DE3208919C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzpolarisation von Zellen, welche vereinzelt längs eines Strömungsfadens ausgerichtet sind nach dem Oberbegriff des Pa­ tentanspruchs 1, wie sie aus der DE 29 43 116 A1 bekannt ist.
Bei der Messung des Fluoreszenzpolarisationsgrades wird das Fluoreszenzlicht üblicherweise entweder unter 90° mit einem gewissen Öffnungswinkel oder in Rück­ wärtsrichtung (0°) in einem Winkelbereich erfaßt. Zum Abgleich der beiden Detektionskanäle (Photodetektor, Elektronen-Verstärker) für parallel bzw. senkrecht polarisiertes Fluoreszenzlicht wird bei einer 90°- Anordnung die Polarisationsebene des Anregungslichtes so gedreht, daß sie in der durch die beiden optischen Achsen (Anregung, Detektion) aufgespannten Ebene liegt. Die beiden Detektionskanäle empfangen dann unpolari­ siertes Licht und können so auf gleiche Empfindlich­ keit eingestellt werden. Bei der eigentlichen Messung steht der Polarisationsvektor senkrecht auf dieser Ebene. Da die Fluoreszenz mit einem gewissen Öffnungs­ winkel aufgenommen wird, spielen Brechungsindex­ unterschiede in jeder Zelle, aber auch in den umgeben­ den Medien eine wesentliche Rolle bei der Abschwächung einer einzelnen Polarisationskomponente bei der Mes­ sung. Ein solcher Abgleich müßte daher in der 90°-An­ ordnung bei jeder zu messenden Zelle erfolgen. Dieses ist jedoch besonders dann unpraktikabel, wenn für die Registrierung einer Verteilungsfunktion große Mengen von Zellen in kurzer Zeit nacheinander vermessen werden müssen, wie dies zum Beispiel bei der Durch­ flußzytometrie der Fall ist.
Bei der Auflichtfluoreszenzpolarisationsmessung be­ steht ein gewisser Vorteil darin, daß die Einflüsse der Streuung des Fluoreszenzlichtes an internen Strukturen auf die Messung des realen Fluoreszenz­ polarisationsgrades von wesentlich geringerer Be­ deutung als bei der 90°-Messung sind. Zum Abgleich der beiden Photodetektoren, wird auch hier bei einer Einzelmessung die Polarisationsrichtung des Anregungs­ lichtes um 90° gedreht, so daß der Detektor für parallel polarisiertes Fluoreszenzlicht dann das senkrecht polari­ sierte Fluoreszenzlicht empfängt und umgekehrt. Dieses Verfahren hat darüber hinaus noch den Vorteil, daß beide Einzelmessungen zur Verbesserung der Genauigkeit der Messung des Fluoreszenzpolarisationsgrades beitragen.
Bei der schnellen Einzelmessung an einem großen Zell­ kollektiv wird das Kollektiv willkürlich in ein oder mehrere jeweils gleich große Zellpopulationspaare zerlegt. Bei jedem Paar wird dann zunächst der Fluo­ reszenzpolarisationsgrad der einen Hälfte der Popula­ tion mit einer Anregungspopulation in einem Histo­ gramm aufgezeichnet, dann die Anregungspolarisation um 90° gedreht und der Fluoreszenzpolarisationsgrad der zweiten Hälfte in einem zweiten Histogramm aufge­ zeichnet. Bei perfektem Abgleich der Detektorkanäle müssen unter der Voraussetzung, daß beide Hälften der Zellpopulation ein gleiches Verhalten bezüglich ihres Fluoreszenzpolarisationsgrades haben, die beiden Polarisationsgradhistogramme gleich sind. Sind diese nicht gleich, was bei der Mehrzahl der Messungen beobachtet werden kann, so müssen im Gegensatz zu der Messung in einer 90°-Anordnung die gewonnenen Werte nicht verworfen werden, sondern können mit der Hilfe eines Tischrechners miteinander verrechnet werden, daß sich ein korrigiertes Histogramm des Fluoreszenzpolarisationsgrades ergibt (siehe: W. G. Eisert und W. Beisker; Biophys. J. 31, 97 (1980)).
Aus der DE 29 43 116 A1 ist, wie eingangs angegeben, eine Vorrichtung der gat­ tungsgemäßen Art bekannt.
Aus Rev. Sci. Instrum., Jg. 49(7), 1978, Seiten 905-912 ist ein Verfahren bekannt, bei welchem mit einem linear- polarisierten Laserstrahl Fluoreszenz angeregt wird. Die Fluoreszenz wird mit Hilfe eines Prismas in zwei polari­ sierte Komponenten aufgespalten, die getrennt nachgewie­ sen werden.
In Clinical Chemistry, Vol. 19, No. 8, 1973, Seiten 838-844 wird zeitlich abwechselnd mit Licht orthogonaler Polari­ sation Fluoreszenz an einem Ort erzeugt. Es wird immer nur eine Polarisationsrichtung des Fluoreszenzlichts nachgewie­ sen.
Aus der DE 27 32 272 B1 ist ein Verfahren und eine Vorrich­ tung bekannt, bei der eine Probe mit zwei Laserstrahlen mit unterschiedlicher Frequenz bestrahlt wird.
Des weiteren ist aus der DE 28 17 334 A1 ein Fluoreszenz­ polarimeter bekannt, bei dem die Probe mit einem polarisier­ ten Lichtstrahl angeregt und nur eine polarisierte Fluores­ zenzkomponente erfaßt wird.
Alle diese Maßverfahren benötigen zum Abgleich des Meßsystems sowie zur Korrektur am Einzelobjekt zwei Einzelmessungen. Diese Korrektur kann wie im Fall der 90°-Anordnung gar nicht, bzw. nur durch Abgleich vor und Kontrolle des Abgleichs nach der Messung oder wie im Fall der Auflichtfluoreszenzpolarisation über eine statistische Analyse von Subpopulationen durch­ geführt werden.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, eine Vorrichtung zu bieten, mit der eine Messung der Polarisation des Fluoreszenzlichtes von Einzelpartikeln mit einer Korrektur des Fluoreszenzpolarisationsgrades möglich wird, wobei die Zellen oder Partikel einzeln und nacheinander durch ein Meßfeld geführt werden und der Polarisations­ grad der Fluoreszenzemission immer gleichzeitig an zwei verschiedenen Stellen so gemessen wird, daß unvermeidbare Schwankungen im optischen und elektronischen Meßsystem den Meßwert nicht beeinflus­ sen.
Die Lösung dieser Aufgabe ist in den kennzeichnenden Merkmalen des Patentanspruches 1 beschrieben.
Die weiteren Ansprüche geben vorteilhafte Ausführungs­ beispiele und Weiterbildungen der Erfindung wieder.
Bei der erfindungsgemäß durchgeführten Korrektur der Fluoreszenzpolarisationsmessung an einem Einzelobjekt in Auflichtanordnung durch eine weitere Messung mit um 90° gedrehter Anregungspolarisation bestehen somit prinzipiell zwei Möglichkeiten:
  • 1. Einstrahlsystem: Während die Zelle im Meßfeld ist, bzw. sich durch dieses bewegt, wird die Polarisa­ tionsrichtung um 90° gedreht und durch eine ge­ eignete elektronische Schaltung werden vier Meß­ werte für dieses Objekt registriert (2 parallele, 2 senkrechte Intensitätsmessungen). Diese Möglich­ keit ist bei langsamem Wechsel der Objekte reali­ sierbar.
  • 2. Doppelstrahlsystem: Ein Objekt passiert in einem Meßfeld zwei Lichtstrahlen zur Anregung der Fluo­ reszenz nacheinander. Die Polarisationsrichtungen der Anregungsstrahlen stehen dabei senkrecht auf­ einander. Die beiden Polarisationskomponenten der Fluoreszenz an beiden Anregungsstellen werden nach­ einander mit Hilfe eines Paares von Detektions­ kanälen registriert. Ein spezielles elektronisches Analysesystem berechnet aus den vier vorliegenden Meßwerten den korrigierten Fluoreszenzpolarisations­ grad, bevor das nächste Objekt in das Meßfeld ein­ tritt. Bei der Aufspaltung eines unpolarisierten Anregungsstrahls in seine beiden Polarisations­ richtungen können diese bei der Verwendung eines entsprechend geschnittenen Calzit-Kristalls auch in zwei parallele Strahlen räumlich getrennt werden.
Diese erfindungsgemäße Anordnung gestattet mehrmals unter Beibehaltung einer internen Korrektur Verände­ rungen im Polarisationsgrad der Einzelzellen eines Kollektivs in schneller Abfolge zu messen. Die der­ zeit erzielte Geschwindigkeit der elektronischen Meß­ wertverarbeitung und -speicherung läßt eine Messung alle ca. 100 µsec zu. Damit werden bei einer Ab­ speicherung der Meßdaten in einer Liste auch schnelle Änderungen des Fluoreszenzpolarisationsgrades in einer sich verändernden Population meßbar. Die Berechnung des Polarisationsgrades aus vier Einzelmessungen ermöglicht weiterhin für jede Zelle die numerische Korrektur der sogenannten Apertur und Beugungsfehler.
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Aus­ führungsbeispiels mittels der Fig. 1-4 näher er­ läutert.
Die Fig. 1 zeigt schematisch die Bestrahlungsanlage der auf einem Strömungsfaden 1 vereinzelt ausgerichteten Zellen 2, 2′, . . . Ein Anregungsstrahl 3, z. B. ein Laserstrahl wird hierzu in einem Polarisationsteiler 4 in zwei Lichtstrahlen 5, 6 zerlegt, deren Polarisationsrichtungen E senkrecht zueinander stehen (Doppelpfeile). Ein im Winkel zu bei­ den Lichtstrahlen 5, 6 stehender Umlenkspiegel 7 richtet die beiden parallel zueinander verlaufenden Lichtstrahlen 5, 6 auf die Optik 8 mit u. a. den beiden Linsen 9 und 10. Die Linse 9 fokussiert die beiden Lichtstrahlen 5, 6 mit zueinander senkrechter Polarisationsrichtung auf zwei Anregungsstellen 11, 12 innerhalb des Strömungsfadens 1, durch die die einzelnen Zellen 2, 2′ hindurch­ treten und die einen konstanten Abstand voneinander aufweisen. Die Extinktion wird mittels der beiden Detektoren 13, 14 gemessen, auf die die Strahlung mittels der Linse 10 gerichtet ist.
Die Fig. 2 gibt die Detektoranordnung der von den Zellen 2 (hier wird nur der Durchgang einer Zelle 2 durch beide Anregungsstellen 11, 12 betrachtet) abgegebene Fluoreszenzstrahlung wieder. (Die Beleuchtungsein­ richtung halber weggelassen; die Strahlengänge lägen je­ doch auf der gleichen optischen Achse). Die in den Anregungsstellen 11, 12 in der Zelle 2, 2′ von der Strahlung durch das plane Fenster 18 hindurch angeregte Fluoreszenzstrahlung mit senkrecht zueinander stehender Polarisationsrichtung und unterschiedlicher Intensität bezüglich der Anregungsstellen 11, 12 bzw. des Aufenthaltortes der Zelle 2 (einmal im Bereich der Anregungsstelle 11 und nach der Zeit Δt im Bereich der Anregungsstelle 12) wird gleich­ zeitig mit dem Detektorkanal 15 (PMx) und gleichzeitig mit dem Detektorkanal 16 (PMy) gemessen. Die Fluoreszenz­ strahlungen werden hierzu mit einem weiten Polari­ sationsstrahlteiler 17 je nach Polarisations­ richtung und entsprechend des Polarisationsgrades der angeregten Zelle 2 wiederum aufgeteilt, so daß jeweils zwei Meßwertpaare der Detektorkanäle 15 bzw. 16 im Zeitabstand Δt, d. h. jeweils beim Durchlaufen der Anregungs­ stellen 11 und 12, voneinander aufgenommen werden. Diese vier Meßwerte dienen dann der Korrektur des Fluoreszenzpolarisationsgrades. Die Extinktion wird, wie bereits in Fig. 1 dargestellt, mit den beiden Detektoren 13 und 14 gemessen, wobei die Anregungs- bzw. Fluoreszenzstrahlung das Strömungssystem durch das ebenfalls plane Fenster 19 verläßt.
Die Rechner- und Kontrollschaltung für diese Selbst­ korrektur ist in Fig. 3 schematisch wiedergegeben. Die vier Meßwerte 2×PMx, 2×PMy der Detektorkanäle 15, 16, deren Intensität und Form im Zeitabstand Δt dargestellt ist, werden über eine Maximum- Dekodierschaltung mit TTL-Control-Logic 20, die die Amplituden X₁, X₂, Y₁, Y₂ abgibt, dem Analog-Digital- Umwandler 21 und dann über den Data-Address-and- Control-Bus 22 dem Z-80-Mikrocomputer 23 zugeführt. Dieser Mikrocomputer 23 mit entsprechenden Peri­ pheriegeräten 24, 25 berechnet jeweils die Korrektur pro Zelle 2 und dient zur Datenabspeicherung, sofern keine sofortige Übertragung über 25 auf einen Minicomputer stattfindet. Die Extinktionswerte EX₁, EX₂, deren zeitliche Lage entsprechend der Meß­ werte PMx ebenfalls dargestellt ist, werden einem Decoder 26 zugeführt, der mit dem Mikrocomputer 23 über den Δt-Computer 27 (Start-Stop) in Verbindung steht.
Die jeweiligen Signale an den Schranken S₁, S₂ (siehe Fig. 3 und 4) sowie die Signale TLL und TUL, die durch Vergleich des aktuellen Zählerstandes Δt mit den von 23 und 27 übermittelten Werten (1-α) Δt und (1+α) Δt in 27 entstehen, werden der Impuls­ analyseeinheit nach Fig. 4 zugeführt.
Für TLL und TUL gilt:
Die weitere logische Verrechnung von S₁, S₂, TUL, TLL zur Bildung der Steuersignale für die Maximumdekoder in 20 ist in Fig. 4 gezeigt. 28 sperrt die Einheit für jeweils ein einstellbares Zeitintervall (z. B. 40 µsec) nach jedem Teilchen durch S₁. 29 kombiniert die möglichen Fehlerbedingungen und setzt gegebenen­ falls das Error-Flipflop 30, das von 23 über ERRORFLAG abgefragt werden kann. Flipflop 31 und 32 dienen zur Speicherung des Impulsmaximums im Maximumdekoder und können VIA (RST1) durch 23 zurück­ gesetzt werden. Für jedes Teilchen wird die Ver­ rechnung in 23 über (INTERRUPT) gestartet. Über Monoflop 33 wird Flipflop 34 gesetzt, um die Aus­ steuerung der Maximumdekoder durch ein weiteres Teilchen, das innerhalb der Verrechnungszeit in 23 die erste Anregungsstelle 11 passiert, zu verhindern. Gleich­ zeitig bestimmt 33 die Länge des INTERRUPT-Signales.
Hierbei ist α eine frei wählbare Größe für die Breite des Zeitfensters (z. B.=0.1)
Δt: Flugzeit
: mittlere Flugzeit (nach Verrechnung)
Erläuterungen
Spalte (1): Flugzeit Δt zwischen den Schranken S1 und S2
Spalte (2): Gleichzeitige Unterbrechung der Schranken S1 und S2 (Anregungsstellen 11, 12) entweder durch zu lange Teilchen oder durch ein zweites Teilchen
Spalte (3): Teilchen in S1 (erste Anregungsstelle 11) innerhalb eines Zeitintervalls (beliebig wählbar) nach einer Unterbrechung der Schranke S1)
Spalte (4): Für die Zeitmittelung zur Verrechnung kommende Flugzeit
Spalte (5): Messung der Fluoreszenzpolarisation. Zusätzliche Bedingung hierfür ist, daß die Fluoreszenzintensität aller vier Meßkanäle oberhalb eines wählbaren Levels ist.

Claims (4)

1. Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenzpolarisation von Zellen, welche vereinzelt längs eines Strömungsfadens aus­ gerichtet sind, wobei jeweils dieselbe Zelle mittels zweier Lichtstrahlen an einer ersten und an einer zweiten Anregungsstelle be­ strahlt wird, wobei die Zelle die zwei Lichtstrahlen zur Anregung der Fluoreszenz nacheinander passiert und die Po­ larisationsrichtungen der beiden Lichtstrahlen senkrecht zueinander stehen, sowie mit einer Detektoreinrichtung zur Erfassung der von der Zelle abgegebenen Fluoreszenzstrah­ lung in zwei aufeinander senkrecht stehenden Polarisations­ richtungen und einer Auswerteeinrichtung, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Detektoreinrichtung ein Paar von Detek­ torkanälen (15, 16) aufweist, die mit Hilfe eines Polarisa­ tionsstrahlteilers (17) der gleichzeitigen Erfassung der an der ersten und an der zweiten Anregungsstelle (11, 12) auf­ tretenden Fluoreszenzintensitäten dienen, und daß die Aus­ werteeinrichtung (20 bis 26) zur Korrektur des Fluores­ zenzpolarisationsgrades auf Grund der erfaßten Fluoreszenz­ intensitäten an der ersten und der zweiten Anregungsstelle (11, 12) jeweils mit und ohne Zelle ausgebildet ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Lichtstrahlen (5, 6) durch Aufspaltung eines unpolarisierten Anregungsstrahles (3) oder eines polarisierten Anregungsstrahles (3) bei Einstellung der Polarisationsrichtung im Winkel von 45° zu den Polarisationsrichtungen nach Aufspaltung erzeugbar sind.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anregung mittels eines Lichtstrahls erfolgt, dessen Polarisationsrichtung um 90° während der Anregung der Fluoreszenz gedreht wird.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß in beiden Anregungsstellen (11, 12) die Extinktion meßbar ist.
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DE19612569C1 (de) * 1996-03-29 1997-10-23 Palas Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Prüfen der Größenverteilung von Partikeln in Aerosolen

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