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Immobilisierte Myrosinase, Verfahren zu ihrer Herstellung
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und ihre Verwendung zur Herstellung von natürlichen Aromen Die Erfindung
betrifft immobilisierte Myrosinase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre
Verwendung zur Herstellung von natürlichen Aromen aus Glukosinolate enthaltenden
Pflanzen.
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Glukosinolate enthaltende Pflanzen, Pflanzenteile, Samen und Früchte,
wie Meerrettich, Senf, Kapern, Rettich, Radieschen, Raps und die verschiedenen Kohlarten
entwickeln ihren typischen Eigengeruch und -geschmack, der im wesentlichen durch
Isothiocyanate hervorgerufen wird, dann, wenn durch Zerstörung der Zellwände arteigene
Enzyme, sogenannte Myrosinasen, die Glukosinolate zu den Isothiocyanaten spalten
können. Die wirtschaftliche Gewinnung der Aromen, insbesondere der Öle, des Senfs
und des Meerrettichs, erfolgt daher durch Wasserdampfdestillation der stark zerkleinerten,
die Glukosinolate enthaltenden Teile. Da die Lagerstabilität so gewonnenen Aromas
wegen der hohen Reaktivität und der hohen Flüchtigkeit der Isothiocyanate stark
beeinträchtigt ist, wäre es sinnvoll, die Öle erst
kurz vor Gebrauch
zu gewinnen. Dem steht aber entgegen, daß, abhängig von der Art der Ausgangsstoffe,
bei lagerfähigen Ausgangsstoffen wie z.B. Meerrettichwurzeln, der Gehalt an Aromasubstanzen
im Laufe der Zeit erheblich abnimmt oder die Aktivität der Myrosinase bei nicht
ohne Konservierung beständigen Ausgangsmaterialien durch das Konservierungsverfahren
zerstört wird.
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Es wurde eine neue Form der Myrosinase, die immobilisierte Myrosinase,
gefunden.
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Die immobilisierte Myrosinase behält ihre Aktivität bei der Lagerung
und ermöglicht bei Bedarf aus Ausgangsmaterialien, die Glukosinolat enthalten, die
entsprechenden natürlichen Aromen freizusetzen.
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Die Immobilisierung der freien Myrosinase, wie sie aus Naturprodukten
gewonnen wird, bewirkt eine Stabilisierung ihrer Aktivität durch Bindung an verschiedenen
Träger substrate Die freie Myrosinase kann nach an sich bekannten Verfahren (Chemie
in unserer Zeit 12, 182 (1978)) extraktiv aus Myrosinase enthaltenden Naturprodukten,
z.B.
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entfettetem weißem Senf, gewonnen werden.
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Die Immobilisierung der Myrosinase kann nach an sich bekannten Verfahren
durchgeführt werden, wie sie z.B.
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in einer Zusammenfassung von I. Chibata "Immobilized Enzymes", Halstett
Press, New York (1978), beschrieben sind.
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Die Immobilisierung kann an wasserlöslichen Trägern, wasserunlöslichen
Trägermaterialien oder durch Einschluß erfolgen.
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Es ist möglich, die Immobilisierung der Myrosinase durch kovalente
Bindung an lösliche Träger, z.B. lösliche Stärke, durchzuführen. Die Myrosinase
wird dadurch stabilisiert und kann infolge des hohen Molgewichts des Trägers auf
einfache Weise mit semipermeablen Membrannen von dem Glukosinolat getrennt und wieder
verwendet werden.
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Die Immobilisierung an wasserunlöslichen Trägermaterialien kann an
Ionenaustauschern, Reaktiv-Matrices oder durch Quervernetzung an den Trägermaterialien
erfolgen.
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Ein Beispiel für Einschluß-Verfahren ist der Einschluß der Enzymlösung
in semipermeable Hohlfasern mit einer Porengröße, die bewirkt, daß die Myrosinase-Moleküle
im Innern der Hohlfasern zurückgehalten werden.
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Bevorzugt erfolgt die Immobilisierung der Myrosinase auf wasserunlöslichen
Trägermaterialien.
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Als wasserlöslichen Träger für die Adsorption der Myrosinase seien
beispielsweise Ionenaustauscher genannt. Besonders bevorzugt werden schwach saure
anorganische oder organische Ionenaustauscher. Als anorganische Ionenaustauscher
seien z.B. Zeolithe oder Aluminiumsilikate genannt. Als organische Ionen-
austauscher
kommen beispielsweise solche auf Kunstharz-, Cellulose-, Stärke- oder Dextran-Basis
infrage.
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Eine besonders feste Bindung an wasserunlösliche Träger wird durch
kovalente Verknüpfung der Myrosinase an aktivierte Matrices erreicht. An Matrices
mit Hydroxylgruppen oder Aminogruppen kann eine kovalente Bindung, z.B. mit Reagenzien
wie Bromcyan, Chlorcyan oder Trifluorchlor-pyrimidin durchgeführt werden. Als Matrices
können Cellulose und Agarose, Polymere mit Oxiran- oder Anhydridgruppen und Silikate
verwendet werden.
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Aus kinetischen Gründen ist die Verwendung von Membrangebundenen Enzymen
besonders vorteilhaft. Als Membranen seien beispielsweise genannt: Membranen hergestellt
auf Basis Celluloseacetat, Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polypropylen, Polysulfon,
Ionenaustauscher-Membranen mit positiven oder negativen Ladungsträgern oder Membranen
mit eingeschlossenen organischen oder anorganischen Trägermaterialien, wie z.B.
in Polyvinylchlorid eingeschlossenes Kieselgel.
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Es ist auch möglich, die Myrosinase durch Quervernetzung an Trägermaterialien
zu binden. Als Trägermaterialien seien Kationaustauscher oder Membrane genannt,
an die die Myrosinase adsorbiert und dann durch Zugabe von Glutardialdehyd oder
von anderen bifunktionellen Reagenzien durch Quervernetzung gebunden wird.
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Erfindungsgemäß werden immobilisierte Myrosinasen besonders bevorzugt,
bei denen die Immobilisierung an schwach sauren Kationenaustauschern, reaktiv auf
Matrices oder durch Quervernetzung auf Trägermaterialien erfolgt.
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Bevorzugte schwach saure Kationenaustauscher sind Harze, die durch
Polymerisation von Methacrylsäure, Acrylsäureester, Niederalkohole und/oder Acrylnitril
hergestellt wurden, wobei als Vernetzungsmittel Divinylbenzol verwendet werden (Ullmann,
4. Aufl., Bd. 13, S.
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301).
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Bevorzugte Kationenaustauscher sind auch dreidimensional vernetzte
Polysaccharide, die durch Quervernetzung der linearen Makromoleküle des Dextrans
erhalten werden können (O.R. Zaborsky "Immobilised Enzymes", CRC Press 1977)-Bevorzugte
reaktive Matrices sind mit Cyanbromid aktivierte Agarose und Oxirangruppe enthaltende
Polymere.
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Bevorzugte Trägermaterialien, auf die die Myrosinase durch Quervernetzung
mit bifunktionellen Verbindungen, wie z.B. Glutardialdehyd oder z.B. wasserlösliche
g , 2 -Dicarbonsäurederivate von Polyethylenoxyden verschiedener Kettenlänge gebunden
wird, sind Membranen z.B. auf Basis Celluloseacetat, Polystyrol, Polyvinylchlorid,
Polypropylen, Polysulfon, Ionenaustauscher-Membranen mit positiven oder negativen
Ladungsträgern oder Membranen mit eingeschlossenen organischen oder anorganischen
Trägermaterialien, wie z.B. in Polyvinylchlorid eingeschlossenes Kieselgel.
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Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von immobilisierter Myrosinase
zur Herstellung von natürlichen Aromen. Dabei werden die durch Extrakticn von Glukosinolat
enthaltenden Naturprodukten gewonnenen Extrakte in wäßrigem Medium im pH-Bereich
von 4 bis 8, bevorzugt bei pH 5 bis 7, mit der immobilisierten Myrosinase in einem
Rührgefäß auf einer Chromatographiesäule oder in einem Membranreaktor in Kontakt
gebracht und die freigesetzten Aromastoffe destillativ-extraktiv gewonnen.
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Die Temperatur bei der Gewinnung der Aromen beträgt 0 bis 90"C, bevorzugt
20 bis 700C, wobei im Rührgefäß und auf der Chromatographiesäule vorzugsweise bei
Raumtemperatur, im Membranreaktor wie vorzugsweise bei 35 bis 600C gearbeitet.
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Die Gewinnung des Glukosinolat-Extraktes kann nach bekannten Verfahren
durchgeführt werden. So kann nach Helv.
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Chim. Acta 31, 1432 (1948) das Ausgangsmaterial tiefgefroren zerkleinert
werden und mit Methanol bei etwa +100C ausgezogen werden, bevor die Myrosinase zur
Wirkung kommt. Vorteilhafter ist es jedoch, das unzerkleinerte Ausgangsmaterial
mit Methanol unter Rückfluß zu kochen, um die Myrosinase zu zerstören, dann das
Ausgangsmaterial zu zerkleinern und erschöpfend mit Methanol zu extrahieren. Nach
dem Entfernen des Extraktionsmittels erhält man einen lagerfähigen Trockenextrakt.
Dieser Trockenextrakt kann nach Bedarf mit der erfindungsgemäßen immobilisierten
Myrosinase in die natürlichen Aromen überführt werden, indem man eine 0,1
bis
10 Gew-%ige wäßrige Lösung mit immobilisierter Myrosinase versetzt und in einem
Rührgefäß rührt. Vorteilhafter ist es jedoch, die wäßrige Extraktlösung durch eine
Chromatographiesäule zu pumpen, die mit immobilisierter Myrosinase gefüllt ist,
oder eine 0,1 bis 10 Gew.-%ige wäßrige Lösung durch einen Membranreaktor zu pumpen,
in den eine mit Myrosinase beladene, flache oder kerzenförmige Membrane eingespannt
ist. Aus der Reaktionslösung lassen sich die Aromen durch übliche Extraktion mit
mit Wasser nicht mischbaren niedrigsiedenden Lösungsmitteln, z.B. Methylenchlorid,
Fluorkohlenwasserstoffe der Methan- und Ethanreihe (Frigen), Diethylether usw.,
oder durch Wasserdampfdestillation isolieren.
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Überraschenderweise ist die Stabilität der erfindungsgemäßen immobilisierten
Myrosinase wesentlich höher als die der freien Myrosinase. So zeigt sich, daß unter
gleichen Bedingungen bei 250je die Halbwertzeit einer an einem Kationenaustauscher
gebundenen Myrosinase etwa 100 Tage beträgt gegenüber 3,5 Tagen einer wäßrigen Lösung
freien Myrosinase.
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Beispiel 1 40 g weißer Senfsamen werden schonend gemahlen und zweibis
dreimal mit Petrolether entfettet. Den getrockneten Rückstand versetzt man mit 100
ml Wasser und extrahiert das Enzym durch Rühren während 2 Stunden bei Zimmertemperatur.
Der Überstand wird abzentrifugiert und mit 200 ml 96 %igem Alkohol ausgefällt. Den
flockigen Niederschlag wäscht man in 70 %igem Alkohol und schlämmt ihn in 100 ml
Wasser auf. Die Suspension wird klarfiltriert und die Rohmyrosinaselösung gefriergetrocknet.
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Erhalten wird ein weißes Pulver (400 mlg) mit etwa 10 % N.
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Beispiel 2 15 g eines schwach sauren Kationenaustauschers werden bei
pH 7.0 mit einer Lösung von 450 mg nach Beispiel 1 hergestellter Myrosinase in 90
ml Wasser 5 Stunden gerührt. Dann wird der Ionenaustauscher abfiltriert und viermal
mit Wasser nachgewaschen.
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Der mit Myrosinase beladene Kationenaustauscher wird in eine Glassäule
gefüllt (15.0 x 1.0 cm) und bei 250C gehalten. Von oben nach unten wird eine 0,0022
molare Sinigrinlösung unterschiedlich schnell durchgepumpt und die austretende Flüssigkeit
mit Hilfe eines Fraktionssammlers aufgefangen. Der Glucosegehalt der Fraktionen
wird enzymatisch bestimmt:
| Durchsatz der Glucose im Überstand (g/l nach Minuten) |
| Sinigrinlösung |
| ml/h 0' 15' 30' 45' 60' |
| 13 0.0363 0.0475 0.129 0.351 0.390 |
| 27 0.0233 0.0302 0.318 0.351 0.387 |
| 54 0.0292 0.360 0.329 0.320 0.346 |
Der 100%-Wert beträgt bei dieser Konzentration 0,396 g Glucose/l, so daß die Umsätze
bei 13 bzw. 27 ml/h nach einer Stunde höher als 98%ig liegen. Unter Berücksichtigung
des Totvolumens der Säule ist die Aufenthaltszeit bei dieser Fördergeschwindigkeit
ungefähr 5 bzw. 2,5 Elinuten.
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Beispiel 3 1 g Kationenaustauscher wird bei pH 7,0 mit einer Lösung
von 40 mg nach Beispiel 1 hergestellter Myrosinase in 30 ml Wasser über Nacht geschüttelt.
Der Ionenaustauscher wird abfiltriert und viermal mit jeweils 100 ml Wasser nachgewaschen.
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Zur Bberprüfung der gebundenen Myrosinaseaktivität wird er mit 20
ml einer wäßrigen 0,0024 molaren Lösung von Sinigrin versetzt, geschüttelt-und die
freigesetzte Glucose enzymatisch wie in Beispiel 2 bestimmt.
| Reaktionszeit freigesetzte Glukose |
| in Stunden |
| g/l |
| 1 0.0164 3.8 |
| 2 0.0415 9.6 |
| 6 0.1037 24 |
| 15 0.4078 94.4 |
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Der typische stechende Geruch des Allylisothiocyanates ist bereits
nach wenigen Minuten wahrnehmbar.
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Beispiel 4 In eine wäßrige Lösung des Enzyms Myrosinase mit einer
Konzentration von 3 g/l wird eine Kationenaustauscher-Membrane (Polymer-Membran
mit negativer Ladung und einer Porenstruktur von 0,2-0,8 ) eingetaucht und zur Einstellung
des Adsorptionsgleichgewichtes drei Stunden bei Zimmertemperatur in einem Exsiccator
bei geringem Unterdruck aufbewahrt. Zur Immobilisierung der adsorbierten Myrosinase
wird die Membrane aus der Enzymlösung herausgenommen, anhaftende Enzymlösung durch
kurzzeitiges Eintauchen in Wasser abgewaschen und das Enzym durch Einlegen in eine
wäßrige, 1 %ige Glutardialdehyd-Lösung in der Porenstruktur der Membrane quervernetzt.
Die Enzymmembran wird in einem Reaktor zwischen zwei plangeschliffenen Flächen eingespannt
und eine gekühlte, wäßrige Sinigrin-Lösung mittels einer Pumpe über einen Wärmeaustauscher
durch die Enzymmembran gedrückt. Die
enzymatische Hydrolyse des
Sinigrins zum Allylisothiocyanat erfolgt bei kurzer Verweilzeit in der Porenstruktur
der Enzymmembrane. Die Konzentration der Sinigrin-Lösung beträgt 0,5 mg/ml, die
Temperatur im Enzym-Membran-Reaktor 390C und die Durchflußgeschwindigkeit 50 ml/Std.
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Die effektive Membranfläche beträgt 12,5 cm2. Die Umsatzrate wird
durch Messung der freigesetzten Glucose bestimmt. Das gebildete Allylisothiocyanat
wird nach Kühlung aus der Produktlösung mit Fluorchlorethan extrahiert.
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Die Figur 1 zeigt bei kontinuierlichem Durchsatz dieprozentuale Umsatzrate
als Funktion der Zeit.
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Aus einer Sinigrin-Lösung mit 0,5 mg/ml werden bei einer Umsatzrate
von 70 % 0,084 mg Allylisothiocyanat pro ml erhalten.
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Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 40 ml/Std. und einer Reaktionstemperatur
von 450C werden aus 0,5 mg/ml Sinigrin-Lösung bei einer Umsatzrate von 92 % 0,11
mg Allylisothiocyanat pro ml erhalten.
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Die prozentuale Umsatz rate bei kontinuierlichem Durchsatz wird in
der Figur 2 als Funktion der Zeit wiedergegeben.
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Beispiel 5 200 g Meerrettichwurzeln werden in 500 ml kochendes Me
thanol gegeben und 40 Minuten unter Rückfluß behandelt.
Danach
werden die Wurzeln mechanisch zerkleinert und diese Masse mit frischem Methanol
nochmals unter Rückfluß während einer Stunde extrahiert. Die- filtrierten Extrakte
werden vereinigt und zur Trockne eingedickt (gelb-braunes Ö1). Die Ausbeute an Extrakt-Trockensubstanz
hängt vom Alter der Wurzel ab und beträgt bei frischen Wurzeln 10 bis 20 % der eingesetzten
Trockensubstanz.
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Eine 1 %ige wäßrige Meerrettichextraktlösung wird durch die Säule
nach Beispiel 2 mit einer Geschwindigkeit von 27 ml/h gepumpt und der Verlauf der
Glucosefreisetzung enzymatisch untersucht.
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Reaktionszeit Glucose g/l in Minuten 0 0.000 15 0.0915 30 0.402 45
0.485 60 0.508 Der Glucosegehalt von 0.508 g/l entspricht einem Umsatz der Thioglycoside
von etwa 86 %.
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Beispiel 6 Die Stabilität des immobilisierten Enzyms wird bei 200C
ermittelt. Wasser mit pH 7.0 wird kontinuierlich durch
die Säule
nach Beispiel 2 gepumpt (13 ml/h), und in bestimmten Abständen durch eine 0.0022
molare Sinigrin-Lösung ersetzt. Die Freisetzungsgeschwindigkeit der Glucose wird
bestimmt und die Glucosekonzentration nach 100 Minuten als Index genommen.
| Alter der Enzym- Glucose in Eluent nach 100 Minuten |
| säule |
| (Tage) g/l rel. % |
| 0 0.390 100 |
| 14 0.385 98.7 |
| 20 0.353 90.4 |
| 30 0.333 85.4 |
| 37 0.300 76.9 |
| 54 0.284 72.8 |
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, nimmt die Aktivität im Laufe der Zeit langsam
ab. Diese Werte ergeben eine Halbwertszeit von etwa 100 Tagen. Die Halbwertszeit
einer Myrosinase-Lösung bei pH 7.0 und 25"C beträgt nach eigenen Messungen etwa
3.5 Tage.
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Beispiel 7 Eine Säule (19 x 2,5 cm) mit ungefähr 1-2 g immobilisierter
Myrosinase nach Beispiel 2 wird für präparative Zwecke eingesetzt. Eine 1 %ige Lösung
des nach Beispiel 5 erhaltenen Meerrettichextraktes (1250 ml) wird durch die Säule
gepumpt mit einer Geschwindigkeit von 52 ml/
Stunde. Die austretende
Flüssigkeit wird mit Fluorchlorethan extrahiert und der flüssige Extrakt analytisch
und sensorisch untersucht. Der für Meerrettich typische Geschmack wird hierfür festgestellt.
Ebenfalls wird in etwa gleichen Mengen Allyl- wie Phenylethylisothiocyanat mittels
Gaschromatographie festgestellt.
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Beispiel 8 Das Enzym Myrosinase, erhalten nach Beispiel 1, wird an
Membranen (eine Polymer-Membrane auf Basis Polyvinylchlorid mit Kieselgel als Füllmaterial
und mit einer Porenstruktur von 0,2 - 0,6 ) durch Quervernetzung immobilisiert.
Die Membranen werden vollständig in eine 0.5 Zige Lösung des Enzyms in 10 3M Acetatpuffer
bei pH 5.0 und 4"C getaucht und gelegentlich gerührt. Nach 3 Stunden werden die
beladenen Membrane in einer kalten 3.5 eigen Glutardialdehydlösung in 0.001 M Acetatpuffer
(pH 5.0) während 3 Stunden behandelt. Die Glutardialdehydlösung wird zweimal während
dieser Zeit gewechselt.
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Die so erhaltene quervernetzte Membrane wird in eine Vorrichtung gespannt
und eine 1,5 %ige wäßrige Lösung des Meerrettichextraktes nach Beispiel 5 durchqepumpt.
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Die Glucosefreisetzung wird enzymatisch bestimmt: Zeit Glucose g/l
(Stunden) 0 0.09 1 0.80 2 0.82 3 0.89
Die Freisetzung der Glucose
aus den Glucosinolaten und die Entstehung des Aromas beträgt ca. 90 %. Das Aromagemisch,
das durch Extraktion gewonnen wird, zeigt die zu erwartende Zusammensetzung und
Aromaeigenschaften.
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Beispiel 9 20 mg Myrosinase werden mit 2 g mit Bromcyan aktiviertem
Agarosegel in einer 0.1 molaren NaHCO3-Pufferlösung, die zusätzlich 0.5 molar an
Kochsalz ist, bei Raumtemperatur langsam geschüttelt. Dann wird nicht gebundenes
Enzym zusammen mit dem Puffer durch Waschen entfernt. Noch freie, aktive Gruppen
werden durch Reaktionen mit 1 molarem Ethanolamin bei pH 8 blockiert und das erhaltene
Gel erschöpfend gewaschen. Das gesamte immobilisierte Enzymsystem wird mit 40 ml
0.0024 molarer Sinigrinlösung versetzt und im geschlossenen Gefäß über Nacht geschüttelt.
Der enzymatisch ermittelte Glucosewert (0.391 g/l) entspricht einer 90 %igen Freisetzung
des Allylisothiocyanates, das auch geruchlich sehr stark wahrnehmbar ist.
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Das abgetrennte und geruchlich neutral gewaschene immobilisierte Enzymsystem
wird nochmals mit Substrat versetzt, dieses Mal mit 120 ml einer 0.0024 molaren
Sinigrinlösung. Nach 16 Stunden bei Zimmertemperatur ergibt die Glucoseanalyse eine
95 %ige Freisetzung.
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Die Stabilität dieses immobilisierten Enzymsystems wird analog Beispiel
6 in einer Säule (Dimensionen der Säu-
lenfüllung: 6.5 x 1.6 cm)
untersucht. Die Substratkonzentration sowie die Pumpengeschwindigkeit entsprechen
den Werten im Beispiel 6. Die Freisetzungsgeschwindigkeit der Glucose wird bestimmt
und die Konzentration nach 100 Minuten als Index genommen.
| Alter der Glucose in Eluent nach 100 Minuten |
| Enzymsäule |
| (Tage) gil rel. % |
| 1 0.396 100 |
| 37 0.384 97 |
| 46 0.362 91-.4 |
| 52 0.359 90.1 |
| 63 0.329 83.1 |
| 74 0.315 79.6 |
| 99 0.295 74.5 |
| 128 0.234 59.1 |
Wie aus der Tabelle ersichtlich ist, ergeben diese Meßwerte eine Halbwertszeit von
etwa 150 Tagen.
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Beispiel 10 Myrosinase wird an einem Oxiran-Acrylharzpolymerisat kovalent
immobilisiert. 106 mg des Enzyms nach Beispiel 1 werden in 10 ml 1,0 molarem Kaliumphosphatpuffer
bei pH 7.4 gelöst und die Lösung gleichmäßig mit einer Pipette auf 1 g des Polymers
gegeben und in einem geschlossenem Gefäß 72 Stunden lang bei Raumtemperatur
stehen
gelassen. Anschließend wird auf einer Glasfritte zunächst mit 50 ml entionisiertem
Wasser, danach mit 150 ml 1,0 molarem NaCl und zuletzt noch zweimal mit Wasser gewaschen.
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Das immobilisierte Enzym wird analog Beispiel 2 mit 300 ml einer 0.0024
molaren Sinigrinlösung versetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur geschüttelt.
Die Glucosebestimmung ergibt eine 92 %ige Freisetzung.
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Das Ö1, welches analog aus dem Meerrettichextrakt gewonnen wird, zeigt
ausgezeichnete sensorische Eigenschaften.
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