DE3327306C2

DE3327306C2 -

Info

Publication number: DE3327306C2
Application number: DE3327306A
Authority: DE
Inventors: Anastasia Nikolaevna Danilina; Inessa Vasil'evna Aleksandrova; Anatolij Aleksandrovic Moskau/Moskva Su Skladnev; Inna Vasil'evna Gazoprovod Moskvoskaja Oblast' Su Nikitina; Anna Petrovna Moskau/Moskva Su Mednikova; Valentina Vasil'evna Kirov Su Durova
Original assignee: VSESOJUZNYJ NAUCNO-ISSLEDOVATEL'SKIJ BIOTECHNICESKIJ INSTITUT MOSKAU/MOSKVA SU
Current assignee: VSESOJUZNYJ NAUCNO-ISSLEDOVATEL'SKIJ BIOTECHNICESKIJ INSTITUT MOSKAU/MOSKVA SU
Priority date: 1983-07-28
Filing date: 1983-07-28
Publication date: 1988-06-30
Also published as: DE3327306A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von biologischen Wirkstoffen aus der Biomasse der Gewebekultur von Ginseng. Diese Wirkstoffe können in der Parfüm- und Nah rungsmittelindustrie sowie zur Herstellung von Arzneimit teln verwendet werden. Der Anspruch 2 meint eine Ausgestaltung der Erfindung.

Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von biologischen Wirkstoffen aus der Biomasse der Gewebekultur von Ginseng ("Fitochimieskÿ analiz tamma kul'tury tkani kornja en enja i standartizacÿa ego preparatov" Butenko R. G., Chre tonova T. I. u. a. "Rastitel'nye resursy" Band XV, S. 356, 1979).

Das Verfahren sieht folgende Maßnahmen vor. Zunächst stellt man ein festes Nährmedium von Murashige und Skoog, das Ki netin enthält, her. Dann bereitet man Gefäße für das Kulti vieren vor, und zwar wäscht man die Gefäße von Hand mit Waschmitteln, trocknet diese Gefäße in einem Trockenschrank 2 Stunden bei 140°C. Das Nährmedium wird in 250 ml-Gefäße zum Kultivieren jeweils 50 ml eingegossen. Die Sterilisation der Gefäße mit dem Nährmedium führt man in einem Autoklav bei 116°C innerhalb von 15 Minuten durch. Das Gewebe wird auf das Nährmedium in einem Gefäß umgepflanzt und in einen kon ditionierbaren Raum kultiviert. Die gewucherte Biomasse wird nach 30-60 Tagen abgenommen. Dabei wird ein Teil der Biomas se als Impfmaterial (Inokulum) verwendet, d. h. es wird in ein frisches Nährmedium derselben Zusammensetzung umgepflanzt. Die gewucherte Biomasse wird in einem Sublimationstrock nungsverfahren getrocknet. Danach erhält man aus dieser Biomasse Extraktivstoffe. Die Extraktion führt man mit 20 und 40%igem Ethanol durch.

Die Ausbeute an Extraktivstoffen beträgt dabei 40,88 bzw. 40,32%.

Bekannt ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Extrak tivstoffen aus der Biomasse der Gewebekultur von Ginseng, beschrieben im Bericht "Kul'tura tkani enenja" von R. I. Vysotskaja und I. I. Slepjan "Rastitel'nye resursy", Band XVI, Heft I, S. 123, 1980.

Dieses Verfahren zur Herstellung von Extraktivstoffen aus der Biomasse der Gewebekultur von Ginseng sieht dieselben Maßnahmen wie das oben beschriebene Verfahren vor, jedoch trocknet man in einem Trockenschrank bei 50°C. Die Ausbeute an Extraktivstoffen beträgt dabei 40,32%, bezogen auf die Ausgangsmenge.

Die oben beschriebenen Verfahren sind nur unter Laborbedin gungen durchführbar. Der Nachteil der genannten Verfahren besteht in einer niedrigen Ausbeute an Extraktivstoffen, da die Biomasse nach der Sublimationstrocknung ein flüchtiges und hygroskopisches Pulver darstellt, das beim Extrahieren quillt, wodurch die Extraktion erschwert wird. Das Trocknen im Trockenschrank gewährleistet kein gleichmäßiges Trocknen der Biomasse bis zur Erzielung der erforderlichen Feuchtig keit. Die aus dem getrockneten Produkt ausgeschiedene Feuch tigkeit sammelt sich allmählich im Innern des Schrankes und dies führt dazu, daß die Biomasse sauber und klumpig wird, wodurch die Extraktionsbedingungen erschwert werden. Darü ber hinaus sichert das Verfahren keine vollständige Steri lität aller Maßnahmen; daher kann die Biomasse in einigen Fällen durch fremde Mikroflora verunreinigt sein.

Die Literatur enthält keine Angaben über das großtechnische Kultivieren der Biomasse Ginseng.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von biologischen Wirkstoffen aus der Biomas se der Gewebekultur von Ginseng in einer Technologie zu ent wickeln, die es ermöglicht, biologische Wirkstoffe aus der Biomasse der Gewebekultur von Ginseng in großtechnischen Ver fahren zu entwickeln.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst.

Zum Schutz der Biomasse vor einer Verunreinigung durch frem de Mikroflora kann diese zweckmäßigerweise vor dem Extrahie ren 20 bis 30 Minuten mit UV-Strahlen bestrahlt werden.

Die vorliegende Erfindung wird wie folgt durchgeführt.
Man bereitet ein Nährmedium folgender Zusammensetzung zu:

Makronährstoffe nach Murashige und Skoog und
Mikronährstoffe nach Murashige und Skoog
Saccharose30 000 mg/l Thiaminhydrochlorid0,4 mg/l Meso-Inosit80 mg/l Kaseinhydrolysat500 mg/l Nikotinsäure1,5 mg/l-2,5 mg/l Naphthylessigsäure2 mg/l Agar-Agar6000 mg/l Fe-Chelat5 mg/l.

Zur Steigerung der Ergiebigkeit der Biomasse ist es zweck mäßig, das Impfmaterial vorher selektiv auszuwählen.

Man erhält das Impfmaterial aus der gemischten Biomasse der Gewebekultur von Ginseng durch Selektion nach der Wärmebe handlung des Gewebes bei 34 bis 38°C, das als eine über impfbare Kultur im Dunkeln bei 26°C und einem Feuchtigkeits gehalt von 70% mit einem Zuchtzyklus von 30 Tagen aufbewahrt wird, und das Kalluszellen mit einer Größe von 15 bis 20 und von 25 bis 50 µm enthält, die gleichzeitig zur Teilung fähige Polyploidzellen sind.

Es ist nicht zweckmäßig, die Wärmebehandlung oberhalb 38°C durchzuführen, da dies zum Absterben des Gewebes führt.

Das erhaltene Impfmaterial wird so inokuliert, daß ¹/₁₀ des Gesamtvolumens derselben Zusammensetzung in ein frisches Nährmedium und ⁹/₁₀ der Biomassewucherung in ein modifizier tes Nährmedium transplantiert wird, das sich von dem oben genannten Nährmedium dadurch unterscheidet, daß man in die sem statt Kinetin Nikotinsäure in einer Menge von 1,5 bis 2,5 mg/l einführt. Nach 30tägigem Kultivieren wird die Wu cherung der Biomasse unter sterilen Bedingungen entfernt, bei 51 bis 54°C bis zur Erzielung eines Feuchtigkeitsgehal tes von 7 bis 9% getrocknet; man extrahiert aus dieser Masse die erwünschten biologischen Wirkstoffe. Zum Schutze der Biomasse vor einer Verunreinigung durch fremde Mikroflora wird die Biomasse vor dem Extrahieren 20-30 Minuten mit UV-Licht bestrahlt. Die dadurch erhaltene Biomasse stellt hellgelbe poröse Stückchen mit unregelmäßiger Form dar, die beim Pulverisieren zerfallen. Der Feuchtigkeitsgrad der Bio masse beträgt höchstens 7-9%.

Das Kultivieren auf einem modifizierten Nährmedium vergrö ßert die Ausbeute an Biomasse bei einer gleichzeitigen Stei gerung der Ausbeute an biologischen Wirkstoffen um 30%.

Das Trocknen der Biomasse bis zur Erzielung eines Feuch tigkeitsgehaltes von 7-9% bewirkt ein vollständiges Extra hieren.

Beispiel 1

Herstellung eines Nährmediums, das

Makronährstoffe nach Murashige und Skoog
Mikronährstoffe nach Murashige und Skoog
Saccharose30 000 mg/l Thiaminhydrochlorid0,4 mg/l Meso-Inosit80 mg/l Kaseinhydrolysat500 mg/l Nikotinsäure1,5 mg/l-2,5 mg/l Naphthylessigsäure2 mg/l Agar-Agar6000 mg/l Fe-Chelat5 mg/l

enthält.

Das Nährmedium wird in sorgfältig gewaschene 250 ml-Flakons für das Kultivieren je 50 ml eingegossen.

Die vorher verkorkten Flakons werden sterilisiert, um Mikro organismen zu vernichten. Die Umpflanzung der gewucherten Biomasse der Gewebekultur von Ginseng führt man in einem sterilen Gefäß mit sterilen Instrumenten durch. Die Flakons werden verkorkt und in einen Raum für die Kultivierung über tragen, in dem eine Temperatur von 26°C, eine Feuchtigkeit von 70% und Dunkelheit herrscht. Der Kultivierungszyklus dauert 30 Tage. Einen Teil der Wucherung der Biomasse ver wendet man als Impfmaterial. Ein anderer Teil der Biomasse wird in ein modifiziertes Nährmedium umgepflanzt, das die obengenannten Komponenten in derselben Menge wie oben er wähnt enthält. Man führt jedoch in das Nährmedium statt Ki netin Nikotinsäure in einer Menge von 1,5 mg/l ein. Das Kul tivieren wird in einem konditionierten Raum innerhalb 30 Ta gen vorgenommen. Die Abnahme der gewucherten Biomasse führt man unter sterilen Bedingungen durch. Das Trocknen erfolgt in einer Trockenmaschine bei 51°C während 3 Stunden. Die Endfeuchtigkeit des Produktes beträgt dabei 9%. Das Extra hieren führt man mit 40%igem Ethanol bei einem Verhältnis von Rohstoff zu Extraktionsmittel gleich 1 : 10 durch.

Als Ergebnis erhält man hellgelbe poröse Stückchen der troc kenen Biomasse von unregelmäßiger Form. Der Feuchtigkeitsgrad der Biomasse beträgt 9%, die Ausbeute an Biomasse, bezogen auf das Trockengewicht, 10,3 g/l, die an biologischen Wirkstoffen 4,15%, die Produktivität der Biomasse 427,5 mg/l und die Men ge der Extraktivstoffe beträgt 46,1%.

Beispiel 2

Das Verfahren führt man analog zu Beispiel 1 durch, jedoch mit dem Unterschied, daß das Trocknen 4 Stunden dauert. Die Endfeuchtigkeit des Produktes beträgt 8,6%, die Menge der Ex traktivstoffe beträgt 49,7%.

Beispiel 3

Man verfährt analog Beispiel 1, jedoch mit dem Unter schied, daß man 4,5 Stunden trocknet. Die Endfeuchtigkeit des Produktes beträgt 8,4%, die Menge der Extraktivstoffe beträgt 50,2%.

Beispiel 4

Man verfährt analog Beispiel 1, jedoch mit dem Unterschied, daß das Nährmedium 2 mg/l Nikotinsäure enthält und man 3 stunden bei 53°C trocknet. Die Endfeuchtigkeit des Produk tes beträgt dabei 8,33%. Die Menge der Extraktivstoffe be trägt 11,8 g/l, die an biologischen Wirkstoffen 4,18% und die Produktivität der Biomasse beträgt 493,6 mg/l.

Beispiel 5

Man verfährt analog Beispiel 1, jedoch mit dem Unterschied, daß das Nährmedium 2 mg/l Nikotinsäure enthält und man 4 Stunden bei 53°C trocknet. Die Endfeuchtigkeit des Produk tes beträgt 8,0%, die Menge der Extraktivstoffe beträgt 55,5%.

Beispiel 6

Man verfährt analog Beispiel 1, jedoch mit dem Unterschied, daß das Nährmedium 2 mg/l Nikotinsäure enthält und man 4,5 Stunden bei 53°C trocknet. Die Endfeuchtigkeit des Produktes beträgt 7,8%, die Menge der Extraktivstoffe beträgt 52,0%.

Beispiel 7

Man verfährt analog Beispiel 1, jedoch mit dem Unterschied, daß das Nährmedium 2,5 mg/l Nikotinsäure enthält und man 3 Stunden bei 54°C trocknet. Die Endfeuchtigkeit des Produktes beträgt 7,8%, die Menge der Extraktivstoffe beträgt 52,8%. Die Ausbeute an Biomasse, bezogen auf das Trockengewicht, beträgt 11,65 g/l, die Ausbeute an biologischen Wirkstoffen 4,05% und die Produktivität der Biomassse 471,8 mg/l.

Beispiel 8

Man verfährt analog Beispiel 1, jedoch mit dem Unterschied, daß das Nährmedium 2,5 mg/l Nikotinsäure enthält und man 4 Stunden bei 54°C trocknet. Die Endfeuchtigkeit des Produk tes beträgt 7,4%, die Menge der Extraktivstoffe beträgt 51,0%.

Beispiel 9

Man verfährt analog Beispiel 1, jedoch mit dem Unterschied, daß das Nährmedium 2,5 mg/l Nikotinsäure enthält und man 4,5 Stunden bei 54°C trocknet. Die Endfeuchtigkeit des Produk tes beträgt 7,0% und die Menge der Extraktivstoffe 50,6%.

Beispiel 10

Zur Herstellung des Impfmaterials verwendet man eine gemisch te Kultur der Biomasse von Ginseng, die auf dem in Beispiel 1 beschriebenen Nährmedium wächst. Die Flakons mit der Biomas se bringt man aus dem Kultivierungsraum für 24 Stunden in eine temperierte Kammer ein, in der die Temperatur allmählich von 26 auf 34°C gesteigert wird. Danach werden die Flakons mit der Kultur in ein Gefäß übertragen, in dem Standardbe dingungen für die Züchtung, und zwar die Temperatur von 26°C und der Feuchtigkeitsgehalt von 70%, aufrechterhalten wer den. Dann läßt man die Kultur 35 Tage stehen. Nach 30 Tagen der Kultivierung ist eine Verzögerung des Wachstums und eine Quellung des Gewebes feststellbar.

Bei einem Anfangsgewicht des Inokulats von 20 g/l, bezogen auf das Rohgewicht, beträgt die Ausbeute an Biomasse 340 g/l. Eine wiederholte Behandlung unter denselben Bedingungen führte zu demselben Ergebnis.

Das erhaltene Inokulum kultiviert man auf dem in Beispiel 1 beschriebenen Medium.

Die Herstellung der Biomasse aus dem oben beschriebenen Impfmaterial führt man auf einem modifizierten Medium durch, das statt Kinetin Nikotinsäure enthält. Danach führt man den Prozeß analog Beispiel 1 durch.

Beispiel 11

Zur Herstellung des Impfmaterials verwendet man eine ge mischte Kultur der Biomasse von Ginseng, die auf dem in Bei spiel 1 beschriebenen Nährmedium wächst. Die Flakons mit der Biomasse werden aus dem Kultivierungsraum 24 Stunden in eine temperierte Kammer eingebracht, in der die Temperatur allmählich von 26 auf 36°C gesteigert wird. Danach werden die Flakons mit der Kultur in ein Gefäß übertragen, in dem Standardbedingungen zur Züchtung aufrechterhalten werden, und zwar die Temperatur von 26°C, der Feuchtigkeitsgehalt von 70% und die Dunkelheit. Dann läßt man die Kultur unter diesen Be dingungen 35 Tage lang stehen.

Nach 30 Tagen der Kultivierung färbt sich die Grundmasse graubraun und es wird eine Quellung nachgewiesen. Nach 35 Ta gen entstehen aktiv wachsende helle Bereiche, die vom Grund gewebe abgetrennt werden. Dann wird das Gewebe in ein fri sches Nährmedium derselben Zusammensetzung umgepflanzt. Bei einem Anfangsgewicht des Inokulats von 20 g/l beträgt die Ausbeute an Biomasse nach 30 Tagen 466 g/l.

Das erhaltene Inokulum kultiviert man auf dem in Beispiel 1 beschriebenen Nährmedium. Die Herstellung der Biomasse aus dem oben beschriebenen Inokulum führt man in einem modifi zierten Nährmedium, das statt Kinetin Nikotinsäure enthält, durch. Weiterhin führt man den Prozeß analog Beispiel 1 durch. Die Produktivität der Biomasse beträgt 500,3 mg/l.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von biologischen Wirkstoffen aus der Biomasse der Gewebekultur von Ginseng, das das Züchten eines Impfmaterials auf einem Nährmedium und anschließendes Kultivie ren der Biomasse von Ginseng, Abtrennen derselben, Trocknen und Extrahieren der biologischen Wirkstoffe aus dieser vorsieht, dadurch gekennzeichnet, daß das Kultivie ren der Biomasse auf folgendem Nährmedium: Makronährstoffe nach Murashige und Skoog
Mikronährstoffe nach Murashige und Skoog
Saccharose30 000 mg/l Thiaminhydrochlorid0,4 mg/l Meso-Inosit80 mg/l Kaseinhydrolysat500 mg/l Nikotinsäure1,5 bis 2,5 mg/l Naphthylessigsäure2 mg/l Agar-Agar6000 mg/l Fe-Chelat5 mg/lmit anschließendem Abnehmen der Biomassewucherung unter steri len Bedingungen und Trocknung derselben bei einer Temperatur von 51 bis 54°C bis zur Erzielung eines Feuchtigkeitsgrades von 7 bis 9% durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Impfmaterial ein Impfmaterial verwendet, das aus einer gemischten Biomasse der Gewebekultur von Ginseng durch Selektion nach der Wärmebehandlung des Gewe bes bei +34 bis +38°C erhalten wird, das bei 26°C und einem Feuchtegehalt von 70% mit einem Zuchtzyklus von ±30 Tagen aufbewahrt wird, und das Kalluszellen mit Abmessungen von 15 bis 20 und von 25 bis 50 µm enthält, die gleichzeitig zur Tei lung fähige Polyploidzellen sind.