DE3233055A1

DE3233055A1 - Optische durchflussvorrichtung zur untersuchung von in einer fluessigkeitsstroemung suspendierten teilchen

Info

Publication number: DE3233055A1
Application number: DE19823233055
Authority: DE
Inventors: Robert C. 33146 Coral Gables Fla. Leif
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1982-09-06
Filing date: 1982-09-06
Publication date: 1984-03-08
Anticipated expiration: 2002-09-07
Also published as: DE3233055C2

Description

Patentanwälte

Dip!.-Ing. K. Schieschke * £

8000 München 40, Elisabethstr. 34

COULTER ELECTRONICS, INC. Hialeah/Florida
U.S.A.

Optische Durchflußvorrichtung zur Untersuchung von in einer Flüssigkeitsströmung suspendierten

Teilchen

Die Erfindung bezieht sich auf eine optische Durchflußvorrichtung zur Untersuchung von in einer Flüssigkeitsströmung suspendierten Teilchen.

Für viele Anwendungszwecke selbsttätiger Analysegeräte mit Teilchendurchfluß ist es nicht möglich, nur eine kleine Anzahl von Teilchenindikatoren zur Kennzeichnung jeden in einer heterodispersen Zellenpopulation einer Probe vorhandenen Teilchentyps zu verwenden. Bisher wird mit den meisten Durchflußvorrichtungen die Fluoreszenz, Lichtstreuung oder das elektronische Zellvolumen gemessen. Die größten Konstruktionsschwierigkeiten ergeben sich aber bei gleichzeitiger Durchführung von optischen Messungen und Impedanzmessungen in einem kombinierten elektro-optischen Teilchenanalysegerät.

Die bisher bekannten kombinierten elektro-optischen Teilchenanalysegeräte führen die elektronische Zellvolumenmessung vor den optischen Messungen durch, so daß diese beiden Meßarten in Beziehung gebracht werden müssen. Diese ZuordnungsSchwierigkeit ist bei sehr langsamem Teilchenfluß unerheblich, bei

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hoher Teilchendurchflußgeschwindigkeit können aber die erfaßten Signale durch äußere Einwirkungen verzerrt werden, wie z.B. durch Anhäufungen von Zellen, die nach Durchtritt durch eine Volumen-Meßöffnung wieder auseinanderfallen und dann getrennt zur optischen Meßzone weiterströmen, durch das Vorhandensein nichtfluoreszierender Teilchen und durch die Möglichkeit, daß zwei benachbarte Zellen in der Flüssigkeitsströmung ihre Position wechseln. Zur Lösung dieses Zuordnungsproblems wurden bisher zwei Wege eingeschlagen. Ein Lösungsweg führte zur Entwicklung einer Spezial-Schaltanordnung zur Kompensation der

von

Zeitverzögerung zwischen den/einem gegebenen Teilchen erzeugten optischen und elektronischen Signale. ■"<·

Der andere Lösungsweg brachte ein elektro-optisches Teilchenanalysegerät hervor, in welchem alle Messungen gleichzeitig durchgeführt werden, wobei die komplexe und unsichere Zuordnung der bei in Strömungsrichtung nacheinander vorgenommenen Messungen erhältlichen Daten entfällt. Dieses elektro-optische Teilchenanalysegerät ist aus Veröffentlichungen bekannt("Kombinierte optische und elektronische Analyse von Zellen mit AMAC Meßwertwandlern"¹¹" The Journal of HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY" Bd. 25, No. 7 (1977)) . Dieses Gerät zur Untersuchung mehrerer Teilchenparameter verwendet eine quadratische Meßöffnung, in welcher alle Parameter gleichzeitig gemessen werden. Diese quadratische Öffnung ist im Inneren einesdurch vier aneinandergekittete Pyramiden gebildeten Würfel eingeschlossen. Die optischen und mechanischen Merkmale dieser Anordnung haben sich aber nicht als optional erwiesen.

Um von einer Erfassungszone des Teilchenanalysegerätes ausgehendes divergierendes Fluoreszenzlicht auffangen zu können, so daß die nachfolgenden optischen Elemente das Licht zur Weiterbearbeitung fokussieren können, um z.B. aus Fluoreszenzlicht Streulicht auszufiltern, wird das Fluoreszenzlicht normalerweise fokussiert, so daß es durch eine Nadellochapertur fällt. Sperrfilter und Fotovervielfacher arbeiten außerdem wirksamer, wenn das Licht senkrecht auf ihre Flächen auftrifft. Das divergierende Fluoreszenzlicht muß nicht nur ausgerichtet werden, sondern

muß einen im wesentlichen festen Winkel zur Erfassungszone einschließen, um aufgefangen werden zu können.

Um also zu filterndes Licht fokussieren oder um senkrechte Lichtstrahlen erzeugen zu können, ist mindestens ein optisches Element, z.B. eine Sammellinse erforderlich. Je stärker das von der Sammellinse aufgefangene Licht divergiert, desto größer muß die Leistung der Linse sein. Praktische Beschränkungen einer preiswerten Sammellinse erfordern eine F-Zahl von mindestens 0.7, was das Auffangen des Lichtes auf einen halben Winkel von etwa 40 beschränkt. Die Gegebenheiten der optischen Flächen des vorstehend beschriebenen Würfels bewirken, daß das Licht vom planen Außenumfang des Würfels weit divergierend austritt. Bei Verwendung nur einer einzigen, preiswerten, üblichen Sammellinse kann das weit divergierende Licht nur teilweise zu einem gerichteten, parallelen Strahlenbündel aufgefangen werden. Verwendet man z.B. eine quadratische Öffnung, so ist die zur genauen Ausrichtung verfügbare Lichtmenge auf den von einer der Planflächen der quadratischen Öffnung überspannten Bereich beschränkt. Wird diese quadratische Öffnung mit dem flachen Außenumfang der Würfelgestalt kombiniert, kann aufgrund der durch die Würfelform erzeugten weiten Divergenz nicht das gesamte, auf die plane Fläche der Öffnung fallende Licht aufgefangen werden. Auch der Grad der möglichen Weitwinkelbeleuchtung wird durch die Würfelkonstruktion weitgehend beschränkt.

Die Gegebenheiten der optischen Flächen des Würfels erschweren zudem das Auffangen von Streulicht, insbesondere wenn das Streulicht mit seinem festen Ablenkwinkel von der Mittelachse des einfallenden Beleuchtungsstrahls in Beziehung gesetzt wird. Außerdem erschweren die optischen Flächen des Würfels die Anwendung der Fourier'sehen Transformationsoptik.

In der Mikroskopie ist es bekannt, daß die Anordnung eines Objektes innerhalb der Objektivlinse zur größtmöglichen Licht-Auffangstärke und -Auflösung führt. Außerdem ist bekannt, daß

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die Verwendung von Wasserimmersionssysteinen größere optische Wirksamkeit zeigt als Trockensysteme, daß aber die größte Wirksamkeit mit einem Immersionsmedium erzielbar ist, welches den gleichen Brechungsindex wie die Linse besitzt.

Die Erfindung bezieht sich auf eine optisch durchlässige Durchflußvorrichtung zur Messung optischer Signale, die von in einer Flüssigkeitsströmung suspendierten Teilchen erzeugt werden, die durch eine in der Durchflußvorrichtung vorgesehene Öffnung wandern und von einer Strahlenquelle bestrahlt werden. Die Durchflußvorrichtung weist zumindest einen im wesentlichen sphärischen Bezirk zum Auffangen der Strahlung auf. Dieser im wesentlichen sphärische Bezirk begrenzt eine Rotationsfläche, die zu einer durch die Öffnung verlaufenden optischen Achse radial symmetrisch ist.

Wird eine quadratische Öffnung verwendet, so ist zumindest eine Planfläche senkrecht zur optischen Lichtauffangachse ausgerichtet. Nach der ersten Ausführungsform weist die Durchflußvorrichtung ein optisch durchlässiges sphärisches Element mit einer Öffnung in seinem Mittelpunkt auf. Nach der zweiten Ausführungsform ist die Öffnung außermittig gegenüber dem Krümmungsmittelpunkt des sphärischen Elements angeordnet.

In praktischen Betrieb beleuchtet die Lichtstrahlung einzelne Teilchen in einer Flüssigkeitsströmung in einer innerhalb der Öffnung gelegenen Meßzone zur Erzeugung optischer Signale; Falls gewünscht, können auch gleichzeitig für jedes beleuchtete Teilchen Impedanzmessungen durchgeführt werden. Nach der ersten Ausführungsform ist die Meßzone im Mittelpunkt des sphärischen Elements gelegen; daher begrenzt die sphärische Umfangsflache des sphärischen Elements die Lichtbrechung des optischen Signals auf ein Minimum. Nach der zweiten Ausführungsform wirkt der sphärische Umfang des sphärischen Elements längs des einen Endes der optischen Lichtauffangachse als stärkere Linse, so daß die Strahlung von dem sphärischen Element mit einem verhältnismäßig geringen Divergenzgrad ausgeht.

Nach einer bevorzugten Konstruktion der ersten und zweiten Ausfuhrungsformen wird eine Öffnung mit mindestens einer Planfläche verwendet. Die vom Mittelpunkt der Öffnung ausgehende Strahlung trifft auf die Planfläche auf, wird von einer Strömungs-Glas-Grenzschicht radial symmetrisch um die optische Lichtauffangachse gebrochen und dann durch eine Glas-Luft-Grenzschicht der sphärischen Fläche radial symmetrisch um die optische Lichtsammelachse gebrochen, so daß hochgradig gerichtetes Licht wirksam aufgefangen werden kann.

Gemäß einer Abwandlung der ersten Ausführungsform kann ein Teil des sphärischen Elements eine reflektierende Beschichtung aufweisen, um die Lichtaufnahme und/oder die Beleuchtung zu erhöhen. Bei beiden Ausführungsformen läßt sich in Verbindung mit dem sphärischen Element mit nicht parallelem Licht beleuchten, statt mit parallelstrahligem Licht, um so die Schwierigkeiten ungleichmäßiger Beleuchtung innerhalb der Teilchen auszuschließen. Bei beiden Ausführungsformen können ein oder mehrere Bezirke des sphärischen Umfangs des sphärischen Elements in abgewandelter Konstruktion einen sphärischen Abschnitt größerer Krümmung aufweisen, um die Strahlung noch stärker zu konvergieren und auszurichten. Nach weiteren Ausführungsmöglichkeiten hat die Durchflußvorrichtung eine oder mehrere sphärische Abschnitte und mindestens einen nichtsphärischen Abschnitt,so daß sich zusätzliche Lichtauffangflächen ergeben.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispiele näher beschrieben.

In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 eine Seitenansicht im Schnitt durch eine

Durchflußvorrichtung nach einer Ausführungsform;

Fig. 2 eine Seitenansicht im Schnitt nach der Linie 2-2 in Fig. 1;

Fig. 3 eine Draufsicht auf eine Durchflußvorrichtung nach einer zweiten Ausführungsform;

Fig. 4 eine Draufsicht auf eine Variation der ersten Ausführungsform;

Fig. 5 eine Teilansicht der Variation in Fig. 4;

Fig. 6 - eine Draufsicht im Schnitt auf eine Variation der zweiten Ausführungsform nach Fig. 3.

Fig. 1 zeigt eine Durchflußvorrichtung 10 nach einer erstsen Ausführungsform, welche ein optisch durchlässiges, vorzugsweise aus Quarz bestehendes sphärisches Element 12 aufweist. Der Krümmungsmittelpunkt 15 des sphärischen Elements 12 ist mittig von einer Durchtrittsöffnung 14, vorzugswiese mit quadratischem Durchtrittsquerschnitt, umschlossen. Zwei einander entgegengesetzte Anschlußkanäle, nämlich ein Einströmkanal 16 und ein Ausströmkanal 18 schließen sich an die beiden offenen Enden 20 und 22 der quadratischen Öffnung 14 an und enden nach außen an der sphärischen Umfangsflache 23 des sphärischen Elements 12. Somit bilden die Anschlußkanäle 16 und 18 zusammen mit der Durchtrittsöffnung 14 einen eine Flüssigkeitsströmung durch das sphärische Element 12 führenden Kanal. Vorzugsweise sind die Kanäle 16 und 18 und die Durchtrittsöffnung 14 auf der Strömungsachse 19 der Flüssigkeitsströmung zentriert. Der Druckabfall der Flüssigkeitsströmung auf ihrem Weg durch das sphärische Element 12 wird durch die Kanäle 16 und 18 auf ein Minimum beschränkt.

Vorzugsweise wendet man die bekannte Laminarströmungs-Technik an (US-PS 3 710 933 und 3 989 381). Über ein Probeneinführungsröhrchen 24 werden einzeln abgesonderte, in einer Flüssigkeit suspendierte Teilchen, z.B. Zellen, eingebracht. Das Einlaßröhrchen 24 ist von einer Einlaßkammer 26 umgeben, welche eine Hüllströmung zur Zentrierung der mitgeführten Teilchen auf ihrem Weg durch die Öffnung 14 erzeugt. Eine Ausströmkammer

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28 nimmt die Flüssigkeitsströmung nach erfolgtem Durchtritt durch die Öffnung 14 und den anschließenden Ausströmkanal 18 auf. Die Kammern 26 und 28 sind mit dem sphärischen Element 12 über übliche Dichtungen 29 flüssigkeitsdicht verbunden. Obwohl die Öffnung 14 vorzugsweise einen quad ratischen Durchtrittsquerschnitt aufweist, läßt sie sich auch anders, z.B. mit kreisförmigem Durchtrittsquerschnitt ausbilden. Wie noch im einzelnen zu beschreiben, wird für bestimmte Verwendungszwecke von Meßwertwandlern die Ausströmkammer 28, z.B. beim Klassieren von Zellen, weggelassen.

Ein Elektrodenpaar bestehend aus einer strömungsaufwärts ^ngeordneten Elektrode 30 und einer strömungsabwärts angeordnsten Elektrode 32 sind mit den beiden Seiten der Durchtrittsöffnung elektrisch verbunden,und zwischen den Elektroden liegt eine Potentialdifferenz an. Nach bekanntem Verfahren (US-PS 2 656 508 und 4 014 611) wird an den durch die Öffnung 14 tretenden Teilchen eine Impedanzmessung durchgeführt und dadurch anzahl-und volumenbezogene Daten gewonnen. Die einfache Anordnung der zwei Elektroden 30 und 3 2 ist lediglich zur Veranschaulichung einer Art der Impedanzmessung von Teilchen dargestellt. Es sind auch andere bekannte Elektrodenanordnungen in Verbindung mit der Durchflußvorrichtung 10 denkbar (US-PS 4 019 134). Somit ergibt sich in der Durchtrittsöffnung 14 im Mittelpunkt 15 des sphärischen Elements 12 eine Erfassungszone 3 4 für Impedanzmessung und Zählung der mitgeführten Teilchen. Obwohl im ersten Ausführungsbeispiel die Impedanzmessung dargestellt wird, läßt sich die Durchflußvorrichtung 1O auch ausschließlich für die Messung optischer Signale, wie nachstehend noch beschrieben wird, verwenden.

Die Erfassungszone 34 wird von einer Strahlenquelle 36 beleuchtet, welche einen verhältnismäßig gerichteten Strahl, vorzugsweise einen Laserstrahl, erzeugt, der auf einer ersten optischen Achse 40 zentriert ist. Die Beleuchtungstechnik für eine Flüssigkeitsströmung zur Messung des absorbierten Lichts,

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fluoreszierenden Lichts und/oder Streulichts ist allgemein bekannt (US-PS 3 710 933).

Um diese Beleuchtungstechniken unter Verwendung verhältnismäßig parallelen Lichts in Verbindung mit dem sphärischen Element 12 anzuwenden, sind auf dem sphärischen Element 12 zwei gegenüberliegende plane Flächen 41 und 42 ausgebildet, die gleich den Querschnittsabmessungen des Strahls 3 8 oder größer als diese sind. Der Strahl 3 8 durchtritt zweimal die Außenfläche 23 des sphärischen Elements unter einem Minimum an Lichtbrechung. Der durch die mitgeführten Teilchen nicht gestreute Anteil des Lichtstrahls 38 tritt durch das sphärische Element 12, wird von einem Spiegel 3 4 reflektiert und in einer Lichtfalle 44 aufgefangen. Das in Vorwärtsrichtung gestreute Licht wird von einem Vorwärts-Streulicht-Detektor 45 aufgefangen, wie an sich bekannt (US-PS 3 710 933).

Im übrigen erfordert die Durchflußvorrichtung nicht unbedingt das Auffangen von in Vorwärtsrichtung gestreutem Licht noch ist sie darauf begrenzt, da das durch die sphärische Umfangsfläche 23 fallende Streulicht auf vielerlei bekannte Weisen aufgefangen und anschließend analysiert werden kann. Zusätzlich kann das Streulicht auf eine Fourier¹ sehe Ebene fokussiert und dann entweder dort erfaßt oder über bekannte Verfahren der optischen Datenverarbeitung weiterverarbeitet werden.

Die erste Ausführungsform der Durchflußvorrichtung 10 hat den Vorteil, daß bei Durchtritt des Streulichtes durch die sphärische Umfangsflache 23 das sphärische Element 12 im wesentlichen als optisches NON-Element wirkt, im Gegensatz zu den bisher bekannten würfelförmigen Ausführungen. In anderen Worten, das Streulicht tritt in einer im wesentlichen senkrechten Richtung zur sphärischen Umfangsflache 23 aus; damit wird eine, die weite Divergenz des Streulichtes bei den bisher bekannten würfelförmigen Systemen verursachende Brechnung ausgeschlossen, wie die Lichtstrahlen 4 6 erkennen lassen. Aufgrund der durch die Strömung-Glas-Grenzschicht verursachten Brechung ist das aus-

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tretende Licht geringfügig weniger divergent im Vergleich zur Einfallrichtung in die Öffnung 1 4.

Fig. 2 zeigt einen Querschnitt durch die Durchflußvorrichtung 10 in einer durch den Mittelpunkt des sphärischen Elements 12 und senkrecht zur Zeichnungsebene der Fig. 1 verlaufenden Ebene. Wie in der Technik allgemein bekannt, wird von der Meßstelle 34 ausgehendes Fluoreszenz-Licht vorzugsweise rechtwinklig zum Strahl 3 8 aufgefangen. Nach der ersten Ausführungsform sind insbesondere ein Sperrfilter 47 und ein Fluoreszenzlicht-Detektor 48 auf einer zweiten optischen Achse 50 zentriert welche vorzugsweise senkrecht zur ersten optischen Achse 40 verläuft. Im Idealfall begrenzen die erste optische Achse 40 und die zweite optische Achse 50 eine Ebene, welche im wesentlichen senkrecht zur Strömungsachse 19 der Flüssigkeitsströmung verläuft. Um parallelstrahliges Licht auf den Sperrfilter 4 7 und den Detektor 4 8 gelangen zu lassen, wird eine Sammellinse 5 2 verwendet. Die Sammellinse 52 ist vorzugsweise in unmittelbarer Nähe des sphärischen Elements 12 angeordnet. Derartige Linsen- und Detektorsysteme sind allgemein bekannt (US-PS 3 933). Wie das Streulicht durchsetzt das Fluoreszenzlicht die sphärische Umfangsflache 23unter im wesentlichen senkrechtem Einfall, so daß die Brechung des Fluoreszenzlichts auf ein Minimum beschränkt bleibt. Wie die Lichtstrahlen 53 veranschaulichen, läßt die sphärische Umfangsflache 23 das Fluoreszenzlicht gerichtet unter einem Minimum an Brechung aus dem sphärischen Element 12 austreten. Die bei den würfelförmigen Systemen nach dem Stand der Technik verursachte weitwinklige Divergenz ist hier ausgeschaltet. D.er geringe Brechungsgrad der ersten Ausführungsform bewirkt eine leichte Verringerung der Divergenz des austretenden Lichts.

Falls gewünscht, kann bei der ersten Ausführungsform der Durchflußvorrichtung 10, wie aus Fig. 2 ersichtlich, eine reflektierende Beschichtung 54 auf der einen Seite der sphärischen Außenfläche 23 vorgesehen sein. Wie der Lichtstrahl 56 veranschau-

licht/ wird ein Teil des von der Meßzone 34 ausgehenden Lichts durch die reflektierende Beschichtung 54 reflektiert, durchtritt die Meßzone 34 und wird anschließend aufgefangen. Dem Fachmann bieten sich viele bekannte Varia tionen zum Auffangen von Fluoreszenzlicht oder anderen optischen Signalen an.

Zum Beispiel kann die reflektierende Beschichtung 54 aus dichroitischem Material bestehen, um eine Strahlung mit bestimmtem Wellenlängenbereich zu reflektieren, aber einai anderen Wellenlängenbereich durchzulassen. Außerdem kann auch eine andere Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes oder Streulichtes auf der Seite des sphärischen Elements (12) nach Fig. 2 aufgefangen werden, auf der die Beschichtung 54 vorgesehen ist. Diese zusätzliche Auffangmöglichkeit läßt sich durch Ausschluß der reflektierenden Beschichtung 54 oder durch Anbringung einer bekannten dichroitischen reflektierenden Beschichtung 54 erreichen, welche fluoreszierendes Licht unterschiedlicher Wellenlängen unterscheiden kann. Die Durchflußvorrichtung 10 läßt sich außerdem in Verbindung mit bekannten Abtastverfahren mit Spaltschlitz und zur Analyse der Polarisation von Fluoreszenzlicht anwenden. Bei der Analyse von Lichtpolarisation trifft z.B. linear polarisiertes Licht eines Lasers auf die Teilchen und wird dann teilweise depolarisiert. Die Fluoreszenzintensitäten die parallel und senkrecht zur Ebene des polarisierten einfallenden Lichts polarisiert sind, werden gemessen. Diese Messungen erfordern eine optische Ausrichtung der Fluoreszenzlichtsignale. Die Durchflußvorrichtung 10 läßt sich somit zum Auffangen aller von der Meßzone 34 kommenden optischen Signale verwenden.

Vorteilhafterweise läßt sich das sphärische Element 12 durch von der Quelle 36 ausgehendes,nichtparalleles Licht statt des parallelstrahligen Lichts 38 beleuchten. D.h. die Strahlenquelle 36 kann einen konvergenten Strahl auf die Meßzone 34 richten. Das einfallende Licht trifft dann senkrecht auf die sphärische Umfangsflache 23 unter minimaler Lichtbrechung auf, so daß das

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Licht in der Meßzone 3 4 fokussiert wird. Andere Lichtquellen als Laser, z.B. Quecksilber oder Xeononbogenleuchten und übliche episkopische Mikroskopbeleuchtungsquellen lassen sich statt der Laserbeleuchtung in Verbindung mit der Durchflußvorrichtung 10 verwenden. Nicht parallele Lichtquellen beschränken jedoch die Messung des Streul ichtes in Vorwärtsrichtung.

Die Ausströmkammer 28 kann, wie an sich bekannt, in unterschiedlichsten Konstruktionen ausgelegt sein. Sie kann z.B. als einfache Kanuner zum Ableiten der Flüssigkeit der Flüssigkeitsströmung ausgebildet sein (US-PS 3 746 976 und US-PS .\ 4 014 611). Im Strömungssystem der Durchflußvorrichtung 10 kann aber auch die Bildung von Tröpfchen mit darin einzeln abgesonderten Teilchen vorgesehen sein, wobei dann anschließend die Tröpfchen klassifiziert werden. In diesem Fall könnte die Ausströmkammer 28 entfallen, und der Ausströmkanal 18 würde direkt in die umgebende Atmosphäre ausmünden. Dies läßt sich z.B durch Verwendung einer geerdeten zweiten Hüllstromanordnung bekannter Konstruktion (US-PS 3 710 933) durchführen oder aber mit einer geerdeten Plattenanordnung bekannter Konstruktion (US-PS 3 380 584). Soll das Merkmal des Klassifizierens mit gegeben sein, dann sollte die Meßöffnung 14 vorzugsweise ein Tiefe-Breite-Verhältnis von ca. 4 : 1 aufweisen.

Ohne dieses Merkmal sollte dieses Verhältnis ca. 1 : 1 betragen. Die Weite der Öffnung 14 kann je nach Größe der zu untersuchenden Teilchen unterschiedlich bemessen sein. Obwohl das sphärische Element 12 vorzugsweise aus Quarz besteht, lassen sich auch andere Werkstoffe mit hoher Lichtdurchlässigkeit und niedrigem Brechungsindex z.B. Kunststoff, Saphyr für die einzelnen Anwendungszwecke einsetzen.

Die Ausführungsform nach Fig. 1 und 2 wurde bisher in Verbindung mit der Untersuchung von Teilchen, z.B. biologischen Zellen, beschrieben, welche über ein Probeneinführröhrchcn

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eingeleitet werden. Eine weitere Anwendungsform für den Meßwertwandler 10 ist auf dem Gebiet der Chromatografie möglich, wobei optische Durchflußrichtungen zur Analyse einer flüssigen chromatografischen Strömung allgemein Verwendung finden. Auf dem Gebiet der Chromatografie lassen sich die vorstehend beschriebenen Laminarströmungsverfahren und damit das Probeneinführröhrchen 2 4 verwenden, können aber auch entfallen. Folglich kann die zu erfassende Spezies in der Flüssigkeits- oder Gasströmung zentriert oder nicht zentriert geführt werden. Die Bezeichnung "Teilchen" soll in diesem Zusammenhang auch als fluoreszierende Moleküle der chromatograf ischen Strömung verstanden werden. »\

Fig. 1 und 2 zeigen die quadratische Öffnung 14 mit flachen ebenen Flächen 58. Wie bekannt, erfolgt bei Durchtritt das von einem Mittelpunkt 59 der Öffnung 14 ausgehende Licht durch jede plane Fläche 58 eine Brechung durch die Strömung-Glas Grenzschicht 58 der planen Fläche 58 eine radiale symmetrische Beugung desLichts um die optischen Achsen 40 und 50. Jede weitere durch die sphärische Außenfläche 23 erzeugte Brechung führt ebenfalls zur radial symmetrischen Beugung um die optischen Achsen 40 und 50. Die neuartige Kombination der sphärischen Außenfläche 23 mit mindestens einer planen Fläche 58 ermöglicht es, Licht längs der optischen Achse aufzufangen, wobei die dabei 'auftretende Brechung eine radial symmetrische Lichtbeugung um die Achsen 40 une 50 bewirkt. Dies hat zur Folge, daß preiswerte sphärische Linsen, z.B. die Sammellinse 52, einsetzbar sind, um Licht zu einem hochgradig ausgerichteten Lichtstrahl zusammenzufassen. Der Fluoreszenzdetektor kann, obwohl nicht gezeigt, unter Ausnutzung der vorstehend erwähnten Vorteile der planen Flächen 58 auch auf der ersten optischen Achse 40 angeordnet sein. Die Strahlungsquelle 36 und ihre zugehörigen optischen Elemente beeinträchtigen jedoch in beschränktem Maße das Auffangen des Lichtes. Auch der Teilchenstrom kann gegenüber dem Mittelpunkt der quadratischen Durchtrittsöffnung 14 außermittig geführt sein, so daß eine der ebenen Flächen gegenüber den Teilchen einen größeren Bereich überspannt. Da-

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durch ergibt sich ein weiter Winkel für den Lichtempfang und Rechteckimpulse für die Impendanzmessung.

Fig. 3 zeigt eine zweite Ausführungsform der Durchflußvorrichtung 10, wobei die Strömungsachse 19 der Durchtrittsöffnung 14 außermittig gegenüber dem Mittelpunkt 15 des sphärischen Elements 12 angeordnet ist. Wie in der Mikroskopie bekannt, wirkt die außermittige Anordnung einer Lichtquelle in einem sphärischen Linsenelement wie ein Linsenelement mit einer numerischen Apertur in der Größenordnung von 1:4. Die von der Öffnung 14 ausgehende Strahlung durchsetzt die sphärische Umfangsflache 2 3 und wird radial symmetrisch zur zweiten qptischen Achse 50 gebrochen. Die von der Öffnung 14 ausgehenden und auf den gegenüberliegenden Bereich 61 des sphärischen Elements 12 treffenden Lichtstrahlen 60 werden also nach innen
zur zweiten optischen Achse 50 gebrochen. Durch diese Beugurg nach innen geht von dem sphärischen Element 12 ein weniger divergentes, auf der optischen Achse 50 zentriertes Lichtbündel aus und wird durch die Sammellinse 52 parallelgerichtet. Im
Vergleich zu der mit der ersten Ausführungsform verwendeten
Sammellinse 52 bedarf die Sammellinse 52 für die zweite Ausführungsform eines viel geringeren Leistungsvermögens für die gleiche Aufnahme von Licht. Andererseits läßt sich auch eine Sammellinse 52 gleicher Stärke zum Auffangen und Parallelrichten von wesentlich mehr Licht verwenden. Dabei kann nahezu das gesamte von einer der Planflächen 58 der quadratischen Öffnung- 1· ausgehende Licht durch die Sammellinse 52 aufgefangen und zu einem parallelen Strahlenbündel gerichtet werden. Die Strahlenquelle 36 erzeugt eine konvergente Beleuchtung, wie die zwei Richtungspfeile der Strahlen 60 veranschaulichen. Dies erreicht man durch Verwendung eines üblichen dichroitischen Spiegels 63, welcher zum Reflektieren der Beleuchtungsstrahlung bei ihrem Durchtritt durch Fluoreszenzlicht oder umgekehrt dient.

Die Linse 52 dient zum Konvergieren des Beleuchtungslichts
und zum Parallelrichten des auftretenden Fluoreszenzlichtes. Die Linse 52 kann entweder im Abstand zum sphärischen Element

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12 angeordnet oder an diesem befestigt sein. Bei der ersten Ausführungsform nach Fig. 1 und 2 läßt sich gerichtetes Licht auffangen, obwohl die optischen Achsen 40 und 50 nicht senkrecht zur Strömungsachse 19 verlaufen. Bei der zweiten Ausführungsform hingegen müssen die optische^ kolinearen Achsen 40 und zur Achse der Strömung 19 senkrecht stehen. Außerdem muß die zweite optische Achse 50 im wesentlichen durch den Mittelpunkt 15 des sphärischen Elements 12 gehen. Wird Weitwinkelbeleuchtung gewünscht, so muß die erste optische Achse 40 mit der zweiten optischen Achse 50 kolinear sein. Im übrigen entspricht die zweite Ausführungsform in Aufbau und Funktion der ersten Ausführungs form.

Fig. 4 zeigt zwei Variationen der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen. Die von der Strahlenquelle 34 erzeugte Strahlung ist in der Zeichnungsebene konvergent, wie die Lichtstrahlen 64 veranschaulichen. Senkrecht zur Zeichnungsebene gesehen ist die von der Strahlenquelle 36 ausgehende Strahlung verhältnismäßig eng und leicht konvergent. Die Lichtstrahlen 64 werden daher in einem konvergenten, "spaltförmigem"

Bündel auf die Öffnung 14 gerichtet. Da diese Strahlen im wesentlichen senkrecht zur sphärischen Außenfläche 23 auftreffen, erzeugt die Luft-Glas-Grenzschicht des sphärischen Elements nur eine minimale Brechung der austretenden Strahlung. Obwohl die Grenzschicht Glas-Strömung der Öffnungen eine winzige Ablenkung erzeugt, beleuchtet die konvergente Strahlung die durch die Öffnung 14 wandernden Teilchen. Ein schmaler Streifen einer reflektierenden Beschichtung 65 auf der sphärischen Außenfläche 23 bildet einen reflektierenden Spiegel, der die Beleuchtungsstrahlung nach erfolgtem Durchgang durch die Öffnung 14 auffängt. Diese reflektierende Schicht 65 ist im einzelnen in Fig. 5 dargestellt, wobei das Umrißbild der auf den reflektierenden Spiegel 65' auftreffenden Beleuchtungsstrahlung als im wesentlichen ellipsenförmige Kontur 66 dargestellt ist. Die Breite der reflektierenden Beschichtung 65 wird gegenüber der Beleuchtungsstrahlung so klein wie möglich gehalten, so daß

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Streulicht oberhalb und unterhalb der Beschichtung mit Hilfe eines Streulichtdetektors 45-aufgefangen werden kann. In der Durchflußvorrichtung 10 kann ein Lasergehäuse mit dem reflektierenden Spiegel untergebracht werden. Diese Anordnung ermöglicht die Verwendung einer weniger kostspieligen und weniger starken Lichtquelle. Außerdem werden durch Weitwinkelbeleuchtung der Teilchen, wie an sich bekannt, die normalerweise bei der Beleuchtung von biologischen Teilchen durch schmale Strahlenbündel auftretenden Schwierigkeiten vermindert. Die Beleuchtung von Zellen durch verhältnismäßig schmale Strahlenbündel einer Strahlenquelle, z.B. eines Laserlichts, erzeugt "heiße Punkte", d.h. Bereiche mit verhältnismäßig großer Energiedichte im Vergleich zu den angrenzenden Bereichen innerhalb der Zelle. In anderen Worten, die Bereiche ungleichmäßiger Bestrahlung bzw. die sog. "heißen Punkte" stellen eine ungleichmäßige Beleuchtung dar, so daß nicht alle Teile der Zelle der gleichen Energiemenge ausgesetzt sind. Diese "heißen Punkte" beruhen auf den optischen Wirkungen der Grenzen zwischen Zelle und Organellen. Dies trifft insbesondere auf Zellen zu, die einer parallelen Bestrahlung ausgesetzt sind. Außerdem ist es bekannt, daß konvergierende Strahlenbündel, z.B. Laserstrahlung, mit einem Gauß'sehen Intensitätsprofil im Brennpunktbereich durch Beugung parallelgerichtet werden und dadurch die "heißen Punkte" auf die gleiche Art und Weise erzeugen. Problematisch sind diese "heißen Punkte", wenn sie mit Bereichen fluoreszierender Substanz innerhalb der Zelle zusammenfallen, da dann die fluoreszierende Substanz ein Fluoreszenzsignal sehr hoher Intensität erzeugt statt des Fluoresnzenzsignals geringer Intensität, das die fluoreszierende Substanz erzeugt hätte, wenn sie nicht in dem "heißen Punkt" gelegen wäre. Das heißt, wenn der "heiße Punkt" mit der fluoreszierenden Substanz zusammenfällt, ergibt sich ein ungenauer Meßwert für die Fluoreszenz.

Durch Weitwinkelbeleuchtung, wie in Fig. 3 und 4 gezeigt, werden diese Schwierigkeiten weitgehendst behoben. Außerdem schlucken Zellen auch Licht, so daß das Licht von den Zellen nicht gleichmäßig ausgeht.

Wie aus Fig. 4 ersichtlich, ist ein Bereich der sphärischen Umfangsflache 23 nach einer abgewandelten Ausführung mit einem vorspringenden, sphärischen Linsenteil 67 mit im Vergleich zur sphärischen Umfangsflache 2 3 stärkerer Krümmung ausgebildet, so daß das parallelstrahlige Licht ohne Verwendung zusätzlicher optischer Elemente wie z.B. einer Sammellinse 52 erzeugt wird. Diese Linsenteile lassen sich einstückig mit dem sphärischen Element 12 ausbilden oder können als getrennte Teile an diesem befestigt sein. Das sphärische Element 12 selbst ist ein monolithisches Element. Die monolithische Struktur des sphärischen Elements 12 gewährleistet ein verbessertes Auffangen des Lichts durch das Fehlen gekitteter Flächen. Der Klebstoff angekitteter Flächen erzeugt nämlich optische Inhomogenitäten, die Streulicht erzeugen. Die Inhomogenitäten können fluoreszieren₍und im Laufe der Zeit zersetzt sich der Klebstoff.

Wie aus Fig. 4 ersichtlich, besitzt die sphärische Außenfläche 23 einen Außenradius 68, der dem Innenradius des sphärischen Linsenteils 67 entspricht. Das sphärische Linsenteil 67 b sitzt einen Außenradius 70, dessen Krümmungsmittelpunkt 27 auf der zweiten optischen Achse 50 liegt. Der Außenradius 70 ist kleiner bemessen als der Radius 6 8; somit ist die Außenkrümmung des Linsenteils 67 stärker als die der sphärischen Außenfläche 23. Der Umfang der vorliegenden Erfindung erstreckt sich

darüber hinaus a somit nicht nur auf das sphärische Element 12 sondern/einen ode mehrere sphärische Bauteile wie z.B. das Linsenteil 61 oder auc auf ein oder mehrere einstückig am sphärischen Element 12 angeformte oder an diesem befestigte asphärische Bauteile.

Wie der Fachmann aus Fig. 6 entnehmen kann, läßt sich das sphärische Element 12 mit einem oder mehreren sphärischen Bauteilen z.B. einem Paar entgegengesetzter sphärischer Teile 74 und einem oder mehreren nichtsphärischen Teilen, z.B. dem zylindrischen Abschnitt 76 zu einer Optik ausbauen. Diese Ausführung zeigt, wie sich die durch sphärische Umrisse 78 und die sphärischen Außenflächen 23 dargestellten sphärischen Teile so verbinden lassen, daß die außermittige Anordnung der Öffnung 14

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ausgenützt werden kann, um Licht von mehreren sphärischen Teilen 74 aufzufangen. Um die Öffnung 14 herum lassen sich außerdem mehr als nur zwei sphärische Teile 74 anschließen. Weitwinkelbeleuchtung der Öffnung 14 kann z.B. durch eine auf der ersten optischen Achse 40 zentrierte konvergente Strahlung erfolgen, wobei die zweite optische Sammelachse 50 kolinear ist. Längs eineroptischen Achse 80 kann aber auch eine konvergente "spaltförmige" Beleuchtung erzeugt werden, wobei dann der zylindrische Abschnitt 7 6 wie eine konvergierende Linse auf die Breitenabmessungen des Querschnitts des "spaltförmigen"Strahlenbündels wirkt.

Wie aus den Zeichnungen ersichtlich, weisen alle Ausführungsformen der Durchflußvorrichtung 10 ein optisches Element auf mit mindestens einer oder mehreren sphärischen Abschnitten, welche ζ einer bestimmten Stelle auf der zweiten optischen Achse 50 radial symmetrisch sind. Bei der ersten Ausführungsform nach Fig.1 und 2 kann die zweite optische Achse 50 jede beliebige Lage haben, so lange sie durch den Mittelpunkt 15 geht, wobei die gesamte sphärische Außenfläche 23 ein Paar gegenüberliegender sphärischer Abschnitte bildet. Bei der zweiten Ausführungsform nach Fig. 3 muß die zweite optische Achse 50 durch die Öffnung 14 und den im Abstand zu dieser liegenden Mittelpunkt 15 verlaufen, so daß der entfernt liegende Abschnitt 61 einen der zur zwe ten optischen Achse 50 radial symmetrischen, sphärischen Abschni bildet. Bei der abgewandelten Ausführung nach Fig. 4 ist sowohl die sphärische Außenfläche 23 als auch das sphärische Linsenteil 67 radialsymmetrisch zur zweiten optischen Achse 50, auf welcher die Mittelpunkte der beiden Krümmungsmittelpunkte 15 und 72 liegen. Gemäß Fig. 6 liegen sowohl die beiden Mittelpunkte 15 als auch die Öffnung 14 auf der zweiten optischen Achse 50. Bei Verwendung einer quadratischen Öffnung 14 ist zumindest eine ihrer Planflächen 58 senkrecht zur zweiten optischen Achse 50 ausgerichtet.

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Jede der in den Zeichnungen gezeigten sphärischen Abschnitte, z.B. die sphärische Außenfläche 23, das sphärische Linsenteil 67 oder die sphärischen Abschnitte 74 kann asphärisch ausgebildet werden, um z.B. sphärische Aberration zu korrigieren. Diese Flächen werden daher in den Ansprüchen als "im wesentlichen sphärische Abschnitte" oder als "peripher konvexe, eine Rotationsfläche erzeugende Teile" bezeichnet. Die Rotationsfläche weist nämlich eine geeignete Krüinmungslinie auf, welche um eine optische Achse gedreht eine radial symmetrische Fläche ergibt. Der Einfachheit halber werden diese asphärischen Teile mit dem gleichen Krümmungsmittel

punkt wie die den asphärischen Teilen am nächsten kommenden sphärischen Teile angenommen.

Patentanwälte

Dipl.-Ina. E. Eder

Dipl.-Ing. JOSchiescr4a>

8000 Münchej^laJElisabetiiu-. '

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Patentanwälte Dipl.- ing. E. Eder Dipl.-mg. K. Schieschke München 40, Eüsabethstr. 34 COULTER ELECTRONICS, INC, Hialeah/Florida U.S.A. Optische Durchflußvorrichtung zur Untersuchung von in einer Flüssigkeitsströmung suspendierten Teilchen Patentansprüche

1., Durchflußvorrichtung zur Untersuchung einzelner, in einer
Flüssigkeit suspendierter Teilchen, mit einer Teilchenmeßöffnung, durch welche in einer Suspensionsströmung enthaltene Teilchen geschickt werden, wobei die Durchflußvorrichtung zur Aufnahme einer ein in der Teilchenmeßöffnung
befindliches Teilchen beleuchtenden Strahlung und zur Übertragung von bei Durchtritt des ve rhandenen Teilchens durch die Strahlung erzeugten optischen Signalen ausgebildet ist und einen Einströmkanal am einen Ende aufweist, mit welchem die Teilchenmeßöffnung in Flüssigkeitsverbindung steht, gekennzeichnet durch ein im wesentlichen sphärisches Element (12) monolithischer Struktur, durch eine optische Beleuchtungsachse (40), längs welcher die Strahlung auffangbar
ist und durch wenigstens eine optische Lichtauffangachse
(40, 50), längs welcher die optischen Signale auffangbar
sind, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die optischen
Achsen ausgerichtet sind und sich durch die Meßöffnung er-

strecken und daß das sphärische Element zu den optischen Achsen im wesentlichen radial symmetrisch ist.

2. Durchflußvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung (14) mindestens eine Planfläche (58) aufweist, welche senkrecht zur optischen Lichtauffangachse (40, 50) angeordnet ist.

3. Durchflußvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung (14) den Krümmungsmittelpunkt (15) des sphärischen Elements (12¹ umschließt.

4. Durchflußvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Krümmungsmittelpunkt (15) des sphärischen Elementes zwischen der Öffnung (14) und dem sphärischen Element (12) liegt.

5. Durchflußvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Umfangsbezirk des sphärischen Elements (12) mit einem gekrümmten Linsenteil (52, 67) ausgebildet ist, welches sich über den Außenradius des sphärischen Elements hinaus erstreckt und auf der optischen Lichtauffangachse ( 50)liegt.

6. Durchflußvorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das gekrümmte Linsenteil (52, 67) durch einen Innenradius (68) und einen Außenradius (70) begrenzt ist, daß der Innenradius gleich dem Außenradius des sphärischen Elements und der Außenradius des gekrümmten Linsenteils kleiner ist als der Innenradius.

7. Durchflußvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das sphärische Element (12) ein Paar entgegengesetzter Planflächen (41, 42) aufweist, welche auf einer optischen Beleuchtungsachse (40) liegen, welche durch die Öffnung (14) und senkrecht zu den Planflächon verläuft, und daß eine Strahlenquelle (36) vorgesehen

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ist, durch welche parallele auf der optischen Beleuchtungsachse zentrierte Strahlung erzeugbar ist.

8. Durchflußvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch eine Strahlenquelle (36) zum Erzeugen von konvergenter, im wesentlichen auf die Öffnung (14) fokussierter Strahlung.

9. Durchflußvorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 8 mit einem auf der optischen Lichtauffangachse angeordneten Strahlendetektor, welcher von der öffnung ausgehendes Licht auffängt, dadurch gekennzeichnet, daß ein Bereich des sphärischen Elements mit einer reflektierenden Beschichtung (54) versehen ist, welche auf der optischen Lichtauffangachse (50) auf der dem Strahlendetektor abgewandten Seite des sphärischen Elements liegt.

10. Durchflußvorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 6, gekennzeichnet durch eine eine konvergente, im wesentlichen auf die Öffnung (14) fokussierte Strahlung mit spaltförmigen Querschnitt (66) erzeugende Strahlenquelle (36) und durch einen schmalen Streifen einer reflektierenden Beschichtung (65) auf dem sphärischen Element (12),durch welche die konvergente Strahlung nach ihrem Durchtritt durch die Öffnung reflektierbar ist.

11. Durchflußvorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß auf der Lichtauffangachse (50) zum Auffangen des Lichtes und zur Beleuchtung längs der Lichtauffangachse ein dichroitischer Spiegel (63) angeordnet ist.

12. Durchflußvorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußvorrichtung mit einem Paar entgegengesetzter sphärischer Elemente (74, 74) ausgebildet ist, welche zur Lichtauffangachse (40) radial symmetrisch sind deren Krümmungsmitielpunkte (15, 15) im Abstand voneinander angeordnet sind und daß die Öffnung (14) zwischen den Krümmung :;mi Lto!punkten ] i ogt.

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13. Durchflußvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Einrichtungen (30, 32), durch welche elektrischer Strom durch die Öffnung (14) gleichzeitig mit dem Durchtritt eines Teilchens schickbar ist und durch eine auf die elektrischen Impedanzveränderungen bei Durchtritt eines Teilchens durch die Öffnung ansprechende und ein Teilchenimpulssignal erzeugende Erfassungsvorrichtung.

14. Durchflußvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch mehrere optische Lichtauffangachsen (40, 50) zum Auffangen der Strahlung, wobei jede der optischen Lichtauffangachsen durch die Öffnung (14) verläuft, und durch eine die optischen Signale auffangende Strahlenerfassungsvorrichtung (45, 48) auf jeder der optischen Lichtauffangachsen.

Patent

Dlpl.-lng/^.Eder Dipl.-Ing. l<Z4chfeschke

6000 Münchei^Wsabethstr. 34