DE3033406C2 - - Google Patents

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Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung von schnell wachsenden foetalen Rhesus­ affennierenzellen und gemäß Anspruch 2 ihre Verwendung zur Ver­ mehrung von Hepatitis-A-Viren bzw. HAV-Antigenen.
Hepatitis-A-Viren (HAV) werden in verschiedener Weise zur Diagnose der Hepatitis-A-Infektion eingesetzt. Man läßt dabei gezüchtete Viren auf die im Patientenstuhl oder -serum befindlichen Antikör­ per einwirken. Aus der Menge der durch Reaktion mit den Antikör­ pern verbrauchten HAV läßt sich auf das Vorhandensein von Infek­ tionen schließen.
HAV wurden bisher aus menschlichem Stuhl gewonnen. Es sind auch Verfahren bekannt, HAV auf Zellkulturen von Affennieren zu züchten. Beide Verfahren haben jedoch den Nachteil geringer Ausbeuten.
Die vorliegende Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die Vermehrung von HAV zu steigern.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst.
Die schnell wachsenden foetalen Rhesusaffennierenzellen sind dadurch erhältlich, daß man eine bekannte langsam wachsende Frhk-4-Zellinie in einem Nährmedium aussät, wachsen läßt und durch häufiges schnelles Umpflanzen schnell wachsende Zellen produziert und se­ lektiert. Der Umpflanzvorgang wird dabei etwa 15mal wieder­ holt.
Die Frhk-Zellen werden dabei in Earls MEM (minimal essential medi­ um) oder einem entsprechendem Nährmedium mit etwa 10% foetalem Käl­ berserum, Humanserum oder Kälberserum und etwa 0,5% Lactalbumin ausgesät. Man läßt dann eine Monolayerschicht wachsen, suspendiert Zellen mit Versen-Trypsin-, Trypsinlösung oder Collagenase und nimmt mit dem etwa 3fachen des ursprünglichen Mediums auf. Dann sät man erneut aus und wiederholt den Vorgang nach Erreichen eines 90-100% dichten Bewuchses etwa 15mal.
Auf den so gewonnenen schnell wachsenden foetalen Affennierenzel­ len können HAV bzw. HAV Antigene erheblich schneller vermehrt werden als nach dem Stand der Technik.
Erfindungsgemäß geht man dabei folgendermaßen vor:
Eine HAV-Suspension in Hanks' BSS wird auf dicht bewachsene foetale Affennierenzellen aufgegeben. Man adsorbiert und gibt Earls MEM oder ein gleichwertiges Medium mit etwa 5% foetalem Kälberserum und etwa 0,5% Lactalbumin als Erhaltungsmedium auf. Nach Bedarf kann das Erhaltungsmedium erneuert werden. Die Zellen bzw. Viren werden durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen mit Hanks' BSS geerntet. Dabei werden die Zellen etwa wöchentlich 1 : 2 bis 1 : 3 umgepflanzt. Jeweils ein Teil davon wird zur Ernte, ein Teil zur Zellvermehrung verwendet. Auf diese Weise gelingt es unschwer HAV bzw. HAV-Antigen kontinuierlich herzustellen.
Die HAV können zur Reaktion mit HAV Antikörpern nach allen be­ kannten Tests eingsetzt werden, siehe hierzu z. B. "Bundesge­ sundheitsblatt", 21. Jahrg. 1978, Nr. 17.
In vorteilhafter Weise können auch die beim Züchtungsvorgang in das Erhaltungsmedium ausgeschleusten HAV bzw. HAV-Antigene zur Reak­ tion mit HAV Antikörpern eingesetzt werden.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung an Hand zweier Durch­ führungsbeispiele erläutert:
1. Beschreibung der Herstellung von schnell wachsendem foetalen Rhesusaffennierenzellen aus Frhk-4 Zellen
Die in -70°C oder flüssigen Stickstoff eingefrorenen Frhk-4 Zellen in Glasampullen wurden aufgestaut und mit Earls MEM mit 10% foetalem Kälberserum und 0,5% Lactal­ bumin in Zellkulturschalen ausgesät. Nachdem eine Mono­ layer-Zellschicht gewachsen war (3-4 Wochen), wurden die Zellen mit Versen-Trypsinlösung von der Zellkulturflasche abtrypsiniert und mit dem Dreifachen des ursprünglichen Mediums aufgenommen und wieder ausgesät. Das Zellwachs­ tum wurde beobachtet und der Umpflanzvorgang wurde 15mal wiederholt, jeweils nachdem die Zellkulturschale zu ca. 90-100% dicht bewachsen war. Durch dieses Umpflanzver­ fahren wurden die schnell wachsenden Zellen aus den ur­ sprünglich langsam wachsenden Zellen selektiert. Der ent­ scheidende Schritt lag an dem jeweiligen Zeitpunkt des Umpflanzens, wodurch eine Verkürzung der Verdoppelungs­ zeit von Passage zu Passage erreicht wurde.
2. Züchtung von Hepatitis-A-Viren in schnell wachsendem foetalen Rhesusaffennierenzellen
Infektiöse Hepatitis-A-Viren (HAV) wurden in Suspension in Hanks' BSS auf die dicht bewachsenden foetalen Rhesusaffennierenzellen aufgegeben und zwei Stunden bei 37°C adsorbiert. Nach zwei Stunden wurde Earls MEM mit 5% foetalem Kälberserum und 0,5% Lactalbumin als Erhaltungsmedium aufgegeben und in 3tägigem Abstand erneuert. Nach unterschiedlichen Zei­ ten (3-10 Wochen), je nach Wachstum des HAV, wurden die Zellen durch 3maliges Einfrieren und Auftauen mit Hanks' BSS geerntet (10 MIO Zellen + 5 ml Hanks' BSS). Die 5 ml wurden 10 min mit 3000 g zentrifugiert und der Überstand als HAV-Antigen verwendet. Soweit von der Kon­ zentration her möglich, wurde das HAV, das in das Erhal­ tungsmedium ausgeschleust wurde, ebenfalls als Antigen verwendet. Zur permanenten Produktion können diese HAV produzierenden schnell wachsenden foetalen Rhesusaffennierenzellen wöchentlich 1 : 2 bis 1 : 3 umgepflanzt und jeweils ein Teil zur HAV-Ernte ver­ wendet werden.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von schnell wachsenden foetalen Rhesusaffennierenzellen, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man die langsam wachsende Frhk-4- Zellinie in Earls MEM oder einem entsprechenden Nährmedium mit 10% foetalem Kälberserum, Humanserum oder Kälberserum und 0,5 % Lactalbumin aussät, eine Monolayer-Zellschicht wachsen läßt, die Zellen mit Versen-Trypsin-, Trypsinlösung oder Collagenase suspendiert und dem 3fachen des ursprünglichen Mediums aufnimmt und erneut aussät, wobei der Vor­ gang nach Erreichen eines 90 bis 100% dichten Be­ wuchses 15mal wiederholt wird.
2. Verwendung der nach Anspruch 1 erhaltenen Zellen zur Vermehrung von HAV bzw. HAV- Antigenen.
DE19803033406 1980-09-05 1980-09-05 Zellkultur frhk-4/r. Granted DE3033406A1 (de)

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