DE3621127A1 - Verfahren und apparatur zur beurteilung des morphologischen zustandes sowie des fermentationsfortschrittes agglomerierender biosuspensionen - Google Patents

Description

Problem

Verfahren und Apparatur zur Beurteilung des morphologischen Zustandes sowie des Fermentationsfortschrittes agglomerierender Biosuspensionen

Die Suche nach neuen, durch Biosynthese hergestellten Wirkstoffen erscheint für solche Systeme besonders aussichtsreich, die bisher weniger intensiv überprüft wurden. Ein Grund für das hier weniger intensive screening solcher Systeme dürfte auch mit in den Schwierigkeiten liegen, die mit der Fermentation einiger dieser potentiellen Wirkstofflieferanten verbunden sind. So können manche perfekten und imperfekten Pilze zwar noch im Schüttelkolben bis zum Einsetzen der Wirkstoffproduktion fermentiert werden. Sie erweisen sich jedoch als sehr scherempfindlich, und die rheologischen Eigenschaften dieser Suspensionen verändern sich mit dem Fermentationsfortschritt teilweise extrem in Richtung eines Gel-ähnlichen Zustandes analog dem Bingham-Bereich nicht-Newton′scher Fluide. So gelingt es mitunter noch nicht einmal, einige der als interessant befundenen Spezies zur Gewinnung von Bemusterungsproben auch im Technikumsfermenter bis zur Wirkstoffproduktion genügend ungeschädigt zu züchten. Bei zu wenig Durchmischung der Suspension bilden sich zwar die für den Beginn einer Wirkstoffproduktion günstigen Zellagglomerate, dann sind jedoch die Versorgung bzw. die Entsorgung der Zellen anscheinend zu schlecht. Bei intensiverer Durchmischung ist zwar die Nährstoffversorgung und die Abfuhr von Metaboliten ausreichend, es setzt jedoch oft keine Wirkstoffproduktion ein, weil die Agglomerate mechanisch sehr stark belastet und offensichtlich damit auch zu sehr geschädigt werden.

Bei der Fermentation von agglomerierenden und/oder Hyphen- bildenden Biosuspensionen in technischem Maßstab ist es oft schwierig, allein mit Hilfe der durch Analysen bestimmten Konzentrationswerten eine optimale Prozeßführung zu erreichen. Wachstum und insbesondere die Produktion von Wirkstoffen hängen auch vom morphologischen Zustand des Biosystems ab, z. B. in welchem Ausmaß Agglomerate gebildet/zerstört werden, oder welche Bindungsmechanismen sich zwischen den einzelnen Agglomeraten ausbilden können.

Zur Beurteilung des Fermentationsfortschrittes bzw. des Auftretens von Störungen erscheint es daher nicht nur wünschenswert, die Konzentration von Nährstoffen, Metaboliten oder Sauerstoff zu messen, sondern auch den morphologischen Zustand der Agglomerate beurteilen zu können, d. h. einen aussagefähigen Maßstab für den Suspensionszustand zu haben. Dies gilt sowohl für den Technikumsmaßstab wie für die technische Anwendung. Ferner würde so auch das scale-up bei der Einführung neuer Produktionen oder Verfahren erleichtert.

Manche Biosuspensionen, so auch die hier erwähnten Pilzsuspensionen werden bei der Fermentation vollkommen undurchsichtig, so daß alle optischen Beurteilungsmöglichkeiten entfallen. Da die Agglomerate bis zu einige Millimetern groß werden, sind auch normale Viskosimeter zur Beurteilung der rheologischen bzw. morphologischen Eigenschaften der Agglomerate nicht geeignet. Hinzu kommt, daß bei den normalen Viskosimetern mit ihren relativ kleinen Abmessungen, bezogen auf die Festigkeitseigenschaften der Bioagglomerate ziemlich große Scherspannungsgefälle erzeugt werden müssen, um in den zähen Suspensionen zum Messen ausreichende Scherkräfte zu erzeugen. Damit ergibt sich die folgende

Aufgabe

Erfassen von Änderungen der Agglomerateigenschaften in nicht-durchsichtigen Biosuspensionen durch Messung des morphologischen Verhaltens des Gesamtsystems: Substrat + agglomerierende Kultur durch ein nicht-optisches Verfahren unter sterilen Bedingungen sowie Meßmöglichkeit über die gesamte Fermentationsdauer.

Es reicht ein vergleichendes Meßverfahren aus, wenn die Meßdaten ausreichend reproduzierbar sind und nicht zu stark von anderen Parametern beeinflußt werden.

Lösung

Es wurde gefunden, daß die morphologischen Eigenschaften agglomerierender Biosuspensionen durch das Bestimmen der Sinkgeschwindigkeit bzw. des Nichtmehreinsinkens von Fallkörpern gleicher Abmessung, jedoch unterschiedlichen Verhältnisses Φ von Sinkkörperdichte zur Dichte der Suspension beurteilt werden können. Dabei sind die Abmessungen des Fallkörpers und des Spaltes zwischen Körper und Meßgefäßwand so zu wählen, daß die vom Fallkörper verdrängten Agglomerate eine möglichst deutliche Kraftwirkung auf die Agglomerate im Spalt ausüben, daß sich jedoch eine dem Zustand im Fermenter noch ausreichend ähnliche Agglomeratstruktur erhalten kann, d. h. die Spaltweiten sollen etwa von der gleichen Größenordnung sein wie die sich gegen Fermentationsende einstellenden Agglomerate aus Biomaterial. Das Verhältnis Φ der Dichte des Fallkörpers ρ zu der Dichte der Biosuspension ρ ₀ kann dabei von Φ nur wenig ≦λτ 1 (z. B. 1,01) bis etwa Φ ≈ 3 reichen.

Das Dichteverhältnis Φ, bis zu dem der Fallkörper nicht mehr einsinkt, ist ein Maß für die Größe des rheologischen Bereiches, in dem die Kohäsionskräfte und die von den Agglomeraten aufeinander ausgeübten Kräfte größer als die vom Fallkörper ausgeübten Scherkräfte sind (analog dem Bingham-Bereich der Kontinuumsmechanik für homogene Fluide).

Die Nichtproportionalität der Sinkgeschwindigkeit zum Dichteverhältnis Φ bei schwereren (d. h. einsinkenden) Fallkörpern ist dann ein Maß für die Abweichungen der rheologischen Eigenschaften des Gesamtsystems aus Substrat + Agglomerat + evtl. vorhandener anderer, nicht agglomerierter Partikel von einem Newton′schen Fluid. Dabei macht sich ein Einfluß der Agglomerate besonders im Bereich kleinerer Werte von Φ, d. h. bei kleinen Sinkgeschwindigkeiten bemerkbar, da hier die durch die Agglomerationskräfte gekoppelten Teilchen der Verdrängerströmung noch teilweise auszuweichen vermögen, so daß auch die makroskopische Agglomeratsstruktur damit teilweise erhalten bleibt. Bei größeren Dichteverhältnissen Φ werden die Sinkgeschwindigkeiten so groß, daß sich dann verstärkt die rheologischen Eigenschaften des Substrats selbst auswirken.

Ein weiteres Beurteilungskriterium für den morphologischen Zustand agglomerierender Biosuspensionen liefert die Bestimmung der Zunahme der Sinkgeschwindigkeit von Fallkörpern gleichen Gewichts bei mehrfacher, rascher Wiederholung der Messung in derselben Suspensionsprobe. In der frisch in das Meßgefäß eingefüllten Probe können sich die kohäsiven Bindungen im Substrat (z. B. durch Polysaccharide) wie auch die zwischen den einzelnen Biopartikeln weitgehend auswirken. Durch die mit dem wiederholten Meßvorgang bewirkten Schervorgänge werden diese als Folge der Kohäsionskräfte erst nach einer gewissen Zeit entstehenden Ordnungszustände gestört, die Sinkgeschwindigkeit steigt.

Wie auch für Fallkörper mit unterschiedlichem Dichteverhältnis Φ die Zunahme der Sinkgeschwindigkeit als Folge der Wiederholung des Meßvorganges mit Fallkörpern jeweils gleichen Gewichtes gemessen, so erhält man ein weiteres Beurteilungskriterium über den morphologischen Agglomeratzustand. Eine Zunahme im Bereich kleiner Dichteverhältnisse Φ wird verstärkt durch die Schädigung der Bindungsmechanismen zwischen den Agglomeraten, d. h. durch die Änderung ihres morphologischen Zustande verursacht. Bei größerem Dichteverhältnis Φ und damit auch größerer Sinkgeschwindigkeit werden sich im wesentlichen nur noch eventuelle Änderungen im Substrat, d. h. im Molekularbereich, auswirken.

Zur besseren Beurteilung von Meßergebnissen mit Hilfe von Diagrammen erscheint es zweckmäßig, nicht die Sinkgeschwindigkeiten, sondern den Kehrwert, d. h. die Fallzeiten, aufzutragen. Die Abb. 1 zeigt die Änderung solcher Fallzeiten in Sekunden Durchlaufzeit/Meter Weg von Fallkörpern unterschiedlichen Dichteverhältnisses Φ bei der Fermentation eines imperfekten Pilzes mit den Parametern: Fermentationsdauer in Tagen sowie jeweils 1 und 5. Messung in derselben Suspensionsprobe in rascher Folge mit gleich schweren Fallkörpern. Abb. 2 zeigt in Abhängigkeit von der Fermentationsdauer die Änderung des Bereichs des Dichteverhältnisses Φ, in dem die Fallkörper nicht mehr einsinken (analog dem Bingham-Bereich bei homogenen Fluiden) und des Bereiches, in dem die Fallkörper mit einer noch gut meßbaren Geschwindigkeit einsinken. Man erkennt, daß sich aus den Änderungen dieser Meßwerte Beurteilungskriterien für den morphologischen Agglomeratzustand der Suspension ergeben.

Ein weiteres Beurteilungskriterium ist die Abnahme der Sinkgeschwindigkeit eines Fallkörpers mit der Länge des Fallweges, nachdem er die Anlaufstrecke durchlaufen hat, insbesondere wenn mehrere gleichschwere Fallkörper nacheinander durch dieselbe Probe fallen bzw. dann nicht mehr bis zur untersten Meßebene gelangen. Dieser Effekt wird verursacht einmal durch die natürliche Sedimentation von spezifisch schwereren Agglomeraten und zum anderen durch ein Vorsichherschieben bzw. den Mittransport von Agglomeraten in der Schleppströmung durch die Fallkörper. Beide Ursachen sind in ihrem Ausmaß abhängig von den morphologischen Eigenschaften der Agglomerate.

Es wurde ferner gefunden, daß sich ausreichend repräsentative und reproduzierbare Meßwerte für die Sinkgeschwindigkeit eines Fallkörpers nur ergeben, wenn dieser annähernd koaxial in dem Meßzylinder nach unten sinkt. Mit einer Annäherung an die Wand werden die Kräfteverhältnisse, aus denen die Sinkgeschwindigkeit resultiert, nicht reproduzierbar gestört.

Wegen der Undurchsichtigkeit vieler agglomerierender Biosuspensionen ist für ein allgemein anwendbares Beurteilungsverfahren des morphologischen Zustandes nur eine nichtoptische Meßmethode zur Bestimmung der Sinkgeschwindigkeit der Fallkörper anwendbar. Es wurde gefunden, daß für diese Meßaufgabe als Fallkörper Kugeln aus nicht magnetisierbarem Material geeignet sind, die durch Verlagerung des Massenschwerpunktes außerhalb des Kugelmittelpunktes (d. h. beim Sinken in der Suspension unterhalb) am Drehen um eine waagrechte Achse gehindert werden und in deren Mittelebene normal zur Achse Mittelpunkt - Schwerpunkt am Umfang ein magnetisierbarer Ring (z. B. Eisendraht) eingebettet ist. Mit Hilfe von Induktionsschleifen, die in die Wand des Meßzylinders eingebaut werden, kann dann der Zeitpunkt des Passierens der Mittelebene einer Fallkugel durch diese Zylinderebene als elektro-magnetisches Signal festgestellt werden. Die mittlere Sinkgeschwindigkeit der Kugel ergibt sich dann aus der Zeitdifferenz des Durchtritts durch zwei Meßquerschnitte vorgegebenen Abstandes. Durch Anordnung mehrerer Induktionsschleifen längs des Meßzylinders läßt sich auch die Änderung der mittleren Fallgeschwindigkeit mit der Länge des Fallweges bestimmen.

Zur zuverlässigen und reproduzierbaren Bestimmung des Durchtrittszeitpunktes der Fallkugel durch eine solche Meßebene, ist es ferner erforderlich, daß die Fallkörper mit Hilfe einer Leitvorrichtung koaxial geführt werden. Ein koaxialer Stab zur mittigen Führung von mit einer entsprechenden Zentralbohrung versehenen Fallkörpern verursacht beim nicht zu vermeidenden Eindringen von Substrat und evtl. auch von kleineren Suspensionsteilchen in den Spalt zwischen Bohrung und Stab eine zu große Verfälschung der Meßergebnisse. Es wurde gefunden, daß zur genügend genauen koaxialen Führung der Fallkörper eine Anordnung von mindestens 3 Längsdrähten, die einen Kreis ≦λτ dem Fallkörper-⌀ umschreiben, geeignet ist, wobei ihr freier Abstand voneinander jedoch ≦ωτ als der Fallkörper-⌀ sein muß.

Die morphologische Struktur der agglomerierenden Biosuspension soll möglichst im gleichen Zustand beurteilt werden, wie er auch im Fermenter vorhanden ist. Eine Förderung durch Pumpen über Leitungen oder Drosseln würde jedoch leicht zu Strukturänderungen der agglomerierten Teilchen führen. Diese Gefahr wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dadurch vermieden, daß zum Füllen des Meßzylinders mit der zu beurteilenden Suspension die untere Öffnung des Zylinders direkt in das Gemisch im Fermenter eingetaucht und daß dann die Suspension mit Hilfe eines Hubkolbens ohne größere Umlenkung oder Drosselung direkt in den Meßzylinder hochgesaugt wird.

Agglomerierende Biosuspensionen neigen oft auch stark zur Wandanhaftung. Solche Anhaftungen an den Fallkörpern, an den Führungsdrähten oder an der Innenwand des Meßzylinders würden die Sinkgeschwindigkeit der Fallkörper beeinflussen. Zur Verhinderung dieses Störeinflusses werden bei dem erfindungsgemäßen Beurteilungsverfahren neben der bevorzugten Verwendung nicht netzbarer Materialoberflächen (z. B. Teflon ®) die Zylinderwand und die Führungsdrähte vor dem Einfüllen frischer Suspension mit Hilfe des oben erwähnten Hubkolbens abgereinigt Die Neigung der Biosuspensionen zu Wandanhaftungen kann bis zum vollständigen Überwachsen auch größerer Öffnungen, wie der des Meßzylinders, führen. Um dies zu vermeiden, wird daher der Meßzylinder nach Abschluß einer Meßserie ganz aus der Suspension herausgezogen und nach vollständiger Entleerung am unteren Ende von einem längsverschieblichen Deckel verschlossen. Durch Anheben dieses Deckels nach dem Einsaugen der Probe wird auch verhindert, daß während der Messung Agglomerate aus dem Meßzylinder nach unten in den Fermenter wegsedimentieren können. Letzteres würde insbesondere beim Messen der Abnahme der Sinkgeschwindigkeiten mit der Länge des Fallweges zu Verfälschungen der Ergebnisse führen.

Aus der Art der Messung und insbesondere der der Probenahme ergibt sich die Notwendigkeit, die Apparatur fest im Fermenterdeckel einzubauen. Zur Sicherung der Sterilität muß daher die gesamte Apparatur nach außen abgedichtet und dampfsterilierbar sein.

Ausführungsbeispiel

Die Abb. 3 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Apparatur zur on-line Beurteilung der Änderung der morphologischen Eigenschaften der Agglomerete einer Biosuspension mit dem Fermentationsfortschritt am Beispiel für einen imperfekten Pilz.

Kernstück ist der mit Hilfe des Anpassungsflansches 3 (mit Dichtung 26) vertikal auf dem Fermenterdeckel 1 ausgerichtete Meßzylinder 14, in dem die Fallkugeln 25 nach ihrem Start mit Hilfe des hydraulisch gesteuerten Auslösers 24 aus der aus drei entsprechend geformten Federn bestehenden Kugelhalte- Auslöse- und Wiedereinsammelvorrichtung 23 in der Biosuspension nach unten bis in die Sammelvorrichtung 30 sinken. Im Meßzylinder 14 werden die Fallkörper 25 dabei von den Führungsdrähten 11 längs der Mittelachse geführt. Der Zeitpunkt des Durchtritts des (durch Tieferlegen des Fallkörper-Schwerpunktes in der Mittelwaagrechten stabilisierten) Eisenringes einer der Fallkugeln 25 durch einen Meßquerschnitt des aus nicht- magnetisierbarem Material bestehenden Meßzylinders 14 wird mit Hilfe der an dieser Stelle außen am Zylinder 14 angebrachten Induktionsschleife 27 gemessen.

Die in der Fallkörperhalte- Auslöse- und Wiedereinsammelvorrichtung 23 übereinanderliegenden einzelnen Fallkugeln 25 mit, je nach Meßprogramm jeweils unterschiedlichem Gewicht bzw. mit gleichem Gewicht, werden nacheinander mit Hilfe des vom Hydraulikkolben 20 bewegten Ausstoßers 24 für den einzelnen Meßvorgang ausgelöst.

Im Ruhezustand ist der im Flansch 3 längsverschiebliche und über Dichtungsringe 2 gegen den Fermenter sowie durch den elastischen Faltenbalg 5 steril nach außen abgedichtete Doppelmantel, bestehend aus dem Meßzylinder 14 und dem Außenrohr 4, die oben fest über die Flanschverbindung 6 und unten längsverschieblich über den Ring 34 mit Dichtung 28 verbunden sind, nach oben gezogen, sodaß er nicht in das Fermentationsgemisch eintaucht. Ferner ist im Ruhezustand der im Meßzylinder 14 über die Dichtringe 9 abgedichtete und zugleich geführte Hubkolben 8 durch Anlegen von Unterdruck am Stutzen 17 im oberen Abschlußdeckel 15 nach oben gezogen. Dadurch werden auch die durch den Kolben 14 gehenden Drähte 11, die durch die vom untergeschraubten Deckel 22 festgehaltenen Dichtungen 21 gegen den Kolben abgedichtet sind, mit Hilfe der Federn 10 zwischen dem Hubkolben 8 und dem verschieblichen Deckel 12, in dem die Drähte 11 fest verschraubt sind, so weit mit angehoben, daß der unten an den Drähten 11 befestigte Verschluß 30 den Meßzylinder 14 gegen den Fermenterinhalt abschließt. Der Verschluß 30 ist zugleich Sammelvorrichtung für die bereits durch die Meßstrecke gefallenen Kugeln. Unten im Verschluß 30 ist eine Bohrung 31 angebracht zur vollständigen Entleerung der Meßapparatur nach dem Wiedereinsammeln der Fallkugeln mit Hilfe der Vorrichtung 23. Die Bohrung 31 dient auch als Abfluß von Kondensat beim Sterilisieren durch direkte Dampfzufuhr (s. u.).

Die Öffnung 31 ist im Ruhezustand ebenfalls von einer Fallkugel 25 verschlossen, sodaß keine Spritzer und kein Schaum aus dem Fermentationsgemisch in den Meßzylinder gelangen können. Wie bekannt, können solche Spritzer zu örtlichen Fehlentwicklungen der Fermentation oder auch zu sehr festen Wandanwachsungen führen.

Zu Beginn eines Meßprogramms werden der Hydraulikkolben 20 mit dem Ausstoßer 24 durch Abzug von Hydraulikflüssigkeit über die zu einer Wendel aufgewickelte Hydraulikleitung 16 nach oben gezogen. Anschließend wird der Hubkolben 8 durch Eindrücken von Sterilluft am Stutzen 17 nach unten bewegt. Dabei drückt dann ab einem bestimmten Abwärtsweg des Kolbens 8 die im Vergleich zur Gesamthärte aller Federn 10 weichere Feder 13 den Deckel 12 bis zum mit Hilfe von Dichtung 19 nach außen gedichteten Anschlag 18 nach unten. Dadurch wird zugleich der von drei Stiften 32 geführte Verschluß 30 so weit nach unten abgesenkt, daß im folgenden Einsaugevorgang die Agglomerate der in ihren morphologischen Eigenschaften zu beurteilenden Biosuspensionen unter nur sehr geringer Scherbeanspruchung und ohne zusätzliche Umlenkungen und damit auch nur mit geringen Änderungen ihres morphologischen Zustandes durch die Öffnung 33 in den Meßzylinder einströmen können. Der Kolben 8 wird dabei bis zum Anschlag 29, der über die Dichtung 28 mitabgedichtet ist, abgesenkt. Hierdurch schieben sich zugleich die drei Federn der Fallkugelhalte-, Auslöse- und Wiedereinsammelvorrichtung 23 bis über die als erste ausgelöste und damit zuunterst in der Sammelvorrichtung 30 liegende Fallkugel 25. Durch diese Kolbenbewegung werden zugleich auch die Meßzylinderwand 14 und die Drähte 11 durch die Dichtungen 9 bzw. 21 von evtl. entstandenen Belägen abgereinigt.

Nun wird die ganze Doppelmantelanordnung 4-14 abgesenkt, so daß die Eintrittsöffnung 33 in das Fermentationsgemisch eintaucht. Anschließend wird der Kolben 8 zusammen mit den Fallkugeln 25 im Halter 23 durch Anlegen von Unterdruck am Stutzen 17 nach oben bewegt, sodaß die in ihren rheologischen Eigenschaften zu beurteilende, agglomerierende Biosuspension in den Meßzylinder 14 gesaugt wird. Nachdem der Kolben so weit angehoben ist, daß der Deckel 30 den Meßzylinder 14 unten verschlossen hat, wird zum Start der ersten Kugel 25 der Kolben 20 hydraulisch um einen Fallkugel-⌀ nach unten bewegt, sodaß die unterste Kugel aus der Vorrichtung 23 in die Biosuspension fällt. Sodann werden die Durchtrittszeiten dieser Fallkugel 25 durch die verschiedenen Meßebenen des Zylinders 14 mit Hilfe des elektrischen Signals gemessen, das von dem in jeder Kugel eingebauten und waagrecht stabilisierten Eisenring beim Passieren der in jeder Meßebene angebrachtenden Induktionsschleife 27 ausgelöst wird.

Bei einem Meßprogramm mit einer Serie gleich schwerer Kugeln wird dann unmittelbar anschließend die zweite Kugel gestartet und so fort. Bei einem Meßprogramm mit unterschiedlich schweren Fallkugeln wird nach Eintritt der zuerst gefallenen Kugel in die Sammelvorrichtung 30 die durch diesen Meßvorgang morphologisch möglicherweise veränderte Suspension durch Absenken des Kolbens 8, der ja gekoppelt ist mit dem Absenken des Verschlusses 30, wieder in das Fermentationsgemisch zurückgegeben. Der Kolben 8 wird jedoch nur soweit abgesenkt, daß die Fallkugelhalte-, Auslöse- und Wiedereinsammelvorrichtung 23 noch keine der bereits in der Verschluß- und Sammelvorrichtung 30 liegenden Fallkugeln 25 erfaßt. Durch Heben des Kolbens 8 wird dann eine frische, durch einen Meßvorgang morphologisch noch nicht veränderte Probe der Biosuspension aus dem Fermentationsgemisch durch die Öffnung 33 schonend in den Meßzylinder 14 gefördert.

Die Meßleitungen 7 für die Induktionsschleifen 27 sind aus dem unsterilen Ringraum zwischen dem Außenmantel 4 und dem Meßzylinder 14 durch Bohrungen im Flansch 6 nach außen geführt.

Nach Lösen des Flansches 3 vom Fermenterdeckel 1 kann die gesamte Meßeinrichtung durch Öffnen der Verbindungen 6 und 15 sowie nach Zurückdrehen der Anschläge 18 und 29 einfach auseinandergenommen, gereinigt, evtl. mit einer anderen Serie von Fallkugeln 25 bestückt und dann nach Wiederzusammenbau und Aufschrauben auf den Fermenterdeckel 1 im Autoklaven sterilisiert werden. Beim Einbau der Meßeinrichtung in den Deckel eines größeren Fermenters, der durch Zufuhr von Dampf sterilisiert wird, müssen noch drei zusätzliche Stutzen 35, 36 und 37 am Meßzylinder 14 angebracht werden. Der Stutzen 35 ist für die Zufuhr von Sterilisierdampf in den Meßzylinder 14 unterhalb des Kolbens 8 bestimmt. Er ist in einer solche Höhe angebracht, daß bei der höchsten Stellung des Kobens 8 der Dampf unmittelbar unter dem Befestigungsdeckel 22 für die Fallkugelhalte-, Auslöse- und Wiedereinsammelvorrichtung 23 eintritt. Das beim Sterilisieren anfallende Kondensat fließt dann durch die Öffnung 31 in der Absperrvorrichtung 30 ab. Wegen der Hubbewegung des Kolbens 8 muß auch der Raum oberhalb sterilisiert werden. Dazu werden der Dampf durch den Stutzen 36 zu- und das Kondensat durch den Stutzen 35, der mit der Oberkante des Kolbens 8 in seiner höchsten Stellung abschließt, abgeführt.

Bei der Fermentation von imperfekten Pilzen, die Agglomerate von eingen mm Größe bilden, sind z. B. zweckmäßige Abmessungen für die Fallkugeln 20 mm ⌀ und für den Innen- ⌀ des Meßzylinders 40 mm, so daß die Spaltweite zwischen dem Fallkörper und der Zylinderwand mit 10 mm von der gleichen Größenordnung ist wie die der Agglomerate. Der Mindestabstand zwischen dem obersten und dem untersten Meßquerschnitt im Zylinder 14 soll dann bei 200 mm liegen. Für die Beurteilung des morphologischen Zustandes anders agglomerierender Kulturen oder wenn, insbesondere gegen Ende einer Fermentation, infolge geänderter äußerer Parameter andere Agglomeratgrößen entstehen, ergeben gegebenenfalls andere, zweckmäßigere Abmessungen von Fallkörper- und Zylinder-⌀ bessere Beurteilungsmöglichkeiten. Wegen der vielen verschiedenen Parameter, die Einfluß auf die morphologischen Eigenschaften der Agglomerate sowie anderer, evtl. im Fermentationsgemisch vorhandener Partikel haben und die damit neben den rheologischen Eigenschaften der kontinuierlichen Phase, d. h. des Substrates auch einen Einfluß auf die Sinkgeschwindigkeit der Fallkörper haben, gibt es (noch) keine Regel für die Wahl von zweckmäßigen Abmessungen, um optimale Beurteilungskriterien zu erhalten.

Nach oben wird die maximale Länge der Meßstrecke begrenzt durch die Handhabbarkeit, durch das im Fermenter zur Verfügung stehende Volumen an Fermentationsgemisch, das ohne Störung des Fermentationsvorganges abgezogen werden kann sowie durch die zur Verfügung stehende Höhe über dem Fermenterdeckel. Wird Teflon oder ein ähnliches Material als Werkstoff für den Meßzyinder 14 verwendet, so ist die maximale Höhe der Meßlänge auch von den Anforderungen an die Maß- und Formbeständigkeit des Meßquerschnittes bestimmt, da das Ein- und Ausschieben der Biosuspension von der Funktionsfähigkeit und dem Dichtbleiben des Hubkolbens 8 wesentlich abhängt.

Claims (9)

1. Verfahren zur on-line Beurteilung des momentanen morphologischen Zustandes der Agglomerate und indirekt damit auch des Fermentationsfortschrittes einer Biosuspension dadurch gekennzeichnet, daß das Nichtmehreinsinken bzw. die unterschiedlichen Sinkgeschwindigkeiten geometrisch gleicher, jedoch unterschiedlich schwerer Fallkörper in einem Zylinder gemessen werden, der direkt, d. h. ohne die Suspension durch Leitungen oder Absperrorgane, wie Ventile oder Hähne zu führen, mit dem zu beurteilenden Substrat- Agglomeratgemisch gefüllt wird und dessen Abmessungen so gewählt sind, daß die Spaltweite zwischen Fallkörper und Zylinderwand von der gleichen Größenordnung ist wie die sich gegen Fermentationsende ausbildenden, durch das erfindungsgemäße Verfahren zu beurteilenden Agglomerate des Biomaterials.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß in einer Meßserie die Sinkgeschwindigkeiten von mehreren gleich schweren Fallkörpern gemessen werden, die in kurzem zeitlichen Abstand nacheinander in der selben Suspensionsprobe fallen gelassen werden.

3. Erweitertes Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Meßserien nach Anspruch 2 jedoch dann mit jeweils unterschiedlichen Gewichten der einzelnen Serie von Fallkörpern, sowie mit jeweils frisch eingefüllter Biosuspension für die Einzelserie durchgeführt werden.

4. Verfahren zur Bestimmung der Sinkgeschwindigkeiten und bevorrzugt auch zum Bestimmen der Änderung der Sinkgeschwindigkeiten längs des Fallweges der verschiedenen Fallkörper in einem Meßzylinder nach Anspruch 1, insbesondere in undurchsichtigen Suspensionen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zeitdifferenzen für den Durchgang eines frei in der Suspension absinkenden Fallkörpers durch zwei oder bevorzugt mehrere Zylinderquerschnitte mit jeweils definierten Abständen voneinander elektrisch-induktiv gemessen werden.

5. Apparatur zur Durchführung der Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4 gekennzeichnet durch

• - einen am Fermenterdeckel befestigten, und gegen diesen steril abgedichteten, vertikal ausgerichteten Meßzylinder, der in einer Führung mit Abdichtung so weit längsverschieblich ist, daß die normalerweise außerhalb der Suspension befindliche untere Öffnung des Zylinders in die Suspension eintaucht und an dem unterhalb der Meßstrecke eine Auffangvorrichtung für die Fallkörper angebracht ist und
• - eine in dem Meßzylinder längsbeweglichen und an seiner Zylinderfläche mit Dichtungen versehenen Kolben, durch dessen aufwärts gerichteten Hub (nach Absenken des Meßzylinders in die Suspension) frische Suspension eingesaugt und durch dessen Abwärtsbewegung nach Beendigung des Meßvorgangs die Suspension wieder ausgestoßen wird, wobei dieser Vorgang mit einer Abreinigung der Meßzylinderwand von evtl. anhaftenden Teilchen der agglomerierenden Suspension verbunden ist, sowie ferner
• - einer Halte-, Auslöse- und Wiedereinsammelvorrichtung für alle zu einem Meßvorgang benötigten Fallkörper, die zumindest mit dem Wiedereinsammelvorrichtungsteil soweit längsverschieblich ist, daß alle Fallkörper oberhalb der Meßstrecke im Meßzylinder festgehalten und nacheinander koaxial ausgelöst werden und daß alle Fallkörper aus der Auffangvorrichtung unterhalb der Meßstrecke eingesammelt und wieder nach oben gehoben werden können.

6. Zusatzeinrichtung zur Apparatur nach Anspruch 5 gekennzeichnet durch

• - mindestens 3 im Meßzylinder gleichmäßig auf einem koaxialen Kreis mit einem inneren ⌀ ≦λτ dem ⌀ der Fallkörper angeordnete Drähte, die gedichtet durch den Hubkolben führen, bei der Hubbewegung durch diese Dichtungen abgereinigt werden und die eine Berührung der Fallkörper mit der Meßzylinderwand verhindern und
• - eine im Meßzylinder bewegliche Platte oberhalb des Hubkolbens, mit der die Drähte am oberen Ende fest verbunden sind, wobei diese Platte gegen Ende der Hubbewegung des Kolbens von diesem über zwischen Kolben und Platte angeordnete Federn nach oben gedrückt wird sowie
• - eine ebenfalls bewegliche Platte, mit der die unteren Enden der Drähte fest verbunden sind, an der ferner die Auffangvorrichtung für die Fallkörper befestigt ist und die in angehobenem Zustand, d. h. bei Erreichen der vollen Hubhöhe des Kolbens den Meßzylinder unten verschließt.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Meßverfahrens nach Ansprüchen 2 und 3 in einer Apparatur nach Anspruch 5 gekennzeichnet durch eine über eine sterile Durchführung von außen drehbare obere Fallkörperhalte-, Auslöse- und und Wiedereinsammelvorrichtung, sodaß die für eine Meßserie nach Anspruch 2 benötigten mehreren Fallkörper mit jeweils gleichem Gewicht bzw. die nach Anspruch 3 erforderlichen gewichtsunterschiedlichen Serien von Fallkörpern mit jeweils gleichem Gewicht nacheinander durch Drehen dieser Vorrichtung in die zum koaxialen Fallenlassen der Einzelfallkörper erforderliche Position gebracht werden können.

8. Einrichtung zum Bestimmen des Zeitpunktes des Durchtritts eines frei in der evtl. undurchsichtigen Suspension nach unten sinkenden Fallkörpers durch einen Meßquerschnitt des Zylinders gekennzeichnet durch Ausführung des Fallkörpers als teilbare, unmagnetisierbare Kugel mit einem Hohlraum, in den zur Einstellung des jeweilig durch das Meßprogramm vorgegebenen Gesamtgewichtes ein unmagnetisierbares Zusatzgewicht derart eingesetzt wird, daß der Massenschwerpunkt unter dem Kugelmittelpunkt liegt und in dessen Mittelpunktsebene normal zur Achse Schwerpunkt - Mittelpunkt nahe am Umfang ein magnetisierbarer Ring eingebettet ist sowie ferner durch Anordnung von Induktionsschleifen in der oder außen um die Meßzylinderwand in Höhe der vorgegebenen Meßquerschnitte.

9. Vorrichtung nach Ansprüchen 5 bis 8 gekennzeichnet durch Verwendung ausschließlich von dampfsterilisierbarem Material sowie Materialoberflächen, insbesondere von Meßzylinderwand und Fallkörpern aus biokompatiblem und nicht netzbarem Werkstoff, z. B. Teflon ®.