auch zu sehr festen Wandanwachsungen führen.

Zu Beginn eines Meßprogramms werden der Hydraulikkolben 20 mit dem Ausstoßer 24 durch Abzug von Hydraulikflüs­ sigkeit über die zu einer Wendel aufgewickelte Hydrau­ likleitung 16 nach oben gezogen. Anschließend wird der Hubkolben 8 durch Eindrücken von Sterilluft am Stutzen 17 nach unten bewegt. Dabei drückt dann ab einem be­ stimmten Abwärtsweg des Kolbens 8 die im Vergleich zur Gesamthärte aller Federn 10 weichere Feder 13 den Deckel 12 bis zum mit Hilfe von Dichtung 19 nach außen ge­ dichteten Anschlag 18 nach unten. Dadurch wird zugleich der von drei Stiften 32 geführte Verschluß 30 so weit nach unten abgesenkt, daß im folgenden Einsaugevorgang die Agglomerate der in ihren morphologischen Eigen­ schaften zu beurteilenden Biosuspension unter nur sehr geringer Scherbeanspruchung und ohne zusätzliche Um­ lenkungen und damit auch nur mit geringen Änderungen ihres morphologischen Zustandes durch die Öffnung 33 in den Meßzylinder einströmen können. Der Kolben 8 wird dabei bis zum Anschlag 29, der über die Dichtung 28 mitabgedichtet ist, abgesenkt. Hierdurch schieben sich zugleich die drei Federn der Fallkugelhalte-, Auslöse- und Wiedereinsammelvorrichtung 23 bis über die als erste ausgelöste und damit zuunterst in der Sammelvor­ richtung 30 liegende Fallkugel 25. Durch diese Kolben­ bewegung werden zugleich auch die Meßzylinderwand 14 und die Drähte 11 durch die Dichtungen 9 bzw. 21 von evtl. entstanden Belägen abgereinigt.

Nun wird die ganze Doppelmantelanordnung 4-14 abge­ senkt, so daß die Eintrittsöffnung 33 in das Fermenta­ tionsgemisch eintaucht. Anschließend wird der Kolben 8 zusammen mit den Fallkugeln 25 im Halter 23 durch Anle­ gen von Unterdruck am Stutzen 17 nach oben bewegt, so daß die in ihren rheologischen Eigenschaften zu beur­ teilende, agglomerierende Biosuspension in den Meß­ zylinder 14 gesaugt wird. Nachdem der Kolben so weit angehoben ist, daß der Deckel 30 den Meßzylinder 14 unten verschlossen hat, wird zum Start der ersten Ku­ gel 25 der Kolben 20 hydraulisch um einen Fallkugel-⌀ nach unten bewegt, so daß die unterste Kugel aus der Vorrichtung 23 in die Biosuspension fällt. Sodann wer­ den die Durchtrittszeiten dieser Fallkugel 25 durch die verschieden Meßebenen des Zylinders 14 mit Hilfe des elektrischen Signals gemessen, das von dem in jeder Ku­ gel eingebauten und waagrecht stabilisierten Eisenring beim Passieren der in jeder Meßebene angebrachtenden Induktionsschleife 27 ausgelöst wird.

Bei einem Meßprogramm mit einer Serie gleich schwerer Kugeln wird dann unmittelbar anschließend die zweite Kugel gestartet und so fort. Bei einem Meßprogramm mit unterschiedlich schweren Fallkugeln wird nach Eintritt der zuerst gefallenen Kugel in die Sammelvorrichtung 30 die durch diesen Meßvorgang morphologisch möglicherwei­ se veränderte Suspension durch Absenken des Kolbens 8, der ja gekoppelt ist mit dem Absenken des Verschlusses 30, wieder in das Fermentationsgemisch zurückgegeben. Der Kolben 8 wird jedoch nur soweit abgesenkt, daß die Fallkugelhalte-, Auslöse- und Wiedereinsammelvorrich­ tung 23 noch keine der bereits in der Verschluß- und Sammelvorrichtung 30 liegenden Fallkugeln 25 erfaßt. Durch Heben des Kolbens 8 wird dann eine frische, durch einen Meßvorgang morphologisch noch nicht veränderte Probe der Biosuspension aus dem Fermentationsgemisch durch die Öffnung 33 schonend in den Meßzylinder 14 gefördert.

Die Meßleitungen 7 für die Induktionsschleifen 27 sind aus dem unsterilen Ringraum zwischen dem Außenmantel 4 und dem Meßzylinder 14 durch Bohrungen im Flansch 6 nach außen geführt.

Nach Lösen des Flansches 3 vom Fermenterdeckel 1 kann die gesamte Meßeinrichtung durch Öffnen der Verbindun­ gen 6 und 15 sowie nach Zurückdrehen der Anschläge 18 und 29 einfach auseinandergenommen, gereinigt, evtl. mit einer anderen Serie von Fallkugeln 25 bestückt und dann nach Wiederzusammenbau und Aufschrauben auf den Fermenterdeckel 1 im Autoklaven sterilisiert werden. Beim Einbau der Meßeinrichtung in den Deckel eines größeren Fermenters, der durch Zufuhr von Dampf steri­ lisiert wird, müssen noch drei zusätzliche Stutzen 35, 36 und 37 am Meßzylinder 14 angebracht werden. Der Stutzen 35 ist für die Zufuhr von Sterilisierdampf in den Meßzylinder 14 unterhalb des Kolbens 8 bestimmt. Er ist in einer solchen Höhe angebracht, daß bei der höch­ sten Stellung des Kobens 8 der Dampf unmittelbar unter dem Befestigungsdeckel 22 für die Fallkugelhalte-, Aus­ löse- und Wiedereinsammelvorrichtung 23 eintritt. Das beim Sterilisieren anfallende Kondensat fließt dann durch die Öffnung 31 in der Absperrvorrichtung 30 ab. Wegen der Hubbewegung des Kolbens 8 muß auch der Raum oberhalb sterilisiert werden. Dazu werden der Dampf durch den Stutzen 36 zu- und das Kondensat durch den Stutzen 35, der mit der Oberkante des Kolbens 8 in sei­ ner höchsten Stellung abschließt, abgeführt.

Bei der Fermentation von imperfekten Pilzen, die Agglo­ merate von eingen mm Größe bilden, sind z. B. zweckmä­ ßige Abmessungen für die Fallkugeln 20 mm ⌀ und für den Innen-⌀ des Meßzylinders 40 mm, so daß die Spaltweite zwischen dem Fallkörper und der Zylinderwand mit 10 mm von der gleichen Größenordnung ist wie die der Agglome­ rate. Der Mindestabstand zwischen dem obersten und dem untersten Meßquerschnitt im Zylinder 14 soll dann bei 200 mm liegen. Für die Beurteilung des morphologischen Zustandes anders agglomerierender Kulturen oder wenn, insbesondere gegen Ende einer Fermentation, infolge ge­ änderter äußerer Parameter andere Agglomeratgrößen ent­ stehen, ergeben gegebenenfalls andere, zweckmäßigere Abmessungen von Fallkörper- und Zylinder-⌀ bessere Be­ urteilungsmöglichkeiten. Wegen der vielen verschiedenen Parameter, die Einfluß auf die morphologischen Eigen­ schaften der Agglomerate sowie anderer, evtl. im Fer­ mentationsgemisch vorhandener Partikel haben und die damit neben den rheologischen Eigenschaften der kon­ tinuierlichen Phase, d. h. des Substrates, auch einen Einfluß auf die Sinkgeschwindigkeit der Fallkörper ha­ ben, gibt es (noch) keine Regel für die Wahl von zweck­ mäßigen Abmessungen, um optimale Beurteilungskriterien zu erhalten.

Nach oben wird die maximale Länge der Meßstrecke be­ grenzt durch die Handhabbarkeit, durch das im Fermenter zur Verfügung stehende Volumen an Fermentationsgemisch, das ohne Störung des Fermentationsvorganges abgezogen werden kann sowie durch die zur Verfügung stehende Höhe über dem Fermenterdeckel. Wird Teflon oder ein ähn­ liches Material als Werkstoff für den Meßzyinder 14 verwendet, so ist die maximale Höhe der Meßlänge auch von den Anforderungen an die Maß- und Formbeständigkeit des Meßquerschnittes bestimmt, da das Ein- und Aus­ schieben der Biosuspension von der Funktionsfähigkeit und dem Dichtbleiben des Hubkolbens 8 wesentlich ab­ hängt.

Claims (9)

1. Verfahren zur on-line Beurteilung des momentanen morphologischen Zustandes der Agglomerate und des Fermentationsfortschrittes einer Biosuspension dadurch gekennzeichet, daß das Nichtmehreinsinken und/oder die unterschiedlichen Sinkgeschwindigkeiten geome­ trisch gleicher, jedoch unterschiedlich schwerer Fall­ körper in einem Zylinder gemessen werden, der direkt mit dem zu beurteilenden Substrat-Agglomeratgemisch ge­ füllt wird und dessen Abmessungen so gewählt sind, daß die Spaltweite zwischen Fallkörper und Zylinderwand von der gleichen Größenordnung ist wie die sich gegen Fer­ mentationsende ausbildenden Agglomerate des Biomate­ rials.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß in einer Meßserie die Sinkgeschwindigkeiten von mehre­ ren gleich schweren Fallkörpern gemessen werden, die in kurzem zeitlichen Abstand nacheinander in der sel­ ben Suspensionsprobe fallen gelassen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Meßserien mit jeweils unterschiedlichen Gewich­ ten der einzelnen Serie von Fallkörpern sowie mit je­ weils frisch eingefüllter Biosuspension für die Einzel­ serie durchgeführt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß, insbesondere in undurchsichtigen Suspensionen, die Zeitdifferenzen für den Durchgang eines frei in der Suspension absinkenden Fallkörpers durch zwei oder mehrere Zylinderquerschnitte mit jeweils definierten Abständen voneinander elektrisch-induktiv gemessen werden.

5. Vorrichtung zur Durchführung der Verfahren nach Ansprü­ chen 1 bis 4 gekennzeichnet durch

• - einen am Fermenterdeckel befestigten und gegen diesen steril abgedichteten, vorzugsweise vertikal ausgerich­ teten oder geneigten Meßzylinder, der in einer Führung mit Abdichtung so weit längsverschieblich ist, daß die normalerweise außerhalb der Suspension befindliche un­ tere Öffnung des Zylinders in die Suspension eintaucht und an dem unterhalb der Meßstrecke eine Auffangvor­ richtung für die Fallkörper angebracht ist und
• - einen in dem Meßzylinder längsbeweglichen und an sei­ ner Zylinderfläche mit Dichtungen versehenen Kolben, durch dessen aufwärts gerichteten Hub nach Absenken des Meßzylinders in die Suspension frische Suspension eingesaugt und durch dessen Abwärtsbewegung nach Be­ endigung des Meßvorgangs die Suspension wieder aus­ gestoßen wird, wobei dieser Vorgang mit einer Abreini­ gung der Meßzylinderwand von evtl. anhaftenden Teil­ chen der agglomerierenden Suspension verbunden ist, sowie ferner
• - einer Halte-, Auslöse- und Wiedereinsammelvorrich­ tung für alle zu einem Meßvorgang benötigten Fallkör­ per, die zumindest mit dem Wiedereinsammelvorrich­ tungsteil soweit längsverschieblich ist, daß alle Fallkörper oberhalb der Meßstrecke im Meßzylinder festgehalten und nacheinander koaxial ausgelöst wer­ den und daß alle Fallkörper aus der Auffangvorrich­ tung unterhalb der Meßstrecke eingesammelt und wieder nach oben gehoben werden können.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5 gekennzeichnet durch

• - mindestens 3 im Meßzylinder gleichmäßig auf einem ko­ axialen Kreis mit einem inneren ⌀< dem ⌀ der Fall­ körper angeordnete Drähte, die gedichtet durch den Hubkolben führen, bei der Hubbewegung durch diese Dichtungen abgereinigt werden und die eine Berührung der Fallkörper mit der Meßzylinderwand verhindern und
• - eine im Meßzylinder bewegliche Platte oberhalb des Hubkolbens, mit der die Drähte am oberen Ende fest verbunden sind, wobei diese Platte gegen Ende der Hubbewegung des Kolbens von diesem über zwischen Kolben und Platte angeordnete Federn nach oben ge­ drückt wird sowie
• - eine ebenfalls bewegliche Platte, mit der die unte­ ren Enden der Drähte fest verbunden sind, an der ferner die Auffangvorrichtung für die Fallkörper be­ festigt ist und die in angehobenem Zustand, d. h. bei Erreichen der vollen Hubhöhe des Kolbens den Meßzy­ linder unten verschließt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 gekennzeichnet durch eine über eine sterile Durchführung von außen drehbare obe­ re Fallkörperhalte-, Auslöse- und Wiedereinsammelvor­ richtung, so daß die für eine Meßserie benötigten meh­ reren Fallkörper mit jeweils gleichem Gewicht oder die erforderlichen gewichtsunterschiedlichen Serien von Fallkörpern mit jeweils gleichem Gewicht nacheinander durch Drehen dieser Vorrichtung in die zum koaxialen Fallenlassen der Einzelfallkörper erforderliche Posi­ tion gebracht werden können.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5-7 gekenn­ zeichnet durch Ausführung des Fallkörpers als teil­ bare, unmagnetisierbare Kugel mit einem Hohlraum, in den zur Einstellung des jeweilig durch das Meßprogramm vorgegebenen Gesamtgewichtes ein unmagnetisierbares Zusatzgewicht derart eingesetzt wird, daß der Massen­ schwerpunkt unter dem Kugelmittelpunkt liegt und in dessen Mittelpunktsebene normal zur Achse Schwerpunkt - Mittelpunkt nahe am Umfang ein magnetisierbarer Ring eingebettet ist sowie ferner durch Anordnung von Induk­ tionsschleifen in der oder außen um die Meßzylinderwand in Höhe der vorgegebenen Meßquerschnitte.

9. Vorrichtung nach Ansprüchen 5 bis 8 gekennzeichnet durch Verwendung ausschließlich von dampfsterilisierba­ rem Material sowie Materialoberflächen, insbesondere von Meßzylinderwand und Fallkörpern aus biokompatiblem und nicht netzbarem Werkstoff, z. B. Teflon.