DE3530336A1 - Verfahren zur kultivierung des gefluegelembryos - Google Patents

Description

Die Geflügelembryo wird in der Forschung wegen seiner im Ver­ gleich zum Säugerembryo leichteren experimentellen Handhabung vielfältig eingesetzt. Dieser Vorzug hat zur Überlegung geführt, daß befruchtete Vogelei routinemäßig, z. B. bei Nachweis und bei der Überprüfung toxischer Substanzen anzuwenden. Daß dies bis jetzt nicht erfolgt ist, ist darauf zurückzuführen, daß die weit­ gehend undurchsichtige Eischale einer zuverlässigen, gezielten Applikation von Substanzen im Wege steht.

Besonders schwerwiegend in diesem Zusammenhang ist die Tatsache, daß die einzelnen Eikompartimente zu verschiedenen Zeitpunkten der Embryogenese resorbiet werden. So trennt sich gleich zu Beginn der Bebrütung einer Dotterphase mit ausgeprägter flüssiger Konsistenz ab, die in der ersten Hälfte der Empbryogenese als Nah­ rungsquelle dienst, während der verbleibende viskose Dotter erst im Endabschnitt der embryoanlen Entwicklung resorbiert wird. In dem dazwischen liegenden Zeitraum wird dann das Eiklar vom Embryo aufgenommen. Je nach Applikation in das jeweilige Eikom­ partiment ist daher mit einer zeitlich verschiedenen Resorption der betreffenden Substanz zu rechnen. So läßt sich zeigen, daß eine Verabreichung von Hexadecan in das Eiklar gleich zu Beginn der Inkubation sich nicht in der flüssigen Dotterphase anrei­ chert und somit in dieser Entwicklungsphase auch nicht vom Em­ bryo aufgenommen wird (eigener Versuch). Da die Einwirkung von Substanzen auf die Embryonen meist von deren Entwicklungsstatus abhängt, ist bei einer verzögerten Aufnahme mit einer Verringe­ rung oder gar mit dem Ausbleiben der zu erwartenden Wirkung zu rechnen.

Um eine gezielte Applikation zu gewährleisten, wurden verschieden­ artige Inkubationsverfahren erprobt, die einen direkten Zugang zum Embryo ermöglichen:

Eröffnen der Eischale, Explantierung des Embryos Ersetzen der Eikompartimente durch künstliche Nähmedien, Kultivierung des Embryos ohne Eischale. Davon wird meines Wissens die Applikation am eröffneten Ei als einzige Methode zum routinemäßigen Nachweis toxischer Auswirkungen praktiziert (1). Diese Methode eignet sich jedoch nur für Substanzen, die ihre Wirkung innerhalb weniger Stunden entfalten, da der Embryo unter diesen Bedingungen nicht über einen längeren Zeitraum am Leben erhalten werden kann. Dies gilt auch mit Ausnahme der Kultivierung für die übrigen oben aufgeführten Verfahren.

Demgegenüber läßt sich bei der Kultivierung des Embryos über einen weitaus längeren Zeitraum am Leben erhalten, vereinzelt sogar bis kurz vor dem Schlupf aus dem Ei. Dieses Verfahren hat aber bis heute keine Anwendung beim Nachweis toxischer Sub­ stanzen gefunden und zwar u. a. deswegen, weil bisher die Kul­ tivierung erst nach einer 3tägigen Vorinkubation möglich war. In dieser Phase vollziehen sich aber entscheidende Differenzie­ rungsvorgänge, so daß das Modell für Eingriffe teratogener, mutagener oder concerogener Substanzen meist nicht geeignet ist.

Das von uns entwickelte Verfahren zur Kultivierung des Hühner- und Wachtelembryos erlaubt eine Kultivierung bereits vom Beginn der Bebrütung an. Bei dem Verfahren haben wir uns bemüht, die Gasaustauschvorgänge denen des schalenhaltigen Eies anzupassen. Im folgenden soll deren Bedeutung für die ovale Entwicklung kurz ausgezeigt werden:

Das bebrütete Vogelei nimmt über die Poren der Eischale O₂ auf und gibt H₂O (Wasserdampf) und CO₂ an die Umgebung ab. Der Vor­ gang des Gasaustausches wird über einen Diffusionsprozeß gesteu­ ert. Die aus- bzw. eintauschbare Gasmenge ist bei gegebenem Druckunterschied im wesentlichen von der Größe der Porenfläche abhängig. Lediglich in den ersten 2-3 Tagen der Bebrütung scheinen die Eimembranen auf Grund ihrer Feuchtigkeit den Gas­ austausch zu limitieren. Als Regel gilt, daß Vogeleier im Verlauf der Inkubation ca. 15% des Eigewichtes in Form von H₂O nach außen abgeben. Die H₂O-Austauschrate ist im Gegensatz zur O₂-Eintauschrate, die mit zunehmender Entwicklung des Em­ bryos zunimmt, während der gesamten Inkubationsdauer annähernd konstant. Veränderungen der H₂ O-Austauschrate führen zu Störun­ gen der Embryogenese und letztlich zum Absterben des Embryos; wahrscheinlich sind daran Störungen der osmotischen Verhältnisse ursächlich beteiligt. Man neigt heute zu der Auffassung, daß Veränderungen im H₂O-Austausch sich nachhaltiger auf die Embryo­ genese auswirken als Verschiebungen im O₂-Austausch, da in der ersten Hälfe der Embryogenese die O₂ -Austauschkapazität der Eischale den embryonalen O₂-Bedarf bei weitem übersteigt. Ledig­ lich in der Endphase der fetalen Entwicklung, in der die Gasaus­ tauschkapazität der Eischale in etwa dem O₂-Bedarf des Fetus entspricht, führen hypoxische Zustände zu lebensbedrohenden Situ­ ationen des Fetus.

Bei der von uns entwickelten Methode zur Kultivierung des Geflü­ gelembryos (Hühner- und Wachtelembryos) wird das befruchtete Ei nach Entfernen der Kalkschale und der Eimembranen in einen oval geformten Glasbehälter übergeführt, und dieser mit einer handels­ üblichen Membran verschlossen. Im Brutschrank (37-30°C) entwickeln sich dann innerhalb von 2-3 Tagen bei 90-100% der be­ fruchteten Eier Blutgefäße und in der Keimscheibe ein pulsieren­ des Herz aus. Zu diesem Zeitpunkt wird die Membran mit einer fei­ nen Nadel perforiert, um den Gasaustausch zu intensivieren. Als Folge des erhöhten H₂O-Austritts kommt es zu einer Erhöhung des Gewichtsverlustes und zu einem Abfall des O₂-Partial­ druckes bzw. Anstieg des CO₂-Partialdruckes im Inkubationsgefäß.

Einer Perforation der Membran vor diesem Zeitpunkt wirkt sich nachteilig auf die Induzierung der Embryogenese aus. Anderer­ seits führt ein mehrfaches Perforieren zum alsbaldigen Absterben der Embryonen.

Die Embryogenese kann auch dadurch eingeleitet werden, daß bei perforierter Folie die Keimscheibe mit verdünntem Eiklar (3 Tei­ le Eiklar, 2 Teile H₂O) überschichtet wird.

Nach unseren Beobachtungen setzt die Entwicklung unter den Kul­ turbedingungen nur dann ein, wenn die Oberfläche der Keimscheibe einen entsprechenden Feuchtigkeitsgrad aufweist. Dieser wird bei unserer Methode dadurch erreicht, daß die Membran anfangs nicht perforiert wird bzw. die Keimscheibe mit verdünntem Eiklar über­ schichtet wird. Unter diesen Umständen kann dann der Embryo bis maximal zum 19. Tag am Leben erhalten werden.

Ein auffallender Befund bei der schalenlosen Kultivierung ist die Auftrennung des Dotters in 2 Phasen unterschiedlicher Kon­ sistenz (vgl. S. 1), wobei die flüssige Phase im ersten Abschnitt der Embryogenese bis zum 4. Tage zunimmt und dann wieder abfällt (Fig. 3), ähnlich dem Verlauf beim schalenhaltigen Ei.

Das aufgezeigte System erlaubt eine gezielte und wiederholte Applikation an von z. B. toxischen Stoffen in die verschiedenen Eikkompartimente z. B. Amnionhöhle, Allantois, Dottersack, Eiklar, Embryo. Ebenso können aus diesen Kompartimenten gezielt und wieder­ holt Proben für biologisch-medizinische Untersuchungen entnommen werden. Wird die Membran hierbei erneut perforiert, so kann sie problemlos erneuert werden.

Das System erlaubt außerdem eine konstante Beobachtung und Regi­ strierung der Motilität.

Schließlich ist das System hervorragend geeignet zur Kulti­ vierung von Bakterien, Viren und Pilzen.

Vorzüge des schalenlos kultivierten Embryos

• a) Wie oben ausgeführt, ist bei der von uns praktizierten Methode eine Kultivierung vom Beginn der Inkubation an möglich. Damit ist die Phase der Organogenese in der Kultur mit einbezogen. Da mutagene und teratogene Substanzen vor allem in dieser Phase zur Auswirkung kommen, ist der kultivierte Embryo zur Überprü­ fung derartiger Substanzen hervorragend geeignet.
• b) Die Kultivierung erfolgt zusammen mit den übrigen Eikomparti­ menten (Dotter, Eiklar). Für die Wirksamkeit embryotoxischer Substanzen dürfte die gezielte Applikation in diese Komparti­ mente von ausschlaggebender Bedeutung sein. Dies läßt sich am kultivierten Ei besonders einfach und erforderlichenfalls in wiederholter Folge durchführen. Umgekehrt können dem System (Dotter, Eiklar, Amnion, Allantois) gezielt und wiederholt Proben entnommen werden. Damit sind ideale Voraussetzungen gegeben, die Bedingungen, die bei der Entfaltung embryotoxischer Substanzen eine Rolle spielen, zu studieren.
• c) Der kultivierte Embryo stellt ein komplexes System dar, das über mehr oder weniger ausgeprägte Nerven- und Kreislauffunktionen verfügt, ein differenziertes Zellsystem für spezifische Aufga­ ben aufbaut und schließlich auch die Möglichkeit besitzt, toxische Substanzen über die Allantiosflüssigkeit auszuscheiden. Insgesamt stellt damit der kultivierte Embryo ein bei weitem aussagekräftigeres System als die Zellkulturen dar.
• d) Das Modell des kultivierten Embryos erlaubt Einsparungen von Tierversuchen in größerem Umfange. Dies ist vor allem dadurch bedingt, daß Proben von einem und demselben Embryo wiederholt gewonnen werden können, der Embryo über einen relativ langen Zeitraum am Leben erhalten werden kann und schließlich Methoden zur kontinuierlichen Messung von verschiedenen Parametern ein­ gesetzt werden können.
• Literatur:
  Luepke. M. P. 1982; embryo toxicity testing of cosmetic ingredients by H. E. T.; Reprints 12. Int. Congress IF. SC. C. Paris.

Claims (4)

1. Verfahren zur Kultivierung des Geflügelembryos zum Nachweis z. B. der Toxizität von Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Embryogenese vom Nullten Tag der Bebrutung nach Entfernen der Eischale uns der Eimenbranen induziert wird, wobei das befruchtete Ei in einen temperierten Behälter gefüllt wird, der durch eine Wasserdampf durchlässige Membran abgeschlossen ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran nach Ausbildung der Herzaktivität und der Blutgefäße perforiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, daß die Membran aus Zellophan besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, daß die Membran eine Wasserdampfdurchlässigkeitsrate aufweist, die der gesamten Oberfläche der Eischale entspricht.