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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur automatisierten Toxizitätsprüfung von Substanzen an einer Gesamtheit von befruchteten Geflügeleiern nach Anspruch 1 und ein Verfahren hierfür nach Anspruch 9.
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Toxizitätsprüfungen von Substanzen an Hühnerembryonen sind bekannt. Die
DE 35 30 336 A1 beschreibt ein Verfahren, bei dem der Embryo aus dem Ei entnommen und in eine künstliche Umgebung verbracht wird, in der die Verhältnisse und Bedingungen innerhalb des Eis nachgebildet werden. Das dort offenbarte Verfahren ermöglicht die Feststellung der Toxizität durch Veränderungen der Morphologie im Wesentlichen nur in einem einzelnen Embryo und erlaubt daher keine signifikante statistische Auswertung.
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Die japanische Druckschrift
JP 2004 - 101 204 A , die deutsche Offenlegungsschrift
DE 10 2014 010 150 A1 und die deutsche Patentschrift
DE 10 2012 016 911 B3 offenbaren verschiedene Methoden zum Durchleuchten und Prüfen von Hühnereiern.
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Problematisch ist allerdings, dass Toxizitätsprüfungen an biologischen Systemen, d.h. also insbesondere an Geflügeleiern, nur dann aussagekräftige Ergebnisse liefern, wenn diese an einer Vielzahl von Einzelproben ausgeführt werden, wobei dabei eine statistische Auswertung in Verbindung mit umfangreichen Vergleichstests bei einer möglichst großen und statistisch relevanten Gesamtheit erfolgen muss. Dies bringt einen außerordentlich hohen Arbeits- und Versuchsaufwand mit sich, weil jedes einzelne Geflügelei letztlich von Hand geprüft, beurteilt und dessen Zustand in entsprechenden Versuchsprotokollen verfolgt werden muss. Dies ist zeit- und personalaufwändig und außerdem fehlerträchtig, wodurch die Vorteile bei der Verwendung von Geflügeleiern stark relativiert werden.
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Die
US 2008 / 0 289 578 A1 offenbart ein Verfahren zur schnellen und genauen Lokalisierung von Blastodermen in Geflügeleiern. Gegenstand der Druckschrift ist die nichtinvasive Ermittlung der Lage einer Keimscheibe (des Blastoderms) in Geflügeleiern. Das dort gelehrte Verfahren umfasst das Öffnen des Geflügeleies und des nachfolgenden Betrachtens des Inneren des Geflügeleies mittels verschiedener Nachweismethoden und Nachweistechniken. Die Druckschrift lehrt weiter das Fixieren der zu prüfenden Geflügeleier innerhalb einer Haltevorrichtung.
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Die
EP 2 505 217 A2 offenbart ein automatisiertes System zum Sammeln biologischer Proben und ein entsprechendes Verfahren. Die Druckschrift lehrt eine Anordnung und ein Verfahren, mit dem eine Vielzahl von Geflügeleiern untersucht und in ihren Eigenschaften und Veränderungen während ihrer Entwicklung überwacht werden können. Vorgesehen sind dort Trägervorrichtungen für eine Vielzahl von Geflügeleiern, eine Inkubatoreinheit sowie Mittel und Vorrichtungen zum Öffnen der Eier, zum Überwachen der Eier und zum Zuführen von Substanzen in das Innere der Eier.
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Die
US 7 249 569 B2 offenbart ein Verfahren zum Injizieren von Geflügeleiern. Die Druckschrift lehrt Verfahrensschritte, mit denen Geflügeleier mit einem frühen Embryo, d.h. insbesondere das Blastoderm, mit einer Substanz beimpft werden können. Gemäß Abwandlungen können hiermit auch chimärische oder transgene Geflügelembryos in ovo erzeugt werden.
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Die
WO 2015 / 058 076 A1 offenbart ein selektives, eine embryonische Struktur anzielendes und eine Substanz zuführendes Gerät. Vorgesehen sind dort verschiedene Ausführungsformen, die eine Trägervorrichtung für mehrere Geflügeleier sowie mechanische Mittel zum Öffnen, zum Beimpfen und zum Verschließen der Eier enthalten. Offenbart ist in der Druckschrift insbesondere ein für ein Labor vorgesehenes System, bei dem eine Gesamtheit von Geflügeleiern von einer Station zu einer nächsten Station bewegt wird.
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Die bekannten Vorrichtungen weisen einen komplexen Aufbau auf, der insbesondere sehr viel Raum in Anspruch nimmt.
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Es besteht daher die Aufgabe, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, mit dem Toxizitätsprüfungen an einer Vielzahl von Geflügeleiern mit einem Minimum an zeitlichem und personellem Aufwand ausgeführt werden können. Insbesondere besteht die Aufgabe, eine Vorrichtung zur automatisierten Toxizitätsprüfung an befruchteten Geflügeleiern und ein entsprechendes Verfahren anzugeben, bei denen ein platzsparender Aufbau gewährleistet wird und bei dem innerhalb dieses kompakten Aufbaues sämtliche auszuführende Manipulationen an der Gesamtheit der Geflügeleier auf engem Raum und somit auch in Laboren mit beschränktem Raum mit einer hinreichend großen Gesamtheit an Eiern ausführen können.
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Die Aufgabe wird mit einer Vorrichtung zur automatisierten Toxizitätsprüfung von Substanzen an einer Gesamtheit von befruchteten Geflügeleiern mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und verfahrensseitig mit einem Verfahren zur Toxizitätsprüfung einer Substanz mit den Merkmalen des Anspruchs 10 gelöst. Die Unteransprüche enthalten zweckmäßige Ausgestaltungen der Vorrichtung bzw. des Verfahrens.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist zur automatisierten Toxizitätsprüfung von Substanzen an einer Gesamtheit von befruchteten Geflügeleiern ausgebildet, wobei die Vorrichtung als ein kompaktes Gerät mit folgenden in einem gemeinsamen Gehäuse vereinigten Einheiten ausgebildet ist:
- Es ist mindestens eine Probenaufnahmeeinheit zur Aufnahme der Gesamtheit der befruchteten Geflügeleier vorgesehen, wobei jedes der Geflügeleier einen eindeutig identifizierbaren und adressierbaren Ort aufweist.
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Weiterhin ist eine die Probenaufnahmeeinheit umgebende Klimakammer mit einem Heiz- und Belüftungssystem vorgesehen. Die Vorrichtung verfügt außerdem über innerhalb der Klimakammer befindliche Komponenten für eine Nachweiseinheit für eine embryonale Herzfrequenz oder Vitalparametern an jedem Geflügelei mit einer Nachführeinrichtung zum Positionieren der Nachweiseinheit an jedem Geflügelei, wobei die Nachweiseinheit eine Vorrichtung zum Öffnen eines Geflügeleies und/oder zur Substanzbeimpfung des Geflügeleies enthält.
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Weiterhin ist eine Auswerteeinheit zum Verarbeiten der von der Nachweiseinheit ermittelten Daten und zum Ausführen einer statistischen Auswertung an der Gesamtheit der befruchteten Gefügeleier vorgesehen. Die Vorrichtung verfügt außerdem über eine Steuereinheit zur Betriebssteuerung der Nachweiseinheit und des Heiz- und Belüftungssystems sowie über eine Ausgabeeinheit zum Ausgeben der Ergebnisse der statistischen Auswertung.
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Der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt somit die Idee zugrunde, ein einheitliches, kompaktes Gerät vorzusehen, das die Toxizitätsprüfung an einer vorgegebenen Vielzahl von Geflügeleiern automatisch ausführt. Der Anwender bestückt anfänglich das Gerät mit der erforderlichen Anzahl befruchteter Geflügeleier, während sein späteres Eingreifen für die Versuchsdurchführung nicht mehr benötigt wird und die Toxizitätsprüfung selbsttätig erfolgt. Das Gerät enthält alle Komponenten, die für die Ausführung der Toxizitätsprüfung erforderlich sind, insbesondere eine Klimakammer zum Inkubieren der Geflügeleier und eine automatisch betriebene Nachweiseinheit, mit der Vitalparameter an jedem Geflügelei abgeleitet und registriert werden können. Eine interne Auswerteeinheit ist zur Speicherung und Verarbeitung der gewonnenen Daten vorgesehen und eine Anzeigeeinheit zeigt das Resultat der Toxizitätsprüfung an.
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Das Gerät ist somit so ausgebildet, dass der Anwender letztlich nur die Geflügeleier einschieben muss, während ihm am Ende nach dem Ablauf einer vorbestimmten Versuchszeit das Ergebnis der Prüfung angezeigt wird. Der Anwender wird also durch die automatisierte Vorrichtung vollständig von der mühsamen Kleinarbeit der Versuchsdurchführung befreit und es werden objektive Versuchsbedingungen durch die Vorrichtung in einem hohen und leicht reproduzierbaren Maße sichergestellt.
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Bei einer Ausführungsform ist die Probenaufnahmeeinheit als ein Array aus Einzelfächern ausgebildet, wobei das Array mittels eines motorgetriebenen Antriebs aus der Klimakammer heraus und/oder hereinfahrbar ist. In einem solchen Fall muss der Anwender die Vorrichtung mit den Geflügeleiern lediglich bestücken.
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Das Heiz- und Belüftungssystem ist bei einer Ausführungsform im oberen Bereich der Klimakammer angeordnet, wobei eine Filterlüftereinheit aus einer Anordnung aus mindestens einem Lüfter und einer den Luftstrom filtrierenden Sterilmatte vorgesehen ist.
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Bei einer Ausgestaltung ist das Heiz- und Belüftungssystem als eine Filterlüftereinheit zum Realisieren eines zirkulierenden Luftsstromes ausgebildet, wobei durch die Filterlüftereinheit ein Luftstrom aus einem Ansaugkanal angesaugt wird, anschließend in die Klimakammer geleitet wird und über eine Ausleitföffnung zurück in den Ansaugkanal gelangt. Hierdurch kann das in der Vorrichtung zirkulierende Luftvolumen nachhaltig reguliert und in seinen Eigenschaften beeinflusst werden.
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Bei einer Ausgestaltung weist der Ansaugkanal eine nach außen führende Öffnung für einen geregelten Frischluftzutritt auf. Das in der Klimakammer zirkulierende Luftvolumen kann hierdurch kontrolliert mit Frischluft angereichert und innerhalb bestimmter Parameterintervalle in seinen Eigenschaften modifiziert oder schrittweise ausgetauscht werden.
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Bei einer Ausführungsform ist die Nachweiseinheit als eine Bilderfassungsvorrichtung mit einer auf jedes einzelne Geflügeleil absenkbaren Kameraeinheit mit einer nachgeschalteten Bildauswerteeinheit ausgebildet. Die Kamera kann somit sukzessive alle Geflügeleier innerhalb der Vorrichtung anfahren, abtasten und die dabei gewonnenen Bilddaten an eine nachfolgende Auswerteeinheit zur automatischen Auswertung übergeben.
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Bei einer Ausführungsform ist die Nachweiseinheit als eine Ultraschalldetektorvorrichtung mit einem auf jedes einzelne Geflügelei absenkbaren Detektorkopf ausgebildet.
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Die Auswerteeinheit enthält zweckmäßigerweise eine Speichereinrichtung zum Erfassen und Speichern der über die Nachweiseinheit erfassten Daten über die Zustände der Geflügeleier und einen Algorithmus für eine statistische Auswertung der erfassten Daten.
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Bei einer Ausführungsform enthält die Nachweiseinheit eine Vorrichtung zum Öffnen eines Geflügeleies und/oder zur Substanzbeimpfung des Geflügeleies. Bei einer derartigen Ausgestaltung muss der Anwender letztlich nur die Vorrichtung mit Geflügeleiern bestücken, während sämtliche folgende Versuchsschritte, beginnend mit der Beimpfung und/oder der Öffnung der Geflügeleier automatisiert und ohne dessen Zutun ablaufen können.
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Ein Verfahren zur Toxizitätsprüfung einer Substanz erfolgt mit folgenden Verfahrensschritten, wobei die Verfahrensschritte automatisiert in einer Vorrichtung zur Toxizitätsprüfung innerhalb einer Klimakammer ausgeführt werden:
- Es erfolgt ein Bereitstellen einer Gesamtheit befruchteter Geflügeleier und ein Inkubieren der Geflügeleier in der Klimakammer. Anschließend erfolgen ein Öffnen der Geflügeleier an einem Segment und ein Beimpfen des Inneren des jeweiligen Geflügeleies mit der zu prüfenden Substanz und/oder einer Vergleichssubstanz durch innerhalb der Klimakammer befindliche Komponenten für eine Nachweiseinheit. Danach werden die geöffneten und beimpften Geflügeleier mit einem durchsichtigen Material verschlossen. Die beimpften Geflügeleier werden nachfolgend inkubiert und es erfolgt ein Überwachen mindestens jeweils eines Vitalparameters der Embryonen im Inneren der Geflügeleier durch die Nachweiseinheit. Es erfolgt eine statistische Analyse der überwachten Vitalparameter über der Gesamtheit der inkubierten und beimpften Geflügeleier.
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Grundsätzlich wird die Toxizitätsprüfung an praktisch unversehrten Geflügeleiern ausgeführt, wobei lediglich ein kleines Segment der Schale entfernt wird, um die Substanz bzw. die Vergleichssubstanz in das Geflügelei einzubringen.
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Das Beimpfen des Inneren des Geflügeleies wird bei einer Verfahrensgestaltung durch ein Beimpfen des Blastoderms des Embryos ausgeführt.
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Als ein überwachter Vitalparameter der Embryonen wird bei einer Ausführungsform jeweils die Herzfrequenz der Embryonen registriert. Dieser Parameter ist besonders einfach und eindeutig zu messen.
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Die Überwachung der Herzfrequenz der Embryonen kann auf unterschiedliche Weise erfolgten. Die Überwachung der Herzfrequenz der Embryonen erfolgt über eine optische Erfassung, insbesondere eine Bildverarbeitung und/oder über eine Erfassung mittels einer Ultraschalldetektion.
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Die bei dem Verfahren ausgeführten Verfahrensschritte können insbesondere automatisiert in einer Vorrichtung zur Toxizitätsprüfung ausgeführt werden.
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Die Vorrichtung und das Verfahren sollen nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Zur Verdeutlichung dienen die beigefügten 1 bis 8. Es werden für gleiche bzw. gleichwirkende Teile dieselben Bezugszeichen verwendet.
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Es zeigt:
- 1 eine Gesamtansicht der Vorrichtung zur Toxizitätsprüfung,
- 1a eine Darstellung der Vorrichtung aus 1 in einem Teilschnitt,
- 2 eine Schnittdarstellung der Vorrichtung in einer Seitenansicht,
- 3 eine Darstellung der Zuführung von Geflügeleiern in die Vorrichtung,
- 4 eine Darstellung der Komponenten der Vorrichtung zur Toxizitätsprüfung in einer geöffneten, perspektivischen Ansicht,
- 5 eine weitere Darstellung der Komponenten der Vorrichtung zur Toxizitätsprüfung,
- 6 eine beispielhafte Darstellung der Funktionsweise der Nachweiseinheit,
- 7 eine perspektivische Ansicht einer Rückseite der Vorrichtung zur Toxizitätsprüfung,
- 8 eine beispielhafte Detaildarstellung der Bilderfassung in der Nachweiseinheit zusammen mit einem Geflügelei.
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1 zeigt eine beispielhafte Gesamtansicht der Vorrichtung zur Toxizitätsprüfung, 1a in Verbindung damit eine teilweise Schnittdarstellung der Vorrichtung.
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Die in 1 gezeigte Anordnung zeigt ein gegenüber der Umgebung vollständig gekapseltes, für die Sicherung steriler Bedingungen ausgelegtes Handhabungssystem mit geschützter Aktorik. Diese ist wie im Folgenden dargestellt über einem im Inneren der gekapselten Anordnung angeordneten Probenbereich installiert. In Verbindung mit einem optischen System oder anderer geeigneter Messsysteme, wie insbesondere Ultraschalldetektionen wird eine Kontrolle der Proben durchgeführt. Die Proben liegen als befruchtete Geflügeleier vor.
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Der gesamte Bereich ist als eine Klimakammer ausgeführt. Diese sichert die Sterilität, eine optimale Temperatur und eine optimale Feuchte zum Inkubieren der Geflügeleier.
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Die Kapselung des Gesamtsystems erfolgt durch ein Gehäuse 1, welches die Trennung gegenüber Umgebungseinflüssen sichert und damit die Funktion einer Dämmung und Dichtung übernimmt. Die Vorrichtung weist eine Einschuböffnung 2 zum Einschieben einer Probenaufnahmeeinheit 3 auf. Die Probenaufnahmeeinheit kann mit einer definierten Anzahl von Geflügeleiern 4 bestückt werden. Die Geflügeleier befinden sich innerhalb der Probenaufnahmeeinheit an eindeutig definierten und adressierbaren Orten. Zweckmäßigerweise sind die Geflügeleier matrixartig positioniert und damit nach Zeilen und Spalten geordnet.
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Der von dem Gehäuse umschlossene Innenraum der Vorrichtung bildet eine Klimakammer 5. In einem Teil des von dem Gehäuse umschlossenen Innenraums sind Komponenten für ein Heiz- und Belüftungssystem 6 vorgesehen, mit dem die Temperatur, die Luftfeuchte und eine hinreichende Sterilität in der Klimakammer sichergestellt werden können.
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Im Inneren des Gehäuses und damit im Bereich der Klimakammer befinden sich außerdem Komponenten für eine Nachweiseinheit 7, über die der Zustand jedes Geflügeleies 4 einzeln detektiert werden kann. Die Nachweiseinheit kann definiert über die Gesamtheit der in der Probenaufnahmeeinheit befindlichen Geflügeleier bewegt werden. Wegen der definierten Position der Geflügeleier kann jedes einzelne Geflügelei von der Nachweiseinheit gezielt angefahren werden, sodass sich der Zustand jedes Gefügeleies einzeln erfassen lässt.
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Die Vorrichtung weist ebenso eine im Inneren des Gehäuses angeordnete Auswerteeinheit zum Verarbeiten der von der Nachweiseinheit erfassten Mess- und Prüfdaten der einzelnen Gefügeleier auf. Es ist weiterhin eine Steuereinheit vorgesehen, die zur Betriebssteuerung der Nachweiseinheit und des Heiz- und Belüftungssystems dient. Eine Ausgabeeinheit, im hier vorliegenden Beispiel ein Bildschirm 8, ermöglicht eine Anzeige der Ergebnisse der statistischen Auswertungen der von der Nachweiseinheit ermittelten und von der Auswerteeinheit und der Steuereinheit verarbeiteten Messdaten.
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Wie 1 im Zusammenhang mit 1a zeigt, ist die Vorrichtung als ein kompaktes, einheitliches und nach außen hin abgeschlossenes Gerät ausgebildet, das insbesondere einen automatisierten Betrieb erlaubt. Das Gerät ist beispielsweise etwa 60 cm lang, etwa 40 cm breit und etwa 40 cm hoch und daher in die Einrichtung eines Labors integrierbar.
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Die Klimakammer bildet ein integriertes Umluftsystem für Befeuchtungen und Temperierungen der Luft. Das Nachweissystem ist zweckmäßigerweise als ein Handlingsystem in Form eines Dreiachssystems ausgebildet, dessen Aktorik sicher geschützt ist und eine ausreichende Sicherung der Sterilität sowie hinreichende Reinigungsmöglichkeiten erlaubt. In Verbindung mit den durch die Nachweiseinheit bereitgestellten Beobachtungs- und Auswertewerkzeugen ist damit ein Gesamtsystem gegeben, dass mit einer entsprechenden Betriebs- und Auswertesoftware betrieben wird.
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2 zeigt eine Schnittdarstellung der Vorrichtung in einer Seitenansicht zusammen mit einer schematischen Darstellung der Luftzirkulation und grundlegenden Betriebssteuerungen. Das Heiz- und Belüftungssystem ist als ein Umluftsystem ausgebildet, dem periodisch Frischluft zugeführt wird. Vorgesehen sind hierzu beispielsweise eine Reihe von Lüftern 9, die sich über der Gesamtheit der Geflügeleier 4 im Inneren des Gehäuses 1 befinden. Diese erzeugen einen Luftstrom, der durch eine Sterilmatte 10 auf die Geflügeleier geleitet wird. Die Lüfter und die Sterilmatte bilden eine Filterlüftereinheit. Der Luftstrom bewegt sich durch die Gesamtheit der Geflügeleier hindurch und umspült diese. Die Probenaufnahmeeinheit 3 kann hierzu mit entsprechenden Durchbrüchen ausgebildet oder gestell- bzw. skelettartig ausgebildet sein, um für den Luftstrom durchlässig zu sein.
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Der Luftstrom bewegt sich durch die Klimakammer 5 und verlässt diese über eine Ausleitöffnung 11. Er gelangt anschließend in einen Ansaugkanal 12. Der Ansaugkanal enthält eine Heizung 13 sowie einen Befeuchter 14. Hierdurch wird der Luftstrom temperiert und entsprechend befeuchtet, bevor dieser wieder über die Filterlüftereinheit in die Klimakammer zurück gelangt.
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Die in der Klimakammer vorliegenden Bedingungen werden durch eine hier aus Übersichtsgründen außerhalb der Vorrichtung dargestellte Klimakammerregelung 15 geregelt. Die Klimakammerregelung empfängt Ist-Werte von einer Reihe von Feuchtesensoren 16 und Temperatursensoren 17 und gleicht diese mit internen und vorgegebenen Soll-Werten ab und gibt Steuersignale an die Heizung 13 sowie den Befeuchter 14 aus. Die Klimakammerregelung ist ein Teil der Steuereinheit und ebenfalls innerhalb des Gehäuses 1 untergebracht und somit in das Gerät integriert.
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3 zeigt einen beispielhaften Beschickungsvorgang der Vorrichtung. Eine definierte Anzahl Geflügeleier 4, die vorhergehend befruchtet worden sind, werden in der Probeaufnahmeeinheit 3 platziert. In dem hier vorliegenden Beispiel werden diese in dafür vorgesehene Vertiefungen eingesetzt. Die Probeaufnahmeeinheit 3 wird in dem hier gezeigten Beispiel danach durch die Einschuböffnung 2 in die Klimakammer 5 eingeschoben. Die Einschuböffnung 2 wird geschlossen und die Vorrichtung wird in Betrieb genommen.
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Das Heiz- und Belüftungssystem wird vor Beginn des Testzyklus mit der Initialisierung des Gerätes gemäß den vorgegebenen Parametern in Betrieb gesetzt. Die entsprechenden Parameter können über den Bildschirm 8, der hierzu beispielsweise als ein Touchscreen ausgebildet ist, vorgegeben werden. Die Vorrichtung wird sodann geschlossen und über einen vorbestimmten Zeitraum betrieben.
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Zweckmäßigerweise wird bei der Inbetriebnahme der Vorrichtung zunächst eine automatische Initialisierung vorgenommen. Die Nachweiseinheit 7 fährt hierzu alle in der Probenaufnahme 3 eingesetztem Geflügeleier einzeln an und speichert deren Position sowie deren Anfangszustand in einem internen Datenspeicher der Vorrichtung.
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Während der Zeit des Betriebs der Vorrichtung läuft die Inkubation der Embryos innerhalb der Geflügeleier ab, während die Nachweiseinheit 7 den Entwicklungsverlauf jedes Embryos registriert und innerhalb der Auswerteeinheit und der Steuereinheit die entsprechenden Daten gespeichert und statistisch ausgewertet werden.
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4 zeigt eine perspektivische Ansicht der Vorrichtung mit vollständig entferntem Gehäuse. Zu erkennen sind hier die Lüfter 9, die Ausleitöffnung 11, der Abluftkanal 12 sowie die Klimakammerregelung 15 als ein Teil der Steuereinheit der Vorrichtung. Die Probenaufnahmeeinheit 3 sowie die Geflügeleier 4 sind ebenfalls dargestellt. Der oben erwähnte Strom der umgewälzten Luft innerhalb der Klimakammer ist ebenfalls durch Pfeile angedeutet. Verschiedene Trennwände sind dafür vorgesehen, dass der Luftstrom von den Lüftern in den Probenraum und über eine Öffnung in der Rückwand zurück in den Ansaugkanal der Lüfter geführt wird, ohne dabei den Bereich der Steuerung räumlich zu tangieren.
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5 zeigt eine weitere Ansicht der Komponenten. Zu sehen sind hier insbesondere die Sterilmatte 10 und die Anordnung der Lüfter 9, die zusammen die Filterlüftereinheit bilden. Unmittelbar darunter befindet sich die Nachweiseinheit 7. In 6 ist zu erkennen, dass die Nachweiseinheit 7 über eine Positioniervorrichtung 18 bewegt werden kann. Die Positioniervorrichtung 18 weist einen Verfahrweg in X- und einen Verfahrweg in Y-Richtung auf. Diese werden jeweils von einem Schrittmotor und entsprechenden Antrieben bewegt. Zusätzlich ist noch ein Antrieb in Z-Richtung vorgesehen. Über diesen Antrieb kann die Nachweisvorrichtung jeweils auf eines der darunter befindlichen Geflügeleier 4 abgesenkt werden. Die Verfahrwege der Positioniervorrichtung sind dabei auf das Raster angepasst, das durch die Probenaufnahmeeinheit vorgegeben ist. Über genaue Vorgaben der X- sowie der Y-Koordinate oder entsprechende Nummerierungen von Zeilen und Spalten lassen sich somit sämtliche Geflügeleier einzeln adressieren und es können Teilensembles aus der Gesamtheit der innerhalb der Vorrichtung analysierten Geflügeleier definiert werden, die bei der Versuchsdurchführung jeweils einzelnen Gruppen, beispielsweise Vergleichs- und Kontrollgruppen, zugeordnet werden können.
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Die Definitionen und Festlegungen der Teilensembles können durch den Anwender beliebig vorgenommen werden. Dies erfolgt in besonders einfacher Weise durch Intervallvorgaben über die Positionen auf der Probenaufnahmeeinheit.
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7 zeigt die Positionen der Steuerkomponenten innerhalb der Vorrichtung. Bei dem hier gezeigten Beispiel sind diese von der Klimakammer abgeschirmt. Vorgesehen sind hier insbesondere die Klimakammerregelung 15 als Teil einer umfassend ausgebildeten Steuereinheit 20 sowie diverse Antriebsmittel 21 für die Positioniervorrichtung 18. Vorgesehen sind außerdem eine Reihe von Anschlüssen und Schnittstellen 20a, über die Betriebs- und Messdaten von der Vorrichtung extern abgefragt werden können oder über die eine Fernsteuerung der Vorrichtung möglich ist. Zu erkennen ist ebenfalls der Ansaugkanal 12 mit der Heizung 13 und dem Befeuchter 14 sowie die Abführöffnung 11.
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Nachfolgend soll auf das mit der Vorrichtung ausgeführte vollautomatische Nachweisverfahren und die damit verbundene Toxizitätsprüfung näher beispielhaft eingegangen werden.
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Das Nachweisverfahren besteht darin, dass mehrere befruchtete Geflügeleier in einem bestimmten Entwicklungsstatus, der sich zum Beispiel aus morphologischen Eigenschaften und Kriterien ergibt, nach einer anfänglichen Inkubation bei 38°C im oberen Segment geöffnet werden. Dies erfolgt durch einen Vorgang, der umgangssprachlich als ein „Köpfen“ der Eierschale zu verstehen ist. Über das Blastoderm, d.h. die „Eiaußenhaut“, wird das zu testende Mittel bei einer bestimmten Zahl von Embryonen in bestimmten Konzentrationen in Form definierter Verdünnungsstufen eingegeben. Die so präparierten Geflügeleier werden in einem ersten Abschnitt der Probenhalterung platziert. Der Steuereinheit werden die Positionen der so präparierten Geflügeleier durch die Eingabe bestimmter Intervalle übermittelt. Dies erfolgt beispielsweise in Form einer Anweisung:
- Gruppe G1, Intervall Reihe 1 bis 4, Zeile 1 bis 4,
- Gruppe G2, Intervall Reihe 5 bis 7, Zeile 1 bis 4 usw.
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Zur Negativkontrolle wird eine Behandlungs-Testgruppe mit dem Verdünnungsmittel allein, d.h. ohne die zu testende Substanz, behandelt. Diese Eier werden ebenfalls auf der Probenhalterung platziert, wobei die Positionen der so präparierten Geflügeleier ebenfalls durch die Eingabe bestimmter Intervalle an die Steuereinheit übermittelt wird. Dies erfolgt beispielsweise in Form einer Anweisung, die folgendermaßen ausgeführt sein kann:
- Gruppe V1, Intervall Reihe 1 bis 4, Zeile 5 bis 7,
- Gruppe V2, Intervall Reihe 5 bis 7, Zeile 5 bis 7 usw.
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Die Eingabe der Positionen erfolgt bespielsweise über den an der Vorrichtung angeordneten Touchscreen 8 über eine Menüsteuerung oder einen gerätespezifischen Code. Optional kann aber auch eine Tastatur angeschlossen werden oder an dem Gerät fest installiert sein.
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Es können auch mehrere derartige Vorrichtungen über eine zentrale Fernsteuerung zusammengeschaltet werden. Hierdurch lassen sich prinzipiell beliebig große Gesamtheiten von Geflügeleiern 4 aus mehreren Probeaufnahmeeinheiten überwachen und auswerten, die außerdem über verschiedene Geräte adressiert werden können. Die Steuereinheiten und die Auswerteeinheiten der einzelnen Geräte werden dabei von einer externen übergeordneten Steuereinheit beeinflusst. Mehrere der hier beschriebenen Geräte können somit in modularer Weise zu einem virtuellen Großgerät vereinigt werden.
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Nach dem „Köpfen“ werden die Eier der Embryonen mit durchsichtigem Material verschlossen und über einen bestimmten Zeitraum innerhalb der Klimakammer inkubiert. Die Kontrolle des Überlebens der Embryonen wird über die Bewegung des Herzens des Embryos im inneren des Eis kontrolliert. Dies geschieht vollautomatisch, wobei die Steuereinheit die Positioniervorrichtung der Nachweiseinheit nacheinander auf jedes der in der Klimakammer befindlichen Geflügeleier einstellt und die Nachweiseinrichtung auf das gewählte Ei herabsenkt. Die Kontrolle der Bewegungen des Embryos, insbesondere der Herzbewegungen, kann über eine optische Kontrolle und Auswertung oder eine Ultraschallmessung erfolgen.
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Die Nachweiseinheit erfasst die Herzbewegungen automatisch mittels einer Bilderfassung, wobei das erfasste Bild in der Auswerteeinheit verarbeitet wird und die den Herzbewegungen des Embryos entsprechenden Pixelveränderungen registriert und ausgewertet werden. Daraus ergibt sich in direkter Weise die Anzahl der Herzschläge innerhalb eines definierten Zeitraums und somit die Herzfrequenz. Die ermittelten Daten werden gespeichert und dem für die jeweilige Gruppe ermittelten statistischen Material hinzugefügt. Es ist klar, dass hier auch zeitliche Verlaufskurven ermittelt werden können.
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Die statistische Auswertung kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Insbesondere können die Überlebensraten in einer so genannten Kaplan-Meier Kurve dargestellt werden. Die Auswertung der Kaplan-Mayer-Kurve ergibt in Form einer statistischen Analyse die Überlebensrate der Negativgruppe und die der Gruppen mit steigender Konzentration. Aus dieser statistischen Analyse lässt die die toxische Wirkung des Mittels nachweisen oder ausschließen. Das Öffnen der Eier und Eingeben des verdünnten Testmediums kann auch durch geeignete technische Mittel innerhalb des automatischen Systems integriert werden.
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8 zeigt eine beispielhafte Nachweiseinheit 7, die auf einer optischen Erfassung aufbaut. Das Geflügelei 4 ist in dessen oberen Segment geköpft, d.h. dessen Schale ist in diesem Bereich entfernt, sodass das Innere des Eis direkt beobachtbar ist. Das Geflügelei enthält einen Embryo 23 mit einem optisch eindeutig identifizierbaren Herz 24. Das Geflügelei befindet sich in der Probenaufnahmevorrichtung, die hier allerdings nicht dargestellt ist.
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Die Nachweiseinheit enthält ein Objektiv 26 sowie ein CCD-Array 27 oder eine andere Einrichtung zum Empfangen von Bildinformationen. Es ist bei einer einfachsten Variante des Verfahrens nicht notwendig, die genaue Herzform des Embryos zu erfassen, die Nachweiseinheit muss jedoch die periodischen morphologischen Veränderungen registrieren, die durch das schlagende Herz des Embryos verursacht werden. Sofern diese Periodizität klar detektiert werden und durch die Auswerteeinheit nachgewiesen und gezählt werden kann, ist die Detektion der Herzfrequenz grundsätzlich ausgeführt und kann ausgewertet werden.
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Bei einer weiteren Ausführungsform der Nachweiseinheit ist diese als eine Ultraschalleinrichtung ausgeführt. In einem solchen Fall ist in der Nachweiseinheit ein Ultraschallgeber vorgesehen, der über einen an dessen zum Ei hin gerichteten Ende angeordneten Schallkopf Ultraschallsignale in das Innere des Geflügeleies einkoppelt. Die Einkopplung kann beispielsweise so ausgeführt werden, dass der Schallkopf an die Bedeckung der geköpften Spitze des Geflügeleies geführt wird. Anschließend lässt sich die Herzbewegung durch die Auswertung eines Dopplersignals detektieren, das dem reflektierten Ulstraschallsignal aufgeprägt ist und somit aus dem Signal abgeleitet werden kann.
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Bei einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung zur Toxizitätsprüfung ist zusätzlich eine Vorrichtung zum Öffnen der Geflügeleier vorgesehen. Diese kann beispielsweise in Form eines Hohlrohres ausgebildet sein, welches auf den oberen Pol des Geflügeleies aufgesetzt wird. Anschließend wird das Hohlrohr mit Vibrationen beaufschlagt, die zu einem regelmäßigen Bruch der Schales des Geflügeleies an dem Kontakt zwischen Rohr und Ei führen. Das Innere des Rohres wird anschließend unter einen Unterdruck gesetzt und das losgelöste Segment der Eierschale wird dabei angesaugt und somit von dem Ei abgehoben, wodurch das Ei geöffnet und das Innere des Eis einer direkten Betrachtung zugänglich wird.
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Die Vorrichtung und das Verfahren wurden anhand beispielhafter Ausführungsformen erläutert. Im Rahmen fachmännischen Handelns sind weitere Ausgestaltungen möglich. Diese ergeben sich auch aus den Unteransprüchen.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Gehäuse
- 2
- Einschuböffnung
- 3
- Probenaufnahmeeinheit
- 4
- Geflügelei
- 5
- Klimakammer
- 6
- Heiz- und Belüftungssystem
- 7
- Nachweiseinheit
- 8
- Anzeige, Touchscreen
- 9
- Lüfter
- 10
- Sterilmatte
- 11
- Ausleitöffnung
- 12
- Ansaugkanal
- 13
- Heizung
- 14
- Befeuchter
- 15
- Klimakammerregelung
- 16
- Feuchtesensoren
- 17
- Temperatursensoren
- 18
- Positioniervorrichtung
- 20
- Steuereinheit
- 21
- Antriebsmittel für Positioniervorrichtung
- 23
- Embryo
- 24
- Herz
- 25
- Lichtquelle
- 26
- Objektiv
- 27
- CCD-Array
