DE3321041A1 - Chromogene und fluorogene ester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur photometrischen oder fluorometrischen bestimmung von phosphatasen bzw. sulfatasen - Google Patents

Chromogene und fluorogene ester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur photometrischen oder fluorometrischen bestimmung von phosphatasen bzw. sulfatasen

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DE3321041A1 DE19833321041 DE3321041A DE3321041A1 DE 3321041 A1 DE3321041 A1 DE 3321041A1 DE 19833321041 DE19833321041 DE 19833321041 DE 3321041 A DE3321041 A DE 3321041A DE 3321041 A1 DE3321041 A1 DE 3321041A1
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Description

  • Chromogene und fluorogene Ester, Verfahren zu deren Her-
  • stellung sowie Verfahren und Mittel zum Nachweis und zur photometrischen oder fluorometrischen Bestimmung von Phosphatasen bzw. Sulfatasen Die Erfindung betrifft neue chromogene und fluorogene Phosphorsäure- und Schwefelsäureester, die unter dem Einfluß von Phosphatasen bzw. Sulfatasen ein stark fluoreszierendes farbiges Anion bilden und zu einer verbesserten photometrischen oder fluorimetrischen Bestimmungsmethode für Phosphatasen bzw. Sulfatasen verwendet werden können.
  • Photometrische Verfahren zur Bestimmung von Phosphatasen sind seit längerer Zeit bekannt. In der klinischen Analytik fast ausschließlich angewandt wird das N-Nitrophenylphosphat, welches durch eine Phosphatase in p-Nitrophenol und Phosphat gespalten wird. Man mißt die Zunahme der Extinktion des Phenolats in Abhängigkeit von der Zeit. Die Bildung des Phenolats wird durch Zugabe von Lauge erreicht, wodurch aber auch die enzymatische Reaktion unterbrochen wird. Es handelt sich also um eine Endpunktmethode (Bergmeyer, Methoden der enzymatischen Analyse, Bd. 1, S. 888, Verlag Chemie, Weinheim, 1974).
  • Fluorimetrische Verfahren zur Bestimmung von Phosphatase-Aktivitäten sind ebenfalls seit längerem bekannt (Guilbault, Enzymatic Methods of Analysis, Pergamon Press 1970). Die Fluorimetrie ist so empfindlich, daß hiermit auch äußerst geringe Enzymkonzentrationen nachgewiesen und bestimmt werden können. Bekannte fluorimetrisch verwendete Phosphatase-Reagentien sind Phosphorsäureester des Umbelliferons (G.G.Guilbault et al., Anal. Letters 1 (1968) 333), des 4-Methylumbelliferons (H.N.Fernley, P.G.Walker, Biochem. J. 97 (1965) 95), des Flavonois (D.B.Land, E.Jakim, Anal. Riochem. 16 (1966) 481), des o -Naphthols (D.W.Moss, Clin.- chim.
  • Acta 5- (1960) 283), des ß-Naphthols (L.J.Greenberg, Biochem. Biophys. Res. Comm. 9 (1962) 430) und des 3-0-Methyl-fluoresceins (H.D. Hill et al., Anal. Biochem. 24 (1968) 9).
  • Diese bekannten Nachweisverfahren sind aus verschiedenen Gründen nicht voll befriedigend. Bei verschiedenen absorbierenden bzw. fluoreszierenden Enzymsubstraten tritt eine störende Uberlappung der Absorption bzw.
  • Fluoreszenz mit der des Untersuchungsmaterials auf.
  • Bei Enzymsubstraten mit geringer Verschiebung zwischen den Absorptionsbanden des Substrats und des freigesetzten Chromophors oder Fluorophors tritt eine zu starke Uberlappung der beiden Banden auf, was die Genauigkeit der Methode mindert. Weiter ist zur Zeit noch keine Methode bekannt, welche eine direkte kinetische Verfolgung enzymatischer Spaltungen durch Phosphatasen im sichtbaren Bereich der Absorption bzw.
  • Fluoreszenzanregung erlaubt.
  • Phosphorsäureester des oben genannten Standes der Technik werden darüber hinaus nur im alkalischen pH-Bereich rasch genug gespalten, um in der klinischen Analytik verwendet werden zu. können. Für die Diagnose, beispielsweise bei der Früherkennung von Prostata-Karzinomen, wäre es jedoch wichtig, auch saure Phosphatase-Aktivitäten zu bestimmen.
  • In US -3 772 340 werden Bis-cumarinylphosphate beschrieben,. die zur fluorimetrischen Bestimmungen von Phosphodiesterasen dienen sollen, wie sie in bakterienhaltigem Urin auftreten. Ein Nachteil dieser Verbindungen ist ihre Schwerlöslichkeit in Wasser, was ihre praktische Anwendbarkeit begrenzt.
  • Photometrische Verfahren zur Bestimmung von-Sulfatasen sind ebenfalls seit längerem bekannt. So verwendet Roy (Biochem. Journal 62 (1956) 41) als Substrat Nitrocatecholsulfat, welches durch eine Sulfatase in Sulfat und Nitrocatechol gespalten wird. Die Bildung des Nitrocatechols wird photometrisch verfolgt. Leon et al.
  • (Biochem. J. 75 (1960) 612) verwenden im gleichen Sinn p-Nitrophenylsulfat. Dodgson und Spencer (Biochem.
  • J. 55 (1953) 315) setzen p-Acetylphenylsulfat ein.
  • Ebenso gehören fluorimetrische Verfahren zur Bestimmung von Sulfatase-Aktivitäten zum Stand der Technik (Guilbault, Enzymatic Methods of Analysis, Pergamon Press 1970). Die Fluorimetrie ist so empfindlich, daß hiermit auch äußerst geringe Enzymkonzentrationen nachgewiesen und bestimmt werden können. Bekannte. fluorime-- trisch verwendete Sulfatase-Reagentien sind Schwefelsäureester verschiedener Fluorophore. .-Sherman und Stanfield (Biochem. J. 102 (1967) 905) verwenden 4-Methylumbelliferonsulfat zur Bestimmung von Arylsulfatase mit Hilfe einer Endpunktsmethode, Guilbault und Hiersermann-untersuchten eine Reihe von Schwefelsäureestern (z.B. des Indoxyls, ß-Naphthols, 4-Methylumbelliferons,-Fluoresceins und Resorufins) hinsichtlich ihrer Eignung für eine direkte kinetische Bestimmung von Sulfatasen (Anal. Chem. 41 (1969), 2006).
  • Diese-bekannten Nachweisverfahren für Sulfatasen sind jedoch ebenfalls aus verschiedenen Gründen nicht voll befriedigend: Die Schwefelsäureester des genannten Standes der Technik werden erst bei relativ hohen Enzymkonzentrationen rasch genug gespalten und können deswegen in der klinischen Analytik kaum verwendet werden.
  • Für die Diagnose, beispielsweise bei der Früherkennung gewisser Erbkrankheiten, wäre es jedoch wichtig, auch geringste Aktivitäten zu bestimmen. Bei vielen der bekannten fluorogenen Schwefelsäureester tritt darüber hinaus eine störende.Uberlappung der Fluoreszenz des Esters und des bei der Hydrolyse entstehenden Anions auf. Im übrigen verlangen die Reagentien des Standes der Technik zum Teil auch einen erheblichen apparativen Aufwand.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Reagentien für den photometrischen und fluorimetrischen Nachweis von Phosphatasen bzw. Sulfatasen zur Verfügung zu stellen, welche von den oben erwähnten Nachteilen des Standes der Technik frei sind. Diese Aufgabe wird mittels der erfindungsgemäßen Phosphor- und Schwefelsäureester gelöst.
  • Gegenstand der Erfindung sind neue Ester der allgemeinen Formel worin Y einen Säurerest bedeutet, M für Wasserstoff, ein Alkali-, Pyridinium- oder Ammoniumion, das durch 1 - 4, gegebenenfalls eine Hydroxygruppe enthaltende C1-C2-Alkylreste substituiert sein kann, X für -0- oder -NQ-, Q für Wasserstoff, gegebenenfalls durch 1 - 2 OH-Gruppen substituiertes C1-C4-Alkyl oder für C1-C4-Alkoxycarbonyl, R für Wasserstoff, Chlor, Brom, Cyano oder Carbamoyl, A für Cyano, C1-C4-Alkoxycarbonyl, gegebenenfalls durch 1 - 2 C1-C4-Alkylreste substituiertes Carbamoyl oder Sulfamoyl, C1-C4-Alkylsulfonyl, Benzyl- sulfonyl, Phenylsulfonyl, p-Tolylsulfonyl, p-Chlorphenylsulfonyl, Sulfo, Nitro, Phenyl, p-Tolyl, Sulfophenyl oder für einen gegebenenfalls durch 1 - 2 C1 -C4-Alkyl, 1 - 2 Chlor, C1-C4-Alkoxy, Carboxyl, C1-C4-Alkoxycarbonyl, Cyano, Trifluormethyl, C1-C4-Alkylsulfonyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Sulfo substituierten Benzoxazol-2-yl-, Benzthiazol-2-yl-, Thiazol-2-yl-, Benzimidazol-2-yl-, Chinazol-4-on-2-yl-j 5-Phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl-, 2- oder 4-Pyridyl-Rest und R1 für Wasserstoff oder eine Sulfonsäuregruppe stehen.
  • Bevorzugt sind jene Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in welcher A für einen gegebenenfalls durch 1 - 2 Cl-C-Alkyl, 1 - 2 Chlor, C1-C4-Alkoxy, C1-c4-Alkylsulfonyl, Carboxyl, C1-C4 -Alkoxycarbonyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Sulfo substituierten Benzoxazol-2-yl-, Benzthiazol-2-yl-, Thiazol-5-yl-, Benzimidazol-2-yl-, Chinazol-4-on-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl- oder 4-Pyridyl-Rest steht.
  • Besonders bevorzugt sind diejenigen Verbindungen der Formel (I), worin A für einen gegebenenfalls durch Methyl, Ethyl, Chlor, Methoxy, Ethoxy oder Sulfo substituierten Benzthiazol-2-yl- oder Benzoxazol-2-yl-Rest und R für CN stehen.
  • Die erfindungsgemäßen Phosphorsäureester der Formel (1) können hergestellt werden, indem man Hydroxy-Verbindungen der Formel worin X, A, R und R1 die obengenannte Bedeutung besitzen, zunächst mit einem Halogenid des 5-wertigen Phosphors (vorzugsweise in Gegenwart eines anorganischen oder organischen Säurefängers) umsetzt und die erhaltene Dihalogenphosphonyloxy-Verbindung anschließnd hydrolysiert.
  • Als Halogenide des 5-wertigen Phosphors kommen beispielsweise Phosphoroxidtrichlorid, Phosphoroxidtribromid oder Phosphorpentachlorid in Betracht, wobei das letztgenannte bevorzugt dann eingesetzt wird, wenn das Molekül eine Sulfogruppe enthält (vorübergehende Überführung in das entsprechende Sulfochlorid).
  • Als Säurefänger eignen sich anorganische und organische Basen, beispielsweise wasserfreies Kdlium- oder Natriumcarbonat, Magnesiumoxid, Triethylamin, Kollidin, Picolingemische, Pyridin und Dimethylanilin.
  • Die Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungs- oder Verdünnungsmittels im Temperaturbereich von -5 bis 100°C, im Falle-der Phosphoroxidtrihalogenide vorzugsweise bei 0 - 30°C, im Falle von PCl5 vorzugsweise bei 20 - 900C durchgeführt.
  • Als Lösungs- und Verdünnungsmittel eignen sich unter den Reaktionsbedingungen inerte organische Flüssigkeiten wie Toluol, Chlorbenzol, Dichlorbenzol, Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlormethan, Dichlorethan, Dichlorpropan, Trichlorethylen, Acetonitril, Dioxan, Tetrahydrofuran oder eine der obengenannten organischen Basen wie Pyridin.
  • Um die Reaktion des 5--wertigen Phosphorhalogenids mit 2 Molekülen (11) zu vermeiden, sorgt man während der Reaktion zweckmäßig für einen Überschuß an Phosphorhalogenid dadurch, daß man (II) als letzte Komponente nach rund nach zugibt, gegebenenfalls vorgelöst in einem der obengenannten Lösungsmittel.
  • Die Hydrolyse der intermediären Dichlorphosphonyloxy-Verbindungen zu (I) kann z.B. durch vorsichtiges Erwärmen mit Wasser auf etwa 50"C, schonender jedoch bei Temperaturen von 0 - 250C durch Neutralisation mit Alkalihydroxid- oder Alkalicarbonat-Lösung, Pyridin oder wäßrigem Ammoniak durchgeführt werden. Anschließend dampft man die erhaltenen Alkali- oder Ammoniumsalze im Vakuum zur Trockne ein oder gewinnt durch Ansäuern mit einer Mineralsäure wie Schwefelsäure die freie Säure (I mit M=H) durch- Abfiltrieren.
  • Die erfindungsgemäßen Schwefelsäureester der Formel (1) können hergestellt werden, indem man Hydroxy-Verbindungen der Flormel (11) mit Chlorsulfonsäure in einem organischen Lösungsmittel (vorzugsweise in Gegenwart eines anorganischen oder organischen Basenfängers) umsetzt und den erhaltenen Schwefelsäuremonoester in Form eines Salzes isoliert.
  • Die Reaktion ist auch mit Sulfurylchlorid (SO2Cl2) in entsprechender Weise durchführbar, wobei intermediär ein Schwefelsäuremonoesterchlorid entsteht, welches durch anschließende Hydrolyse in die freie Sulfonsäure bzw.
  • in eines ihrer Salze überführt wird.
  • Als Säurefänger eignen sich alle oben angeführten anorganischen und organischen Basen.
  • Die Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungs- oder Verdünnungsmittels im Temperaturbereich von -S bis 100-"C, im Falle des Sulfurylchlorids vorzugsweise bei 0-300C, durchgeführt.
  • Als Lösungs- und Verdünnungsmittel eignen sich alle bereits oben beschriebenen unter den Reaktionsbedingungen inerten organischen Flüssigkeiten oder eine der obengenannten organischen Basen wie Pyridin.
  • Um die Reaktion des Schwefelsäuredihalogenids mit 2 Molekülen (II) zu vermeiden, sorgt man während der Reaktion zweckmäßig für einen Überschuß an Säure-halogenid dadurch, daß man (II) als letzte Komponente nach und nach zugibt, gegebenenfalls vorgelöst in einem der obengenannten Lösungsmittel.
  • Die Hydrolyse der intermediären Schwefelsäuremonoesterchloride zu (I) kann ebenEalls.z.B. durch vorsichtiges Erwärmet mit Wasser auf etwa 500C, schonender jedoch bei Temperaturen von 0-250C durch Neutralisation mit Alkalihydroxid- oder Alkalicarbonat-Lösung, Pyridin oder wäßrigem Ammoniak durchgeführt werden. Anschließend dampft man die erhaltenen Alkali- oder Ammoniumsalze im Vakuum zur Trockne ein oder gewinnt durch Ansäuern mit einer Mineralsäure wie Schwefelsäure die freie Säure (I mit M=H) durch Abfiltrieren.
  • Die vorstehend beschriebenen Methoden zur O-Phosphorylierung bzw. O-Sulfonylierung von (11) stimmen im wesentlichen mit den in Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band XII/2 (1964), S. 172 - 177, bzw. Band IX (1955), S. 665, beschriebenen allgemeinen Methoden zur Phosphorylierung bzw. O-Sulfonylierung von aromatischen Hydroxyverbindungen überein.
  • Die Ausgangsverbindungen der Formel (II) sind bekannt (US-PS 3 521 187, Verbindung 11; DE-OS 27 02 337; DE-OS 30 44 128, DE-OS 21 00 295 -und DE-OS 3 229 301) oder nach den dort genannten Methoden herstellbar.
  • Die neuen Verbindungen der Formel (I) sind wasserlösliche, schwach blau (R=H, Cl, Br) oder grünlich (R=CN, CONH2) fluoreszierende und zumeist nur wenig farbige Substanzen, die im wäßrigen Medium von alkalischer oder saurer Phosphatase bzw. Sulfatase zum stark fluoreszierenden, tief gelb bis rot gefärbten mesomeren Anion der Formeln gespalten werden.
  • Die neuen Phosphatase- bzw. Sulfatase-Reagentien der Formel (I) eignen sich daher zum direkten Phosphatase-bzw. Sulfatase-Nachweis in biologischen Materialien.
  • Besonders vorteilhaft können sie zur quantitativen photometrischen und fluorimetrischen Bestimmung der alkalischen oder sauren Phosphatasen bzw. Sulfatasen in der klinischen Analytik verwendet werden.
  • Gegenüber den Phosphatase-Reagentien des Standes der Technik weisen die neuen Phosphorsäureester der Formel (I) wesentliche Vorteile auf: 1. Keinerlei Überlappung der Absorptionsbande des bei der enzymatischen Hydrolyse entstehenden Phenolations (IITa-IIIb) gegenüber der Absorption der Phosphorsäureester wegen der großen Stokes'schen Verschiebung, so daß die Zunahme der Absorption des Phenolations photometrisch leicht verfolgt werden kann.
  • 2. Keinerlei störende Überlappung der fluorimetrisch zu verfolgenden, bei der enzymatischen Spaltung von (I) entstehenden starken Fluoreszenz des Phenolats (IIIa - IIIb) mit der schwachen Fluoreszenz des eingesetzten Reagenz (I) (große Stoke'sche Verschiebung).
  • 3.. Verwendung einfachster Filterfluorimeter möglich, da weder eine Anregung durch W-Licht, bei der sich in der Regel die Untergrundfluoreszenz des biologischen.Materials störend bemerkbar macht, noch die Anwendung aufwendiger Monochromatoren oder Interferenzfilter, wie sie beim Einsatz von 3-0-Methylfluorescein-phosphat gebraucht werden, erforderlich sind.
  • 4. Bildung des tief farbigen fluoreszierenden Phenolations zu II (IIIa-IIIb) überraschenderweise bereits unter schwach sauren Bedingungen (z.B. bei pH 5.2). Hierdurch ist es erstmalig möglich, die Aktivität saurer Phosphatasen photometrisch oder fluorimetrisch im sichtbaren Spektralbereich in kontinuierlicher Messung mit einer so hohen Nachweisempfindlichkeit zu verfolgen, wie sie bisher nur bei zeitaufwendigeren nichtkinetischen Verfahren bekannt ist.
  • Die erfindungsgemäßen Phosphorsäureester können zur Bestimmung der Phosphataseaktivität in den verschiedensten Körperflüssigkeiten (Serum; cerebrospinale Flüssigkeit; Urin) verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich, die erfindungsgemäßen Reagentien analog zur Lehre der US-PS 3 772 340 zur Messung der Bakterienkonzentration in Flüssigkeiten (z.B. bakteriell infiziertem Urin) heranzuziehen. Zü diesem Zweck werden zunächst in an sich bekannter Weise (z.B. osmotischer Schock; Sphäroplastenbildung) die bakteriellen Enzyme, darunter auch Phosphatasen, freigesetzt. Aus der mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen bestimmten Phosphataseaktivität lassen sich dann Rückschlüsse auf die Zahl der vorhandenen Bakterien ziehen.
  • Auch die neuen Schwefelsäureester der Formel (I) weisen gegenüber den Sulfatase-Reagentien des Standes der Technik wesentliche Vorteile auf: 1. Aufgrund der hohen molaren Lichtabsorption der freigesetzten mesomeren Anionen (IIIa-IIIb) ist erstmalig eine photometrische Verfolgung der enzymatischen Reaktion im langwelligen Spektralbereich möglich.
  • 2. Keinerlei störende Überlappung der Fluoreszenz des Phenolats (IIIa-IIIb) mit der schwachen Fluoreszena des eingesetzten Reagenz (I) (siehe oben).
  • 3.- Verwendung einfachster Filterfluorimeter möglich, da weder eine Anregung durch W-Licht, bei der sich in der Regel die Untergrundfluoreszenz des biologischen Materials-störend bemerkbar macht, noch die Anwendung aufwendiger Monochromatoren oder Interferenzfilter, wie sie beim Einsatz von Fluorescein-O-sulfat gebracht werden, erforderlich sind.
  • 4. Bildung des tief farbigen fluoreszierenden Hydroxylatanions (IIIa-IIIb) überraschenderweise bereits unter schwach sauren Bedingungen (z.B. bei pH 5.2).
  • Hierdurch ist es erstmalig möglich, die Aktivität von Sulfatasen in diesem Spektralbereich fluorimetrisch in kontinuierlicher Messung mit einer so hohen Nachweisempfindlichkeit zu verfolgen, wie sie bisher nur be zeitaufwendigeren nichtkinetischen Verfahren bekannt ist.
  • Auch die erfindungsgemäßen Schwefelsäureester können zur Bestimmung der Sulfataseaktivität in den verschiedensten Körperflüssigkeiten (Serum; cerebrospinale Flüssigkeit; Urin) verwendet werden.
  • Bei der Bestimmung der Phosphatase- bzw. Sulfataseaktivität können die erfindungsgemäßen Verbindungen wegen ihrer guten Wasserlöslichkeit in Form wäßriger Lösungen, gegebenenfalls auf den gewünschten pH-Wert gepuffert (z.B. ca. 4;5 - 7 für saure Phosphatasen; ca.
  • 7-10 für alkalische Phosphatasen), eingesetzt werden.
  • Es ist jedoch auch möglich, die neuen Ester in an sich bekannter Weise auf Träger aufzubringen und die Nach weisreaktion in heterogener Phase ablaufen zu lassen.
  • Geeignete Trägermaterialien sind z.B. Filterpapier oder -auf einem Kunststoff (z.B. Polystyrol) aufgebrachtes, mit einem organischen Bindemittel versehenes Siliziumdioxid. Es lassen sich auf diese Weise Teststreifen herstellen, die nach dem Aufbringen der zu untersuchenden Flüssigkeit ihre Farbe ändern bzw. zu fluoreszieren beginnen und deren Farbe bzw. Fluoreszenz mittels der in der klinischen Analytik üblichen Photometer bzw.
  • Fluorimeter gemessen werden kann. Die quantitative Bestimmung der Phosphatase- bzw. Sulfatase-Aktivität in einer unbekannten Probe ist möglich, wenn man den zeitlichen Verlauf der Lichtabsorption bzw. der Fluoreszenz-Intensität in der wäßrigen Lösung bzw. auf dem Teststreifen mit jenem von Standards mit bekanntem Gehalt an Phosphatase bzw. Sulfatase vergleicht.
  • Bei den im folgenden beschriebenen Versuchen zur Phosphatasebestimmung wurden als Standards folgende Phosphatasepräparate der Firma Sigma Chemical Co. verwendet: a) alkalische Phosphatase (EC. 3.1.3.1): Typ I-S (P7640) (aus Rinderhodenmucosa) b) ' saure Phosphatasen (EC 3.1.3.2): Typ III (P6760) -Typ IV-S (P1146) Typ V (P1267) (aus Weizenkeimlingen, Kartoffeln, Milch und Rinderhoden.
  • Bei den Versuchen zur Sulfatasebestimmung wurden als Standards folgende Sulfatase-Präparate der Firma Sigma Chemical Co. verwendet: a) Arylsulfatase (E.C. 3.1.6.1): Typ V (S 8629), aus Patella vulgata b) Arylsulfatase (E.C. 31.6.1): Typ VI (S 1629), aus Aerobacter aerogenes c). Arylsulfatase (E.C. 3.1.6.1); Typ H-I (S 9626), aus Helix pomatia.
  • EC ist jeweils die Bezeichnung für den international gültigen Enzymkatalog.
  • Beispiel 1 800 ml trockenes Pyridin werden unter Kühlung und Rühren bei 0 - 50C tropfenweise mit 39 g (23 ml; 0,25 Mol) Phosphoroxidtrichlorid und anschließend bei der gleichen Temperatur innerhalb von ca. 30 Minuten portionsweise mit 80 g. (0,25. Mol) 3-Benzthiazolyl-4-cyano-7-hydroxy-cumarin versetzt und 3 h bei 0 - 50C verrührt. Man trägt auf 2 1 Eiswasser aus, tropft unter Rühren 66 g (45 ml; 0,75 Mol) 45 gew.-%ige Natronlauge hinzu, wobei sich ein pH-Wert von ca. 7 einstellt, läßt die Mischung 10 h rühren, dampft sie-mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei 400C imVakuum zur Trockne ein und trocknet den Rückstand weiter bei 40°C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz. Der Rückstand (185 g) besteht aus 44 g Kochsalz und 141 g (96 % der Theorie) der Verbindung der Formel Zur Reinigung wird der Rückstand aus Ethanol-Wasser (4:1) umkristallisiert. Man erhält orangefarbene Kristalle vom Schmelzpunkt 3250C (Zers.).
  • Die Verbindung ist löslich, z.B. in Wasser, Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Ethylenglykolmonomethylether.
  • Zur photometrischen Verfolgung der enzymatischen Hydrolyse mißt man die Extinktion bei 510 nm.
  • Zur.fluorimetrischen Verfolgung der enzymatischen Hydrolyse wählt man Anregungslicht mit einem Maximum bei 510 nm und mißt die Fluoreszenz bei 595 nm. Bei dieser Wellenlänge wird ausschließlich die Fluoreszenz des enzymatisch gespaltenen Substrats erfaßt.
  • In analoger Weise werden unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen die folgenden Phosphorsäureester der allgemeinen Formel hergestellt:
    Beispiel M R A X Schmelzpunkt
    (Zersetzung)
    °C
    2 Na H # O 301°
    3 K CN # O 309°
    4 Na H # O 302°
    5 Na CN # O 310°
    6 NH4 H # O 318°
    7 K CN # O 304°
    8 Na CN # O 308°
    Beispiel M R A X Schmelzpunkt
    (Zersetzung)
    °C
    9 Li H # O 300°
    10 Na CN # O 330°
    11 R CN # O 317°
    12 Na CN # O 315°
    13 NH4 H # N-C4-H9-n 300°
    14 K H # N-CH3 313°
    15 Na H # N-COOC2H5 322°
    Beispiel M R A X Schmelzpunkt
    (Zersetzung)
    °C
    16 H2N(C2H4OH)2 CN # O 262°
    17 HN(C2H5)3 H # O 278°
    18 Na CN # O 307°
    19 K CN # O 316°
    20 Na CN CN O 327°
    21 K CN COOCH3 O 304°
    22 Na CN SO2CH3 O 312°
    23 Na CN SO2-C6H5 O 326°
    24 K CN # O 305°
    Beispiel 25 160 ml trockenes Pyridin werden unter Kühlung und Rühren bei 0 10°C innerhalb von 30 Minuten mit 11,-5 g Phosphorpentachlorid (55 mMol) und anschließend mit 22,6 g (50 mMol) 3-(5-Methyl-7-sulfo-benzoxazol-2-yl)-7-hydroxycumarin-pyridiniumsalz versetzt und 1 h auf 80°C erwärmt, wobei vorübergehend eine klare Lösung entsteht. Man trägt auf 400 ml Eiswasser aus, tropft unter Rühren 30 g (20 ml; 335 mMol) 45 gew.-%ige Natronlauge hinzu, wobei sich ein pH-Wext von ca. 7 einstellt, und läßt die Mischung 10 h rühren. Man dampft das Filtrat mit Hilfe eines Rotationsverdampfers Zur Trockne ein-und trocknet weiter bei 50°C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz. Der Rückstand enthält außer 16 g Kochsalz und ca. 1 g Na2HPO4 25 g (95 % der Theorie) der Verbindung der Formel Zur photometrischen.Verfolgung der enzymatischen Hydrolyse mißt man die Extinktion bei 430 nm.
  • Zur Verfolgung der enzymatischen Hydrolyse durch Phosphatasen regt man im Fluorimeter bei ca. 450 nm an und mißt die Emission bei ca. 495 nm. Hierbei wird praktisch nur die Fluoreszenz des enzymatisch gespaltenen Substrates erfaßt.
  • In analoger Weise werden unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen die folgenden sulfogruphaltigen Phosphorsäureester der allgemeinen Formel hergestellt:
    Beispiel M R A
    26 Na CN
    27 K H S toCH3
    3
    28 Na CN
    Cl
    29 Na H 0
    30 Na CN S 41
    Beispiel 31 Zu 5 ml trockenem Pyridin werden unter Kühlung und Rühren tropfenweise 1,46 g (0,83 ml; 12,5 mMol) Chlorsulfonsäure gegeben und anschließend der gebildete Pyridin-Chlorsulfonsäuxe-Komplex durch Erwärmen in Lösung gebracht. Nach Zugabe von 0,7 g 3-Benzoxazolyl-7-hydroxy-cumarin (2,5 mMol) wird die Mischung für ungefähr 24 Stunden auf 600C erwärmt. Man versetzt mit 20 ml Wasser und filtriert in der Siedehitze vom Ungelösten. Beim Abkühlen kristallisieren 0,8 g (73t5 % der Theorie) der-Ver- Die ockerfarbenen Kristalle schmelzen bei 201-2020C.
  • Die Verbindung ist löslich, z.B. in Wasser, Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Ethylenglykolmonomethylether.
  • Zur photometrischen Verfolgung der enzymatischen Hydrolyse mißt man die Extinktion bei 430 nm.
  • Zur fluorimetrischen Verfolgung der enzymatischen Hydrolyse wählt man Anregungslicht mit einem Maximum bei 430 nm und mißt die Fluoreszenz bei 470 nm. Bei dieser Wellenlänge wird ausschließlich die Fluoreszenz des enzymatisch gespaltenen Substrats erfaßt.
  • -Beispiel 32 Zur Darstellung des Natriumsalzes des in Beispiel 31 beschriebenen Schwefelsäureesters wird die Mischung nach Zusatz von 20 ml Wasser mit 3 g festem Natriumhydrogencarbonat versetzt und das auskristallisierende Natriumsalz abgesaugt. Die Reinigung erfolgt durch Umkristallisation aus Wasser. Man erhält gelbe Kristalle (0,7 g; 74 % der Theorie) vom Schmelzpunkt 2540C (Zersetzung).
  • In analoger Weise werden unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen die folgenden Schwefelsäureester der allgemeinen Formel hergestellt:
    Beispiel M R A X sbizpunkt OC
    N
    33 C5HSNH H zut 0 203-205 0C
    Beispiel M R A X Schmelzpunkt
    Beispiel M R A X Sdwelzpunkt
    ., ~ . . ~ . . .
    -34 C5H5NH H zu ° 139°C
    35 Na CN ; t o 286CC (Zers.)
    Beispiel 36 Zu 10 ml trockenem Pyridin werden unter Kühlung und Rühren tropfenweise 1,46 g (0,83 ml; 12,5 mMol) Chlorsulfonsäure gegeben und anschließend der gebildete Pyridin-Chlorsulfonsäure-Komplex durch Erwärmen in Lösung gebracht. Nach Zugabe von 1,1 g (2,5 mMol) 3 Methyl-7-sulfo-ben2Oxazol-2-yl) 7-hydroxy-cumarinpyridiniumsalz wird die Mischung ungefähr 5 Stunden lang auf 70°C erwärmt. Die Lösung wird mit 40 ml Wasser versetzt und der pH-Wert der Lösung mit 1On NaOH auf ungefähr 7 eingestellt. Man dampft die Lösung mit Hilfe eines Rotationsverdampfers zur Trockene ein. Der Rückstand wird zur Reinigung aus Ethanol-Wasser (4:1) umkristallisiert. Man erhält gelbliche Kristalle (1,1 g; 89 % der Theorie) der Verbindung der Formel vom Schmelzpunkt 237 CC (Zersetzung).
  • Zur photometrischen Verfolgung der enzymatischen Hydrolyse mit man die Extinktion bei 430 nm.
  • Zur Verfolgung der enzymatischen Hydrolyse durch Sulfatasen regt man im Fluorimeter bei 430 nm an und mißt die Emission bei 470 nm. Hierbei wird praktisch nur die Fluoreszenz -des enzymatisch gespaltenen- Substrates erfaßt.
  • In analoger Weise werden unter- Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen die folgenden Schwefelsäureester der allgemeinen Formel hergestellt:
    Beispiel M R A X
    37 Na H # O
    38 K CN # O
    39 Na H # O
    40 Na CN # O
    41 NH4 H # O
    42 K CN # O
    43 Na CN # O
    Beispiel M R A X
    44 Li H # O
    45 Na CN # O
    46 K CN # O
    47 Na CN # O
    48 NH4 H # N-C4H9-n-
    49 K H # N-CH3
    50 Na H # N-COOC2H5
    Beispiel M R A X
    51 H2N(C2H4OH)2 CN # O
    52 NH(C2H5)3 H # O
    53 Na CN # O
    54 K CN # O
    55 Na CN CN O
    56 K CN COOCH3 O
    57 Na CN SO2CH3 O
    58 Na CN SO2-C6H5 O
    59 K CN # O
    In analoger Weise werden unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen die folgenden Sulfogruppen-haltigen Schwefelsäureester der allgemeinen Formel hergestellt:
    Beispiel X R A
    60 Na CN Ülül
    60 Na eN
    61 K
    ocH3
    62 Na N MTo
    63 Na H ½¾½Cl
    N Cl
    64 Na CN 4s 41
    Beispiel 65 In einem Fluorimeter füllt man bei 230C die Küvette mit 3 ml einer 0,1 mmolaren wäßrigen citratgepufferten (0,05 Mol Citrat/Liter) Lösung der Verbindung des Beispiels (1) vom pH 5.2, stellt die Anregungswellenlänge auf 510 nm und die Emissionswellenlänge auf 595 nm ein, fügt 0,1 ml der auf saure Phosphatase-Aktivität zu bestimmenden Körperflüssigkeit (Serum, cerebrospinale Flüssigkeit), deren Gehalt in der Größenordnung von 0,1 mg Phosphatase pro ml liegen soll, hinzu und.verfolgt die zeitliche änderung der Fluoreszenzintensität über einen Zeitraum von etwa 1 - 3 Minuten im vergleich zu vorher angefertigten Eichkurven. Der anfangs lineare Anstieg der Fluoreszenzintensität ist ein direktes Maß für die Enzymaktivität. Die Nachweisgrenze für saure Phosphatasen liegt bei der vorstehend beschriebenen Anordnung bei ca. 1x10 5 Enzymeinheizen pro ml. Mit bekannten Phosphatase-Reagentien ist eine kinetische Messung der sauren Phosphatase-Aktivität mit einer derartigen Empfindlichkeit in diesem Spektralbereich bisher nicht möglich gewesen. Nichtkinetische Verfahren sind zwar ähnlich empfindlich, aber langwieriger und aufwendiger.
  • In vollkommen analoger Arbeitsweise, wenn auch mit geringerer Empfindlichkeit, kann man anstelle der Fluoreszenzmessung die Reaktion anhand der Änderung der photometrischen Lichtabsorption bei 510 nm verfolgen.
  • Als Eichsubstanz kann säure Phosphatase aus Kartoffeln (Enzym-Katalog-Nr. 3.1.3.2, Typ IV-S), käuflich erhältlich bei Sigma Chemical Co. unter der Nr. p-1146, mit einer Aktivität von 1.9 Enzymeinheiten/mg verwendet werden (definiert ist die Enzymeinheit als diejenige Menge des Enzyms, die 1 Mol p-Nitrophenylphoshat pro Minute bei pH 4,8 und 37"C hydrolysiert).
  • Beispiel 66 In einem Fluorimeter füllt man bei 23"C die Küvette mit 3 ml einer 0,1 mmolaren wäßrigen acetatgepufferten (0,05 Mol Acetat/Liter) Lösung der Verbindung des Beispiels 31 vom pH 6.2, stellt die Anregungswellenlänge auf 510 nm und die Emissionswellenlänge auf 595 nm ein, fügt 0,1 ml der auf Sulfatase-Aktivität zu bestimmtenden Körperflüssigkeit (Serum, cerebrospinale Flüssigkeit), deren Gehalt in der Größenordnung von 1 mg Sulfatase pro ml liegen soll, hinzu und verfolgt die zeitliche Anderung der Fluoreszenzintensität über einen Zeitraum von etwa 1-30 Minuten im Vergleich zu vorher angefertigten Eichkurven. Der anfangs lineare Anstieg der Fluoreszenzintensität ist ein direktes Maß-für die Enzymaktivität. Die Nachweisgrenze für Sulfatase liegt bei der vorstehend beschriebenen Anordnung bei ca. 1x10 3 Enzymeinheiten pro ml. Mit bekannten Sulfatase-Reagentien ist eine kinetische Messung der Sulfatase-Aktivität mit einer derartigen Empfindlichkeit in diesem Spektralbereich bisher nicht möglich gewesen. Nichtkinetische Verfahren sind zwar ähnlich empfindlich, aber langwieriger und aufwendiger.
  • Als Eichsubstanz kann Sulfatase aus Patella vulgata (Enzym-Katalog-Nr. 3.1.6.1, Typ V), käuflich erhältlich bei Sigma Chemical Co. unter der Nr. S 8629, mit einer Aktivität von 9 Enzymeinheiten/mg verwendet werden (definiert ist die Enzymeinheit als diejenige Menge.des Enzyms.
  • die 1 aMol Nitrocatecholsulfat pro Stunde bei pH 5,0 und 37"C hydrolysiert).
  • In vollkommen analoger Arbeitsweise, wenn auch mit geringerer Empfindlichkeit, kann man anstelle der Fluoreszenzmessung die Reaktion anhand der Änderung der photometrischen Lichtabsorption bei SlOnm verfolgen.

Claims (10)

  1. Patentansprüche Verbindungen der allgemeinen Formel worin Y einen Säurerest bedeutet, M für Wasserstoff, ein Alkali-, Pyridinium- oder Ammoniumion, das durch 1 - 4, gegebenenfalls eine Hydroxygruppe enthaltende C C1-C2 -Alkylreste substituiert sein kann, X für -0- oder -NQ-, Q für Wasserstoff, gegebenenfalls durch 1 - 2 OH-Gruppen substituiertes C1-C4-Alkyl oder für C1-C4-Alkoxycarbonyl, R für Wasserstoff, Chlor, Brom, Cyano oder Carbamoyl, A für Cyano, C1-C4 -Alkoxycarbonyl, gegebenenfalls durch 1 - 2 C1-C4-Alkylreste substituiertes Carbamoyl oder Sulfamoyl, C1-C4-Alkylsulfonyl, Benzylsulfonyl, Phenylsulfonyl, p-Tolylsulfonyl, p-Chlorphenylsulfonyl, Sulfo, Nitro, Phenyl, p-Tolyl, Sulfophenyl oder für einen gegebenenfalls durch 1 - 2 C1-C4-Alkyl, 1 - 2 Chlor, C1-C4-Alkoxy; Carboxyl, C1-C4 Alkoxycarbonyl, Cyano, Trifluormethyl, C1-C4-Alkylsulfonyl,- Cyclohexyl, Phenyl oder Sulfo substituierten Benzoxazol-2-yl-,. Benzthiazol-2-yl-, Thiazol-2-yl-, Benzimidazol-2-yl-, Chinazol-4-on-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl-, 2- oder 4-Pyridyl-Rest und R1 für Wasserstoff oder eine Sulfonsäuregruppe stehen.
  2. 2) Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A für einen gegebenenfalls durch 1 - 2 C1-C4-Alkylgruppen, 1 - 2 Chlor, C1-C4-Alkoxy-, C1-C4-Alkylsulfonyl-, Carboxyl-, C1 -c4-Alkoxycarbonyl-, Cyclohexyl-, Phenyl- oder Sulfonsäurereste substituierten Benzoxazol-2-yl-, Benzthiazol-2-yl-, Thiazol-5-yl-, Benzimidazol-2-Yl-, Chinazol-4-on-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl- oder 4-Pyridyl-Rest steht.
  3. 3) Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für CN und A für einen gegebenenfalls durch Methyl, Ethyl, Chlor, Methoxy, Ethoxy oder Sulfo substituierten Benzthiazol-2-yl- oder Benzoxazol-2-yl-Rest stehen.
  4. 4) Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 3, bei denen Y für einen Rest steht, dadurch gekennzeichnet, daß man Hydroxy-Verbindungen der Formel worin X, A, R und R1 die in Anspruch 1 bis 3 genannte Bedeutung besitzen, zunächst mit einem Halogenid des 5-wertigen Phosphors umsetzt und die erhaltene Dihalogenphosphonyloxy-Verbindung anschließend hydrolysiert.
  5. 5) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Halogenid des 5-wertigen Phosphors Phosphoroxidtrichlorid, Phosphoroxidtribromid oder Phosphorpentachlorid einsetzt.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 3 , bei denen Y für einen Rest steht, dadurch gekennzeichnet, daß man Hydroxy-Verbindungen der Formel worin X, A, R und R1 die in Anspruch 1 bis 3 genannte Bedeutung besitzen, mit Chlorsulfonsäure, Bromsulfonsäure, Sulfurylchlorid oder Sulfurylbromid umsetzt und. im Fall der Umsetzung mit Sulfurylchlorid oder -bromid den erhaltenen Halogenschwefelsäure-O-ester anschließend hydrolysiert.
  7. 7. Verfahren nach Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart eines anorganischen oder organischen Säurefängers durchführt.
  8. 8. Chromogene oder fluorogene Phosphorsäure- oder Schwefelsäureester enthaltende Testmittel für den photometrischen bzw. fluorimetrischen Nachweis von Phosphatasen bzw. Sulfatasen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als chromogene bzw. fluorogene Ester Verbindungen nach Anspruch 1- bis 3 enthalten.
  9. 9. Testmittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ester in einem Trägermaterial enthalten sind.
  10. 10. Verfahren zur Bestimmung von Phosphatase- bzw. Sulfatase-Aktivität in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit einer Verbindung nach Anspruch 1 bis 3 bzw.
    einem Testmittel nach Anspruch 8 oder 9 in Kontakt bringt und den zeitlichen Verlauf der Lichtabsorption bzw. der Fluoreszenzintensität der Probe vermißt.
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