DE29824000U1 - Stick-System für Küvetten zur Durchführung immunologischer Verfahren - Google Patents

Description

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Stick-system für Küvetten zur Durchführung immunologischer Verfahren

Beschreibung

Die Erfindung betrifft Formulierungen zur Herstellung biologischer, insbesondere immunologischer, enzymatischer und chemischer Testsysteme, bei denen in die Polymergrundmasse reaktive funktioneile Gruppen liefernde Verbindungen eingelagert sind, sowie Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft insbesondere Formulierungen auf der Basis nachwachsender Rohstoffe, in die reaktive funktionelle Gruppen liefernde Verbindungen eingelagert sind. Desweiteren betrifft die Erfindung die Anwendung der Formulierungen in Form von Immunosticks, bei denen als Teströhrchen eine Küvette, bevorzugt eine Halbmikroküvette, eingesetzt wird und die Immunosticks zugleich Küvettenstopfen sind.

Immunologische Testsysteme, die mit Hilfe der verschiedenen Antikörper hergestellt werden, sind aus der modernen Analytik und Forschung nicht mehr wegzudenken. Die Tests, werden in der Regel als Festphasenassays durchgeführt, wobei eine der am Test beteiligten Reaktanden (z.B. Antigen, Antikörper, deren Konjugate oder Substanzen, die mit ihnen reagieren) an eine feste Matrix gebunden werden. Die Festphasen sind Formkörper aus polymeren Verbindungen in Form von beispielsweise Beads (Kügelchen), Immunoröhrchen, Sticks oder Mikrotiterplatten. Polymere Verbindungen können dabei aus fossilen Rohstoffen wie das am häufigsten verwendete Plastikmaterial Polystyrol oder aus nachwachsenden Rohstoffen wie Polyhydroxybuttersäure, Polylaktid (Racemat bzw- L-Form), modifizierte Stärke, modifizierte Zellulose stammen.

Bei der Durchführung der immunologischen Testsysteme wird ein Reaktionspartner an die Oberfläche der Formkörper nach an sich bekannten Verfahren gebunden. Die Bindung ist dabei in der Regel adhäsiv,wobei unterschiediche Molekülteile des Reaktanden gebunden werden können, da adhäsive Bindungen nicht spezifisch sind. Für eine adhäsive Bindung eignen sich in der Regel nur Moleküle, die ein größeres Molekulargewicht als 2000 besitzen. Kleinere Moleküle werden nicht oder nicht reproduzierbar fixiert. In manchen Anwendungsbereichen (Haptene in Medizin Umweltanalytik, Pharmazie oder kleine Peptide, üblicherweise mit einem

Molekulargewicht von ca. 1500) ist es jedoch wichtig, auch kleinere Moleküle an die Formkörper zu binden und spezifische, quantitative Testsysteme zu· entwickeln.

Es gibt in neuerer Zeit im Handel auch Festkörper in Form von Mikrotiterplatten, deren Oberfläche so modifiziert wurde, daß sie Aminogruppen enthält, die Carboxygruppen eines anderen Moleküls durch Ausbildung einer Säureamidbindung kovalent binden können. Diese Oberflächen besitzen jedoch im Vergleich zu nicht modifizierten Oberflächen den Nachteil, daß die Haltbarkeit geringer ist und sie so für die Produktion von fertigen Test-kits, deren Haltbarkeit üblicherweise ein Jahr betragen soll, oft nicht geeignet sind. Zudem sind sie für Standardisierungen von Haptenen mit niedrigen Molekulargewicht (meist 200-400) wenig geeignet, da die Standardkurven meist zu flach sind und so eine quantitative Auswertung erschwert ist. Formkörper mit aktivierten Oberflächen, die mit anderen funktionellen Gruppen als Carboxygruppen ganz spezifisch mit guter Qualität und Haltbarkeit reagieren können, gibt es derzeit nicht. Immunosticks für immunologische oder enzymatische Applikationen sind interessant für Anwender mit geringem Probenaufkommen oder nur elementar ausgerichtenen Labors, da diese Tests im Gegensatz zu Mikrotiterplattentests auch mit visueller Auswertung oder Messungen in konventionellen Spektralphotometern durchgeführt werden können.

Immunosticks gibt es momentan nur in Form von adhäsiv anwendbaren Stäbchen auf Polystyrolbasis, sticks für die Anwendung kovalenter Bindung existieren nicht. Die Immunosticks nach dem Stand der Technik befinden sich für die Testdurchführung in speziellen Röhrchen, in denen der Assay ausgeführt werden kann. Substratlösungen müssen zur Messung und Auswertung umpipettiert werden.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Immunosticksysteme bereitzustellen, die in immunologischen Reaktionssystemen eingesetzt werden können. Insbesondere sollen sich die Formulierungen, die für die Produktion der sticks verwendet werden, zum Einsatz in immunologischen Testsystemen eignen. Die Formulierungen sollen es ermöglichen, Moleküle adhäsiv zu binden und auch niedermolekulare Substanzen definiert kovalent an die Matrix zu koppeln, wobei u. a. eine für Test-kits nötige Haltbarkeit gewährleistet werden kann. Dabei soll es möglich sein, durch unterschiedliche Einlagerungen in die Polymerformulierungen verschiedene funktioneile Gruppen kovalent an die Matrix zu binden. Zugleich soll vor allem eine erhöhte Haltbarkeit und Lagerbeständigkeit der Formulierungen erreicht werden. Zusätzlich sollen erfindungsgemäß Matrix-Effekte in immunologischen Testsystemen minimiert und die Spezifität der Bindung erhöht werden. Immunosticks mit den

entsprechenden Eigenschaften sollen dabei in einem System derart integriert werden, daß eine direkte Messung der Substratlösung ohne vorangehende Arbeitsschritte ermöglicht wird.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Stickystem für Küvetten für immunologische Reaktionssyteme, umfassend eine Polymergrundmasse aus fossilen oder nachwachsenden Rohstoffen, in die eine oder mehrere funktionelle Gruppen liefernde Verbindungen eingelagert sind. Bevorzugt liegt diese Formulierung für Festphasenanwendungen vor. Gegenstand der Erfindung sind mit dieser Formulierung hergestellte Immunostick-Systeme, wobei der stick in eine handelsübliche Küvette eingeführt werden kann, in der die Testreaktionen durchgeführt werden, und in der zur Auswertung direkt gemessen werden kann. Der stick fungiert dabei zusätzlich als wiederverschließbarer Stopfen der Küvette, sodaß mehrere aufeinanderfolgende Pipettier- und Mischvorgänge im System durchgeführt werden können.

Es wurde gefunden, daß in Polymerstruturen, die fur eine Weiterverarbeitung zu Formkörpern - aber auch zu pulverisiertem Material für z.B. Adjuvantien oder Säulenmaterial für Affinitäschromatographie - verwendet werden, sei es auf Basis fossiler oder nachwachsender Rohstoffe Moleküle eingelagert werden können, die definierte funktionelle Gruppen in Form von Oligo- oder Polylieferanten dieser Gruppen enthalten und an die verschiedenen Moleküle gebunden werden können.

Als eingelagerte funktionelle Gruppen dienen dabei insbesondere Amino-, Carboxy- oder SH-Gruppen. Durch die Einlagerung von Lieferanten dieser funktionellen Gruppen in die Matrix der für immunologische Verfahren verwendeten Materialien ist es möglich, definiert Substanzen kovalent zu binden. Das Molekulargewicht der Verbindungen kann zwischen 100 und 200 000 liegen.

Die Träger der funktioneilen Gruppen werden dabei nach Bedarf so gewählt, daß nach Möglichkeit nur eine Art von funktioneller Gruppen für die Kopplung des Reaktanden zur Verfügung steht. Dies gewährleistet, daß ganz definiert über eine Stelle der am Testsystem beteiligten Substanz gebunden wird.

Bevorzugt eignen sich dafür Polyaminosäuren, bei denen eine freie funktionelle Gruppe für eine kovalente Bindung an einen Reaktanden zur Verfügung steht.

Soll ein Molekül über eine Carboxygruppe an die Formkörper gebunden werden, wird in dessen Matrix ein Polyaminogruppenlieferant eingelagert. Dies kann z. B. Oligo- bzw. Polylysin oder das Oligomer der Polymergrundmasse mit eingeführten Aminogruppen sein.

Eine Polymerverbindung aus Polyaspartat und Lysin ist ebenfalls als Aminogruppenlieferant geeignet.

Nach an sich bekannten Verfahren koppelt man mit Carbodiimid über eine Säureamidbindung die COOH- Gruppe des Reaktanden an die Aminogruppen z. B. des Polylysins. Analog dazu kann man durch Einlagerung von Carboxygruppenlieferanten Reaktanden mit ihrer Aminogruppe kovalent binden. Als Lieferant von Carboxygruppen kann beispielsweise das Oligo- bzw. Polymermolekül der Glutaminsäure oder Asparaginsäure, ein derivatisiertes Oligomer der Polymergrundmasse oder Terephthalsäure dienen. Geeignet scheinen auch monomere aromatische Substanzen mit Amino- und/oder Carboxygruppen zu sein. Zur Ausbildung von Disulfidbrücken können geeignete Oligo- oder Polymere von Cysteinderivaten eingesetzt werden. Es ist somit gewährleistet, daß eine geeignete funktionelle Gruppe der zu bindenden Substanz definiert an die Formkörper fixiert wird. Über andere funktionelle Gruppen durch Wahl geeigneter Substanzen ist gewährleistet, daß eine funktionelle Gruppe der zu bindenden Substanz definiert an die Formkörper fixiert wird. Über andere funktionelle Gruppen, die sich noch im Molekül befinden können, ist keine Kopplung möglich. Dies führt zur verbesserten Standardisierungen der immunologischen Testsysteme, sowie zur selektiven und spezifischen Bindung der Moleküle.

Der Anteil an Einlagerungen in die Polymermatrix kann zwischen 0,05 % - 5% bezogen auf das Gewicht der Polymermatrix betragen. Der bevorzugte Bereich liegt zwischen 0,1 % und 1% Anteil an Einlagerungen in der Polymerstruktur, der besonders bevorzugte Bereich zwischen 0,2% und 0,5%. Die Art der Polymermatrix hat auf die Konzentrationen der Einlagerungen wenig Einfluß, so daß die Bereiche generell für jede Polymermatrix gelten können. Zusätzlich können die Polymere - z. B. Polystyrol, PHB oder PLA -je nach Bedarf für die Verarbeitbarkeit oder Anwendungsart unterschiedliche Konzentrationen an weiteren Substanzen wie z. B. nieder- und hochmolekulare Weichmacher, Nukleinierungsmittel, Farbstoffe, technischer Hüfsstoffe enthalten. Diese Substanzen sind für jedes Polymer individuell und an sich bekannt und werden von einem Fachmann je nach gewünschten Endprodukt zudosiert.

Als Ausgangsprodukte fur die Granulatherstellung der Polymere sind handelsübliche Produkte auf der Basis fossiler oder nachwachsender Rohstoffe sowie Mischpolymere daraus, die üblicherweise zur Herstellung von immunologischen, enzymatischen oder chemischen Verfahren verwendet werden.

Beispiele hierfür sind die PBH-Formulierung Biomer P152 von Biomer Deutschland und bei PLA die Formulierung Lakty Typ 1012 von Shimazu Corp., Japan.

Die Struktur der nachwachsenden Rohstoffe PHB und PLA wird durch folgende Strukturformeln charakterisiert:

PHB: H - (O-CH(CH3)CH2COO-)n OH;
PLA: H - (O-CH(CH3)-COO-)n OH.

Die Ausgangsgranulate der Polymeren - bevorzugt Polystyrol, PHB und PLA - werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt. Diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Den Granulaten wird dann in einem Extruder eine geeignete Menge an funktionellen Gruppen liefernde Verbindungen zudosiert, extrudiert und z. B. zu Beads verarbeitet. Die Verarbeitungstemperaturen betragen dabei 110-210 Grad C. Aus dem so gewonnenen Produkt können nach an sich bekannten Verfahren verschiedene Formkörper z. B. Immunosticks, Immunoröhrchen, Kügelchen oder Mikrotiterplatten fur die Anwendung in Tests, die auf Bindung einer Substanz beruhen, insbesondere immunologischer, enzymatischer oder chemischer Testsysteme hergestellt werden. Die Rohmatrix mit den Einlagerungen kann jedoch auch für die Beschichtung von Formkörpern (z. B. modifizierte Zellulose oder modifizierte Stärke) durch technische Prozesse wie z.B. Coinjection eingesetzt werden.

Bei der Verwendung von Immuosticks empfiehlt sich ein System, bei dem der Test für Inkubation und Messung in einer Halbmikroküvette durchgeführt wird, wobei das Stäbchen zugleich der Küvettenstopfen ist.

Die erfindungsgemäßen Stick-Küvetten-Systeme können für alle bisher eingesetzten Verfahren verwendet werden, sowohl für den Einsatz kovalenter als auch adhäsiver Bindungen.

Wenn die erfindungsgemäßen Formulierungen fur biologische Testsysteme verwendet werden, so werden bevorzugt Beads, Immunoröhrchen, Mikrotiterplatten oder Sticks für die Anwendung in immunologischen, enzymatischen und chemischen Testsystemen oder pulverförmige Produkte (Adjuvans, Säulenmaterial) hergestellt. Sie zeigen nach Verarbeitung zu den jeweiligen Endprodukten eine ausreichende Haltbarkeit auch for ihre Anwendung in Test-kits. Die funktionellen Gruppen der Lieferanten, die in die Polymermatrix eingelagert sind, werden nach an sich bekannten Verfahren und chemischen Reaktionen - z. B. Herstellung einer Säureamidbindung zwischen Amino- und Carboxygruppe mit Carbodiimid - gekoppelt. Die weitere Durchführung der Verfahren erfolgt je nach Art nach an sich bekannten Verfahren.

Die erfindungsgemäßen Formulierungen können für alle bisher eingesetzten Verfahren verwendet werden, vorausgesetzt wenigstens ein Reaktand besitzt eine geeignete funktionelle Gruppe für die kovalente Bindung an die Matrix. Der Unterschied besteht im Vergleich zu konventionellen Verfahren darin, daß jetzt die Matrix nicht adhäsiv, sondern definiert kovalent beschichtet wird. Bevorzugt ist dabei der Einsatz in Testsystemen, bei denen Oligonukleotide, Peptide, Oligosaccharide oder niedermolekulare Haptene an die Oberfläche gebunden werden sollen. So werden beispielsweise Blutinhaltsstoffe, Pestizide im Wasser. Toxine oder Pharmaka in Futter- und Lebensmitteln, Bakterien und Viren nachgewiesen, zur Immunisierung gekoppelt oder für die Affinitätschromatographie an Säulen gebunden. Ein weiteres Einsatzgebiet ist der Nachweis von Peptiden oder Nukleotiden, deren Immunisierung bzw. Aufreinigung, wie sie beispielsweise für die Medizin oder Genforschung benötigt werden. Durch die definierte kovalente Bindung an die erfindungsgemäßen Formulierungen mit Einlagerungen ist es möglich, eine ausreichende Standardisierung auch bei Haptenen zu erzielen.

Die kovalente Bindung ermöglicht beim Einsatz der Matrix als Formkörper, auf denen Tests durchgeführt werden, zusätzlich die Minimierung von Matrixeffekten, die bei immunologischen Verfahren oft auftreten. Da bei den Tests mit Antikörpern gearbeitet wird, nimmt das Milieu, in dem sich der Antikörper befindet, Einfluß auf Bindungskapazität, da die Struktur des Antikörperproteins (IgG) durch pH-Wert oder Ionenstärke der zu untersuchenden Probe beeinflußt wird. Ist das Antigen jedoch kovalent gebunden, können durch Waschschritte unerwünschte Begleitsubstanzen entfernt werden, bevor man durch Zugabe von IgG die eigentliche Testreaktion nach an sich bekannten Verfahren einleitet. Außerdem ist es möglich, wenn sich in einer Probe unterschiedliche Substanzen befinden, die nach bisherigen Verfahren

alle adhäsiv binden würden, selektiv nur diejenigen zu koppeln, die eine entsprechende funktionelle Gruppe besitzen. Dies erhöht entscheidend die Spezifität der Testsysteme.

Das erfindungsgemäße Stick-system für Küvetten wird durch die folgendes Beispiel näher erläutert. Es dient jedoch nicht dazu, den Umfang der Erfindung zu beschränken.

In Fig. 1 ist die Breitseite des sticks dargestellt, wobei Ziffer 3 die breite Seite des reaktiven sticks darstellt. Fig. 2 zeigt eine Gesamtansicht der schmalen Seite, bei der am oberen Teil des stick, der die Stopfenfunktion erfüllt, die Fixierungen angebracht sind, die den stick während des Testablaufs in der Küvette in der richtigen Position halten. 1 bezeichnet dabei jeweils den oberen Teil, der als Stopfen fungiert, 2 die Nasen, die eine Fixierung an der Küvette ermöglichen. Ziffer 4 bezeichnet eine Ansicht der schmalen Seite des reaktiven sticks.

In Fig. 3 ist ein Querschnitt durch den stick gezeigt, der am Stopfen eine der Küvette entsprechenden runde form aufweist, während der reaktive stick selbst im Querschnitt rechteckig ist, um in die jeweiligen Küvettenfomien zu passen. Ziffer 5 bezeichnet dabei die runde Wand des Stopfenteils, Ziffer 6 den Querschnitt des reaktiven sticks.

Claims (4)

1. Stick-system für Küvetten mit einer Formulierung für immunologische Reaktionssysteme, umfassend eine Polymergrundmasse, in die zusätzlich eine oder mehrere reaktive funktionelle Gruppen liefernde Verbindungen eingelagert sind.

2. Stick-system nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerformuierungen zugleich als Küvettenstopfen fungieren.

3. Sticks nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, das die sticks für Küvetten mit innerem Rund- und äußerem Rechteckformat geeignet sind.

4. Sticks nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymergrundmasse der Sticks aus fossilen bzw. nachwachsenden Rohstoffen besteht.