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Verfahren zur Herstellung einer 1 t-hydroxylierten
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Vitamin-D-Verbindung, ausgehend von einer 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindung
Die Erfindung betrifft die Herstellung von 1-hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen.
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Die D-Vitamine (d. h. Vitamin D3 oder Vitamin D2) sind bekannte Mittel
zur Steuerung der Calcium- und Phosphorhomöostase. Es ist bekannt, daß beim normalen
Tier diese Verbindungen die intestinale Calciumabsorbtion und die Knochen-Calcium-Mobilisierung
stimulieren und wirksam bei der Verhinderung von Rachitis sind. Es ist auch bekannt,
daß Vitamin D3 (oder Vitamin D2), um wirksam zu sein, in vivo in seine Hydroxyformen
umgewandelt werden muß. Beispielsweise wird Vitamin D3 zuerst zum 25-Hydroxy-Vitamin
D3 in der Leber hydroxyliert, und dieses Zwischenprodukt wird anschließend weiter
in der Niere zu 1 ,25-Dihydroxy-Vitamin D3 hydroxyliert. Vitamin D2 geht die gleichen
metabolischen Umwandlungen ein. Die loL -hydroxylierte Form des Vitamins wird
im
allgemeinen als die physiologisch aktive oder hormonelle Form r s Vitamins und als
verantwortlich für die verschiedenen vorsteh nd erwähnten physiologischen Reaktionen
angesehen. Es wurde auch gezeigt, daß bestimmte unnatürliche synthetische loc -Hydroxy-Vitamin-D-Analoge
eine hohe biologische Wirksamkeit aufweisen, die sich in einigen Fällen der der
in vivo erze-ten natürlichen Formen nähert. Bekannte Beispiele sind loL -Hydroxy-vitamin
D3, 1i -Hydroxy-vitamin D2 und 3-Desoxy-1& -hydroxy-vitamin D3.
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Wegen der hohen biologischen Wirksamkeit derartiger 1-hydroxylierter
Vitamin-D-Verbindungen und ihrer potentiellen Brauchbarkeit zur Behandlung zahlreicher
Erkrankungen, die mit der Störung des Calciummetabolismus einhergehen, wurde chemischen
Verfahren zu deren Herstellung ein großes Interesse entegengebracht. Fast alle beschriebenen
Synthesen beziehen die 1£ -Hydroxylierung geeigneter Steroide (wie Cholesterin)
ein, die anschließend in die gewünschten 1 bt -Hydroxy-Vitamin-D-Verbindungen umgewandelt
werden (vgl. Schnoes und DeLuca, in Bioorganic Chemistry, Band 2, Kapitel 12, Seiten
299-335, herausgegeben von E. E. van Tamalen, Academic Press, Inc., New York, 1978).
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Ein interessantes alternatives Verfahren wurde kürzlich beschrieben,
das die direkte C1-Hydroxylierung von vorgebildeten Vitamin-D-Verbindungen betrifft
(vgl. Pelc, Steroids 30, 193 (1977) und Paaren et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA
75, 2080 (1978). Jedoch sind bei diesem direkten Oxidationsverfahren die Ausbeuten
an den gewünschten 1 o -Hydroxy-Vitamin-D-Verbindungen gering, und der Hauptanteil
der erhaltenen Materialien besteht aus unerwünschten Produkten, die sorgfältig entfernt
Wnd gründlich chromatographiert werden müssen.
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Es wurde nunmehr ein Verfahren gemäß der Erfindung bereitgestellt,
das die wirksame Herstellung von 12 -Hydroxy-Vitamin-D-Verbindungen (d.h. mit der
5,6-cis-Doppelbindung-Geometrie)
aus 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen
ermöglicht. Dieses Verfahren umfaßt zwei Stufen, nämlich die allylische Oxidation
eines 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterials, wobei Se02 das bevorzugte Oxidationsmittel
ist, gefolgt von der Bestrahlung des resultierenen 1-hydroxylierten Produkts in
Anwesenheit eines Photosensibilisators. Die Umwandlung der gewünschten 1& -Hydroxy-vitamin-D-Verbindungen
kann in etwa 20 - 30 % Ausbeute nach diesem Verfahren aus den 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterialien
erzielt werden.
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Geeignete Ausgangsmaterialien für dieses Verfahren sind 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen
mit der nachstehenden allgemeinen Struktur
worin X Wasserstoff, Hydroxy oder geschütztes Hydroxy (beispielsweise die O-Acylgruppe)
ist. R in der obigen Struktur kann Wasserstoff oder~niedrig-Alkyl sein, und es kann
jegliche der üblichen gesättigten oder ungesättigten Steroidseitenketten sein. Diese
Seitenketten können auch funktionelle Gruppen tragen, wie Hydroxy-, Ketcn- Säure-
oder Estergruppen, wie beispielsweise in der Seitenkette von Cholensäure oder ihren
Estern, Homocholensäure oder ihren Estern oder 25-Keto-oder 24-etocholesterin. In
der bevorzugten Ausführungsform
stellt R in der vorstehenden Struktur
eine Steroidseitenkette mit d Struktur
dar, worin jeder der Reste R1 und R2 unabhängig Wasserstoff, Hydroxy, geschütztes
Hydroxy oder Fluor ist, oder R1 und R 2 zusammen eine Doppelbindung oder eine Epoxidgruppe
bilden, jeder der Reste R3, R4 und R5 unabhängig Wasserstoff, Hydroxygeschütztes
Hydroxy, niedrig-Alkyl oder Fluor darstellt, und R6 Wasserstoff oder niedrig-Alkyl
ist. Hydroxyfunktionen, die gegebenenfalls in dem Ausgangsmaterial vorhanden sind
(z.B. an C-3 und/oder in der Seitenkette), können ebenfalls acyliert sein (z.B.
vorhanden als Acetate, Propionate, Butyrate, Benzoate, Nitro- oder Halogenbenzoate),
alkyliert (z.B.
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O-Methyl, O-Äthyl oder O-Isopropyl), oder können auf andere Weise
daran gehindert werden, mit den Reagentien im Verlaufe des Verfahrens zu reagieren
d.h. geschützt, wie dem Fachmann bekannt, durch übliche Hydroxy-Schutzgruppen. Jedoch
ist ein derartiger Schutz für das erfindungsgemäße Verfahren nicht wesentlich.
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Der hier verwendete Ausdruck "niedrig-Alkyl" bezeichnet einen Kohlenwasserstoffrest
mit 1 bis etwa 5 Kohlenstoffatomen, mit geradkettiger oder verzweigtkettiger Konfiguration,
z.B. Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl oder Butyl, und das Wort "Acyl" bezeichnet
eine aliphatische Acylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffen, z. B. Acetyl;Propionyl oder
Butyryl , oder eine aromatische Acylgruppe, wie Benzoyl, Nitrobenzoyl oder Chlorbenzoyl
Ein
bevorzugtes Reagens zur allylischen Oxidation dieser 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterialien
ist eine Selenverbindung, insgesondere Selendioxid. Die Anwesenheit eines Hydroperoxids
(z.B. Wasserstoffperoxid, oder eines Alkylhydroperoxids, wie t-Butylhydroperoxid)
und einer organischen stickstoffhaltigen Base während der Oxidation ist günstig.
Geeignete Basen umfassen Pyridin oder substituierte Pyridine (z.B. die isomeren
Picoline, Collidin, Octahydroacridin oder Chinolin) oder Imidazol oder ein substituiertes
Pyrazol (z.B. 3,5-Dimethyl-pyrazol). Eine vorteilhafte Kombination von Reagentien
sind insbesondere Selendioxid, t-Butylhydroperoxid und Octahydroacridin. Die Reaktion
wird vorzugsweise in einem Lösungsmittel, z. B. einem Halogen-kohlenwasserstoff-Lösungsmittel,
wie Methylenchlorid, Chloroform Tetrachlorkohlenstoff, 1,2-Dichloräthan oder 1,3-Dichlorpropan,
bei Raumtemperatur durchgeführt.
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Bei Raumtemperatur erfolgt die Reaktion rasch und ist normalerweise
innerhalb von 10 bis 20 Minuten beendet, obwohl im allgemeinen ein Temperaturbereich
von etwa -15 bis 300C verwendet werden kann.
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Das resultierende Produkt, das gegebenenfalls durch Chromatographie
gereinigt werden kann, wird anschließend einer photochemischen Umwandlung unterzogen.
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Die photochemische Umwandlungsstufe kann wirksam durchgeführt werden,
wenn man eine Lösung des Oxidationsprodukts aktinischer Strahlung in Anwesenheit
eines Photosensibilisators aussetzt.
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Eine Lichtquelle, die eine für die Anregung des Photosensibilisators
geeignete Strahlung emittiert, ist wirksam, vorausgesetzt, daß Licht mit einer Wellenlänge
von weniger als etwa 310 nm ausgeschlossen wird, entweder durch geeignete Filter
oder durch Wahl einer Lichtquelle, die keine Strahlung unter dieser Wellenlänge
aussendet. In der Praxis ist es zweckmäßig, handelsübliche Standard-Fluoreszenzlampen
zur Bestrahlung zu verwenden, wie die handelsüblichen Kalt-Weiß-Modelle FC12T10/CW,
FC8T9/CW, F6T5/CW oder F15T8D (jeweils Handelsprodukte
der Westinghouse
Electric Corporation), mit geeigneten Filter zur wirksamen Eliminierung der niedrigen
Ultraviolettstrahluriskomponente. Ein geeignetes Filter ist Pyrexglas, und die Bestrahlung
der Lösung, die in einem Reaktionsgefäß enthalten ist, das aus Standard-Pyrexglas
hergestellt wurde, ist daher praktizierbar, und eine vorteilhafte Verfahrensweis
zur Durchführung dieser Reaktion. Geeignete Lösungsmittel für das Oxidationsprodukt
sind beispielsbeise Benzol und Toluol, und wirksame photochemische Sensibilisatoren
sind beispielse Anthrazen, Acridin und Phenazin.
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Es ist günstig, die Lösung unter einer inerten Atmosphäre zu halten
(z. B. Stickstoff oder Argon). Die Bestrahlung führt man vorzugsweise bei einer
Temperatur unter 10°C durch, wobei der Reaktionsprozeß (d.h. die Bildung der l-Hydroxy-Vitamin-D-Verbindungen)
periodisch durch geeignete chromatographische Methoden, z.B. durch Dünnschichtchromatorgraphie,
überwacht wird. Normalerweise benötigt man etwa 5 bis 10 h zur Beendigung der Reaktion.
Beispielsweise kann die photochemische Umwandlung wirksam erzielt werden durch Bestrahlen
einer Toluollösung des Oxidationsprodukt-Reaktionsgemischs,die Anthrazen als einen
Photosensibilisator aufweist (in etwa 40fach molarem Überschuß über die VitAminverbindung)
unter einer Stickstoffatmosphäre in einem kalten Raum bei 4 0C mit zwei handelsüblichen
zirkularen, fluoreszierenden Lampen (etwa insgesamt 50 Watt), die in geeigneter
Weise um ein Standard-Rundkolben-Reaktionsgefäß angeordnet sind, während 8 bis 10
h. Ein hohes Verhältnis von Sensibilisator zur Vitaminverbindung (z.B. 30-bis 50fach
molarer ueberschuß) und niedrige Temperaturen erleichtern die Reaktion. Verwendet
man Benzol als ein Lösungsmittel, so wird eine Temperatur von über 50C empfohlen,
um ein Frieren avs Lösungsmittels zu vermeiden. Toluol, das unter 50C verwendet
werden kann, ist als Lösungsmittel bevorzugt.
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Das durch die Bestrahlung gewünschte Produkt kann leicht durch Verdampfen
des Lösungsmittels und Durchführung einer Chromatographie isoliert werden. Es ist
häufig vorteilhaft die Masse
des Photosensibilisators vor der Chromatographie
zu entfernen, z.B. durch erneutes Auflösen des Produkts in einem Lösungsmittel,
in dem der Photosensibilisator schlecht löslich ist (z.B. ein Alkohol, wie Äthanol
oder Methanol, im Falle von Anthrazen) und Entfernen des Photosensibilisators durch
Filtrieren. Das resultierende Filtrat enthält ein Gemisch von 1 « -Hydroxy-Vitamin-D-Verbindungen
und einigem 1ß-Hydroxyvitamin-D-Epimer. Diese Verbindung können zweckmäßig durch
Chromatographie getrennt werden (z. B. Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie
oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie), die auch jeglichen verbleibenden Sensibilisator
entfernt, unter Erzielung der 161-Hydroxyvitamin D-Verbindung der nachstehenden
allgemeinen Formel, worin R und X Substituenten, wie vorstehend definiert, darstellen,
in reiner Form:
Jegliche Hydroxy-Schutzgruppen (z.B. Acylgruppen), die vorhanden
s*n können, können gegebenenfalls in einer abschließenden Hydroly e-oder Reduktionsstufe
entfernt werden, unter Anwendung von Standard-Bedingungen und üblichen Bedingungen,
z.B.
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Hydrolyse mit 0,1m KOH/MeOH bei 25 bis 600 während 1 bis 4 h, oder
Reduktion mit Lithium-aluminium-hydrid bei Raumtemperatur während 0,5 bis 1 h. Alternativ
kann die Entfernung derartiger Hydroxyschutzgruppen auch erzielt werden in einer
Zwischenstufe, z. B. vor der photochemischen Reaktionsstufe.
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Das Produktgemisch, das durch die von Pelc und Paaren et al.
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loc. cit. beschriebenen Methoden erhalten wird, umfaß beispielsweise
1e - und 1ß-Hydroxy-5,6-cis- und 5,6-trans-Vitamin-D, sowie eine Anzahl anderer
Oxidationsprodukte, die fast die Gesamtmenge des gebildeten Produkts einnehmen.
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Ein besonders vorteilhaftes Merkmal des erfindungsgemäßen Zweistufenverfahrens,
d.h. Oxidation gefolgt von photochemischer Umwandlung, liegt darin, daß im wesentlichen
nur 1-hydroxylierte Vitamin-D-Verbindungen erhalten werden und daß die gewünschte
1 cm -Hydroxy-Vitamin-D-Verbindung das Hauptprodukt darstellt. Das erfindungsgemäße
Verfahren ermöglicht somit eine wirksame und einfache Umwandlung von 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen
in 19 ol -Hydroxy-Vitamin-D-Verbindungen (5,6-cis-Doppelbindungs-Konfiguration).
Ein weiterer vorteilhafter Aspekt des Verfahrens liegt in seiner allgemeinen Durchführbarkeit;
es ist anwendbar auf 5,6-trans-Vitamin-D-Ausgangsmaterialien, die jegliche der üblichen
Steroidseitenketten enthalten. Beispielsweise führt die allylische Oxidation und
anschließende Bestrahlung von 5,6-trans-Vitamin-D3 und 5,6-trans-Vitamin-D2 zu den
entsprechenden 1o£-Hydroxy-Vitamin-D3 bzw. 1g -Hydroxy-Vitamin-D2-Produkten. Das
gleiche Verfahren, angewendet auf 5, 6-trans-25-Hydroxyvitamin -D3 oder 5,6-trans-25-Hydroxyvitamin-D2
ergibt 1al 25-Dihydroxyvitamin D3 bzw. 1o; 25-Dihydroxyvitamin-D2, und die Oxidation
und anschließende Bestrahlung von 5,6-trans-24,25-Dihydroxyvitamin D3 oder 5,6-trans-25,26-
Dihydroxyvitamin
D3 ergibt laLI 24,25-Trihydroxyvitamin D3 bzw. 1Mt 25,26-Trihydroxyvitamin D3 in
guter Ausbeute.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
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Beispiel 1 Synthese von 1& -Hydroxyvitamin D3 aus 5,6-trans-Vitamin
D3 In einen 10 ml-Rundkolben werden 152 mg (1,37 mMol) Selendioxid gefolgt von 5
ml Methylenchlorid gefügt. Eine Beschickung von 750 mg (4,01 mMol) Octahydroacridin
wird zu der vorstehenden Suspension, gefolgt von 300 pl trockenem t-Butylhydroperoxid,
gefügt. Die resulstierende Lösung wird bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt,
und anschließend werden 100mg (0,26 mMol) festes 5,6-trans-Vitamin-D3 zugesetzt.
Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur unter einer Stickstoffatmosphäre während
16 Minuten gerührt und anschließend aufgearbeitet durch Gießen in ein Gemisch von
70 ml Äther und 15 ml 10% wässrigem Natriumhydroxid. Nach der Phasentrennung wird
die ätherische Schicht mit 10 % Natriumhydroxid (5 ml, lx), Wasser (5 ml, 2x), 1
% wässriger Essigsäure (5 ml, 2x), Wasser (5 ml, 3x), 10 % wässrigem Natriumhydroxid
(5 ml, ix) und Wasser (5ml, 3x) gewaschen. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels
gewinnt man 108,1 mg Rohprodukt. Das Rohprodukt wird an einer 1 x 50 cm Siliciumdioxidgel(Silicar
CC-7)säule mit Äther als Eluierlösungsmittel chromatographiert. Die Säulenfraktionen
werden durch Dünnschichtchromatographie bewertet, und solche Fraktionen, die ein
Material gleicher Polaritär mit 1-hydroxylierten Vitamin-D3-Verbindungen aufweisen,
werden gepoolt, unter Bildung einer Rohfraktion, die 54,5 mg wiegt nach Verdampfen
des Lösungsmittels. Ein Hauptanteil (47,0 mg, 86 %) dieser Rohfraktion wird in ein
doppelwandiges wassergekühltes Quarzemissionsgefäß überführt. Der Quarzbestrahlungsvorrichtung
werden 610 mg (3,42 mMol) Anthrazen und 150 ml
Benzol zugesetzt.
Nach dem Entgasen beginnt man mit dem Bestrah1rn (unter Stickstoffatmosphäre bei
5 0C) unter Verwendung ei er15 Watt, kaltweißen, rohrförmigen, fluoreszierenden
Lichtbire, Nach 13 h bei 6 bis 70C wird das Licht abgeschaltet und das Lösungsmittel
verdampft. Der Rückstand wird in Äthanol suspendiert und filtriert. Das Filtrat
wird verdamp'-, und der rohe Rückstand des Filtrats wird auf eine 1 x 50 cm Siliciumdioxidgelsäule
(Silicar CC-7) aufgebracht.
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Eluieren der Säule mit 1 % Methanol in Chloroform, gefolgt vom Poolen
und Verdampfen solcher Fraktionen, die Material enthalten,das chromatographisch
gleich mit einer bekannten Probe von lol-Hydroxyvitamin D3 ist, führt zu 24,0 mg
(27 % Ausbeute) eines farblosen öls, von dem es sich durch Vergleich der NMR-, UV-
und Massenspektren der Probe mit denen einer authentischen Probe zeigt, daß es identisch
mit 1L -Hydroxyvitamin D3 ist. Die Probe ist cochromatographisch mit einer bekannten
Probe von loL-Hydroxyvitamin D3 (hergestellt aus ld -Hydroxycholesterin) bei Siliciumdioxidgel-Dünnschichtchromatographie
(2,5 % Methanol in Chloroform oder alternativ Äther als Eluierlösungsmitte8.
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B e i s p i e 1 2 Synthese von 1 α-Hydroxyvitamin D2 aus 5,6-trans-Vitamin
D2 Eine Lösung von 100 mg 5,6-trans-Vitamin D3 in Methylen-chlorid wird allylisch
oxidiert, genau wie im Beispiel 1 beschrieben.
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Das resultierende 1-hydroxylierte Produktgemisch wird wie im vorstehenden
Beispiel beschrieben, gewonnen und direkt unter folgenden Bedingungen bestrahlt.
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Zu einer Toluollösung (150 ml) des Produkts, die in einem 250 ml-Standard-Rundkolben
enthalten ist, wird ein 20facher Überschuß von Anthrazen als Photosensibilisator
gefügt. Die Lösung wird entgast und unter einer Stickstoffatmosphäre
gehalten.
Sie wird anschließend mit zwei üblichen zirkularen, fluoreszierenden Lampen (Westinghouse-Modelle
FC1 2T10/CW (32 Watt) und FC8T9/CW(22 Watt) die um den Kolben plaziert sind, während
9 h bestrahlt; die Lösung wird während der Bestrahlung bei 4°C gehalten. Das Produkt
wird isoliert durch Zusatz von Isopropanol und azeotrope Verdampfung des Lösungsmittels,
Zusatz von Äthanol zu dem Rückstand und Filtrieren des Anthrazens. Durch Chromatographie
des nach dem Verdampfen des Äthanollösungsmittels verbleibenden Rückstands an einer
Siliciumdioxidgelsäule (1 x 50 cm),eluiert mit 1 % Methanol in CHCl3, erhält man
das gewünschte 1d -Hydroxyvitamin D2 in 25 % Gesamtausbeute. Das Produkt ist identisch
mit dem einer authentischen Probe in seinen chromatographischen und =spektroskopischen
Eigenschaften.
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Insbesondere betrifft die Erfindung somit ein Verfahren zur Herstellung
von 1s -hydroxylierten Vitamin-D-Verbindungen aus 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindungen,
bei dem eine 5,6-trans-Vitamin-D-Verbindung allylisch oxidiert wird, das Oxidationsprodukt
aktinisch in Anwesenheit eines photosensibilisierenden Mittels bestrahlt wird und
die 1£ -hydroxylierte Verbindung gewonnen wird.