DE2924446C2 - Verfahren und Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen und Geweben von Menschen und Tieren oder von Mikroorganismen - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen und Geweben von Menschen und Tieren oder von Mikroorganismen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie eine Vorrichtung zuft Durchführung des Verfahrens.
Ein solches Verfahren ist in der DE-PS 21 28 744
beschrieben.
Ferner ist aus der DE-OS 26 26 733 ein Verfahren zum automatischen und fortgesetzten Züchten lebender Gewebe oder Zellen bekannt, bei der eine Kontrolle von Temperatur, Feuchtigkeit und Gasatmosphäre im Zuchtbehälter stattfinden soll, indem nach Meßwerten die Zuchtbedingungen und Arbeiten zum Züchten einer (Sub-)Kultur aus einer bestehenden Kultur gesteuert werden. Wie dies allerdings im einzelnen geschehen soll, insbesondere hinsichtlich der Kontrolle der feuchtigkeit im Zusammenhang mit den anderen Bedingungen, die sich zum Teil wechselseitig beeinflussen, läßt diese Veröffentlichung offen.
Aufgabe der Erfindung ist es, das bekannte Verfahren für Einfach- und Vielfachansätze und die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, insbesondere einen Brutschrank zum kontrollierten Begasen mit Kohlendioxid, Luft oder Sauerstoff bzw. Stickstoff hinsichtlich der Annäherung an physiologischen Bedingungen »in vivo« weiter zu verbessern.
Bei dem bekannten Verfahren und Vorrichtung wurde bei einer bestimmten Brutschranktemperatur der Wasserdampfdruck im allgemeinen konstant gehauen, in dem man die eingeleiteten Gase mit Wasserdampf sättigte. Hierzu diente ein in einer Bodenwanne des Brutschrankes enthaltenes Wasserbad bzw. Sumpf.
Es hat sich gezeigt daß ein Wasserbad im Nutzraum des Brutschrankes — hier Kultivationsraum — wie es zur Aufrechterhaltung einer hohen relativen Feuchte erforderlich ist, die Gefahr von Pilz- und Bakterienkontamination für die Kulturen-Ansätze fördert
Die Erfindung beschreitet deshalb einen völlig anderen Weg, nämlich die Lösung, wie sie in Anspruch 1 bzw. Anspruch 2 gekennzeichnet ist Die Ansprüche 3 bis 7 nennen Ausgestaltungen der beanspruchten Vorrichtung, die im Anspruch 2 angegeben ist Es wird hierdurch nicht nur die erwähnte Kontaminationsgefahr, z. B. durch Keime, verringert, sondern auch unerwünschte Kondensatbildung im Nutzraum weiter verringert durch den beheizten Luftmantel. Darüber hinaus wird die relative Feuchte nicht nur nahe der Sättigungsgrenze eingestellt, sondern im wetten Bereich von etwa 60% bis 95% regelbar. Von besonderer Bedeutung ist es, daß die gewünschte relative Feuchte sehr schnell erreicht werden kann, was auch für die Zusammensetzung der Nutzraum-Atmosphäre und deren Temperatur gilt, insbesondere auch nach öffnen und wieder Schließen der Brutschranktür. Nicht zuletzt ist ein wesentlicher Vorteil der Erfindung in der einfachen Sterilisicrong des Nutzraums in Betriebspausen zu sehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ergibt auch weitere Anwendungsbereiche infolge der verbesserten Kontroll- und Regelmöglichkeiten. Bei der Erfindung sind nicht nur die in der DE-PS 21 28 744 beschriebenen folienartigen Behälter für die Kulturansätze anwendbar, sondern auch Kulturflaschen, z. B. in der Art, wie in dem DE-GM 72 38 351 beschriebenen oder in Form von schalen- oder topfartigen Behältern, wie z. B. in der DE-PS 25 41 000 beschrieben.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung rein schematisch dargestellt und anhand der nachfolgenden Beschreibung erläutert Es zeigt
Fig. 1 eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung,
Fig.2 einen Schnitt durch einen Brutschrank zur Durchführung des Verfahrens,
Fig.3 einen Ausschnitt der Kantroll- bzw. Regeleinrichtung für die Atmosphäre im Nutzraum des Brutschrankes nach F i g. 1 in vergrößertem Maßstab,
Wie der Fig, 1 zu entnehmen, weist der Begasungsbrutschrank eine elektronisch geregelte biologische Atmosphäre im Nutzraum 10 auf, die den »in vivo«-Bedingungen möglichst nahe kommt Hierbei ist es möglich, die Zusammensetzung der Atmosphäre in weiten Grenzen zu ändern, insbesondere hinsichtlich der Bestandteile und Anteile des Gemisches, wenn es außer CO2 nocn Sauerstoff (oder Luft) und Wasserdampf enthält, in bestimmten kontrollierten Grenzen, hier besonders der relativen Feuchte, der Temperatur und des kontrollierten Gehaltes der Gase, wobei nach der Henderson-Hasselbach-GIeichung, z.B. über die is CCVRegelung, auch eine Kontrolle des pH-Wertes möglich und von Vorteil ist
In einem thermisch an den Nutzraum 10 gekoppelten Bypaßkai.al 1 sind die Meßfühler angeordnet, wie der Meßfühler 2 für die Konzentration des CO2-Gases, der Meßfühler 3 für die Temperatur der umgewälzten Strömung, der Feuchtefühler 4 sowie gegebenenfalls Elektroden für die Erfassung des Sauerstoff-Gases und des pH-Wertes. Insbesondere die beiden letztgenannten Fühler sind jedoch an anderer Stelle, bevorzugt im Nutzraum 10, insbesondere im flüssigen Kulturmedium, das bei den Ansätzen verwendet wird, angeordnet
Der Nutzraum wird wahlweise und kontrolliert begast, z. B. von einzelnen Quellen über Druckminderventile mittels CO2, Luft oder Sauerstoff bzw. Stickstoff, wie später noch im einzelnen erläutert und diese Gase werden einzeln oder gemeinsam über Sterilfilter 8a der Leitung 8 und Vorwärmer 9 im Doppelmantel 11 des Brutschrankes dem Bypaßkanal 1 zugeführt und dort mit Wasserdampf aus der Leitung 7 vermischt, welcher durch Überhitzen im Verdampfer 20 außerhalb des Nutzraumes sterilisiert und abgekühlt wurde.
Der Nutzraum 10 und der Doppelmantel 11 sind von einer Wärmeisolationsschicht Ua umgeben, die wiederum durch eine wasserdampfdichte Haut 116, z.B. aus «o Aluminium-Folie, nach außen abgeschlossen ist und sowohl vor eindringender Außenluft als auch vor Durchfeuchtung im Kühlbetrieb schützt (siehe F i g. 2).
Die Luftumwälzung im Zwischenraum des Doppelmantels 11 erfolgt vorzugsweise mit einem über die «5 volle Breite des Mantelquerschnitts sich erstreckenden Querstromgebläse 12. Innerhalb des .Doppelmantels 11, der Innenwand desselben und somit dem Nutzraum 10 zugeordnet, sind Heizelemente, insbesondere elektrische Heizelemente 13 und Kühlkanäle 14, bevorzugt in symmetrischer Anordnung, d. h. gleichmäßig über den Umfang des Mantels, wie Fig.2 zeigt, verteilt Der DoppelmaiT'.el 11 kann auf diese Weise eine sehr gleichmäßige Temperatur des Nutzraums 10 gewährleisten, so daß trotz hoher Feuchte darin der Taupunkt nicht unterschritten wird.
Der Feuchteregelung dient ein eigener Regelkreis, gesteuert von einem Psychrometer, das über Steuerleitungen verbunden ist mit einer Pumpe 15, die z. B. entionisiertes Wasser aus dem Vorratsbehälter 19 dem &> Verdampfer 20 zuführt, welcher das Wasser verdampft und durch Überhitzen auf eine Temperatur von mehr als 1000C bis etwa 500"C sterilisiert, und danach dem Bypaßkanal 1 für den Umlauf durch den Nutzraum 10 zuführt Das Psychrometer besteht aus einem Trockenthermometer 16 und einem Naßthermometer 17, z. B. Widerstandsthermometer, wobei letzteres eine» Docht 17a aufweist, der in eintr Saugnapf 18 hineinragt, wobei diese Teile in dem Bypaßkanal 1 angeordnet sind.
Das Psychrometer ist dabei an einer solchen Stelle des Kanals, vorzugsweise mit Querschnittsverengung, angeordnet, daß der Meßfühler 4 jedenfalls am Naßthermometer einer optimalen Anströmungsgeschwindigkeit des umgewälzten Mediums ausgesetzt ist Im Bypaßkanal 1 ist noch der Meßfühler 2 für die Konzentration des CCh-Gases und der Meßfühler 3 für die Temperatur der umgewälzten Strömung angeordnet.
Die CO2- Regelung erfolgt ebenfalls in einem eigenen Regelkreis, wobei der Meßfühler 2 eine Wärmeleitfühigkeitsmeßzelle ist, die z. B. aus vier Platinmeßwiderständen in Brückenschaltung besteht, die in einem isothermischen Gehäuse auf eine bestimmte Temperatur, z. B. etwa 130°C erwärmt und gehalten wird.
Zwei der Meßwiderstände sind in abgeschlossenen Kammern dem Referenzgas Luft, die anderen zwei der Nutzraum-Atmosphäre ausgesetzt Ändert sich die Wärmeleitfähigkeit in der Nutzraum-Atmosphäre, dann wird durch unterschiedliche Abkühlung dieser Meßwiderstände ein elektrisches, dem -.'^-Anteil in der Nutzraum-Atmosphäre direkt proportianaies Signal erzeugt und dem Regler zugeführt.
Auch für die Temperaturregelung wird als Meßfühler 3 bevorzugt ein Platinmeßwiderstand Pt 100 und ein Regler sit PID-Verhalten sowie eine Anschlußmöglichkeit für einen Zeit-Temperaturprogrammgeber.
Insbesondere aus Fig.3 ist ersichtlich, daß der Kühlfalle 5 eine Abtauheizung Sa zugeordnet ist und eine Sammelrinne 5b. Anfallendes Konüenswasser wird einem Auffanggefäß 24 mit eigenem Niveaufühler 24a zugeführt, wo es bedarfsweise von Zeit zu Zeit abgesaugt werden kann mit Hilfe einer Pumpe 23, die es dem Verdampfer 20 und von dort der Umgebung zuführt.
In F i g. 3 ist ?.uch ersichtlich, daß der Verdampfer 20 etwa die Form eines Rohrofens aufweist und vorzugsweise mit einer im Ofenmantel angeordneten elektrischen Heizung auf die angegebene Temperatur beheizbar ist. Es ist ferner noch eine Kondensationseinrichtung 25 (z. B. Rohrschlange) und Magnetventil 22 in der dampfleitung vom Verdampfer 20 zum Bypaßkanal i angeordnet
Verfahrensablauf bzw. Funktion dts Brutschrankes:
Nach Betätigen des Hauptschalters werden im Doppelmantel 11 die elektrischen Heizelemente 13 eingeschaltet und auf die gewünschte Nutzraum-Temperatur geregelt Das Querstromgebläse 12 wird eingeschaltet und sorgt für eine den Nutzraum gleichmäßig temperierende Strömung im Mantel. Ebenso wie die Umwälzeinrichtung 6 eingeschaltet und wälzt turbulenzarm die Atmosphäre, wie in F i g. 1 durch die Pfeile dargestellt, dur,:h den Einlaß zum Bypaßkanal %r, de; Bypaßkanal 1 und den Auslaß vom Bypaß 6i> im Nutzraum 10 um. Der Bypaß 1 ist bevorzugt im thermischen Kontakt mit dem Nutzraumgehäuse, hier an dessen Rückwand, angeordnet.
Da beim Einschalten zunächst der Saugnapf 18, das als Feuchtigkeitjreservoir für den Docht 17a des Naßthermometers 17 dient, nicht mit Wasser befeuchtet ist, gibt ein Niveaufühler 21 in den Saugnapf 18 ein Signal »leer«, das dem Feuchteregelkreis zugeführt wird, ab. Eine mit dem Verdampfer 20 verbundene thermostatische Sperre läßt jedoch die Pumpe 15 erst dann starten, wenn der Verdampfer auf eine für die Verdampfung geeignete Temperatur aufgeheizt ist Sodann wird die Pumpe 15 vom Psychrometer 16, 17
geregelt, der Verdampfer 20 bleibt eingeschaltet. Die Pumpe 23 wird dagegen erst nach einem längeren Betrieb kurzzeitig eingeschaltet, wenn der Niveaufühler 24a Signal gibt, daß genügend Kondenswasser bzw. Abtauwasser aus der Kühlfalle 5 sich im Gefäß 24 gesammelt hat. was wiederum automatisch geschieht.
Die Kühlung des Nutzraumes auf gewünschte Temperaturen bis etwa +30C erfolgt mittels der Kühlkanäle 14 im Doppelmantel 11, durch die eine Kühlflüssigkeit, wie Wasser oder eine Sole, bevorzugt im Kreislauf umgewälzt wird. Dieser Kreislauf wird von einem eigenen Thermostaten gesteuert und in Gang gesetzt, /.. B. wenn für die Nutzraumtemperatur auch Werte unter Raumtemperatur (200C) erwünscht sind.
Es ist ersichtlich, daß die Kühlung bzw. der Kühlkreis von der Heizung für den Nutzraum unabhängig ist und auch unabhängig geregelt wird. Zur Heizung gehört auch mit Vorteil eine Türbeheizung.
Die Gemischbildung mit den aus Vorratsflaschen
wobei, wie oben beschrieben, eine Feuchteregelung der Nutzraum-Atmosphäre über die kontrollierte Einleitung von sterilisiertem und auf die gewünschte Temperatur abgekühltem Wasserdampf erfolgt.
Die CO2-Regelung wurde ebenfalls beschrieben. Luft kann mit einer eigenen Förderpumpe (nicht dargestellt) gewünschtenfalls in den Nutzraum geleitet werden.
Eine noch feinere Regelung der Atmosphäre des Nutzraumes läßt sich erreichen, wenn man auch den Sauerstoff-Druck (pOj) regelt. Hierzu wird vorzugsweise eine Clark-Elektrode mit einer sauerstoffdurchlässigen, jedoch für Flüssigkeit undurchlässige Membran verwendet. Die Elektrode weist eine Platin-Kathode und eine Silber-Anode auf. Als Elektrolyt dient eine 0.3 Mol.-KCI-Lösung. Die Elektrode ist durch die Membran von der umgebenden Nutzraum-Atmosphäre getrennt. Der Sauerstoff diffundiert durch die Membran und wird an der Platin-Kathode reduziert. Mittels einer an der Elektrode angelegten Polarisationsspannung von etwa einigen hundert Millivolt ist der Reduktionsstrom meßbar. Dieser ist direkt proportional dem Partialdruck des Sauerstoffs in der Nutzraum-Atmosphäre.
Wird die vorgewählte Sauerstoff-Konzentration in der Nutzraum-Atmosphäre erreicht, schließt das Magnetventil für Sauerstoff. Beim öffnen der Tür zum Nutzraum wird die Zufuhr aller Gase automatisch unterbunden.
Die Einstellung und Einhaltung eines Sauerstoffpartialdrucks oberhalb des Partialdrucks in der Luft (>21%) wird durch Einlassen von Sauerstoff in den Brutschrank eingestellt und geregelt.
Wird ein Sauerrioffpartialdruck unterhalb desselben in der Luft (<21%) gewünscht, so wird dieser Wert durch Einleiten von Stickstoff in den Brutschrank eingestellt, entsprechend dem von der Clark-Elektrode gemessenen Sauerstoffwert und durch Regelung entsprechend gehalten.
Gasgemische mit Konzentrationen an CO2 + O2, zusammen > 95 VoL-% sollten wegen des zu großen Gasverbrauches nicht gewählt werden. Die durch Magnetventile gesteuerte Zufuhr der einzelnen Gase für die Nutzraum-Atmosphäre kann von Hand unterbrochen werden, sie wird jedoch immer unterbrochen von einem eingebauten Türschalter, wenn und solange die Türe offen ist
Bei Kultivationsverf ahren, bei denen CO2 frei wird, ist
es vorteilhaft, mit Hilfe einer separat schaltbaren Pumpe Luft der Nutzraum-Atmosphäre zuzumischen. wodurch ein unerwünschtes Ansteigen der COrKonzentration verhindert wird. Nach Schließen der Türe erreichen alle geregelten Parameter sehr schnell wieder die gewünschten Sollwerte.
Der pH-Wert kann mit Hilfe eines separaten pH-V/ertreglers auf gewünschtem Wert gehalten werden. Hierzu dient eine Elektrode mit Pufferlösung in
ίο einem Referenzkulturgefäß, insbesondere mit einer Einstab-Meßkette. Derartige Referenzgefäße sind an sich bekannt. Als Pufferflüssigkeit bei der pH-Wert-Regelung hat sich besonders ein Medium aus einem Bicarbonat bestehend oder solches enthaltend bewährt.
|r> Dieses Medium wird von Zeit zu Zeit regeneriert.
Mit Hilfe verschiedener Maßnahmen, die vorstehend beschrieben sind, ist eine besonders sterile Arbeitsweise möglich. Dies fördert auch die Edelstahl-Ausführung des Nutzraumgehäuses bzw. ein Innengehäuse aus Kupfer
Darüber hinaus ist bei der Erfindung jedoch noch ein Heißsterilisiervorgang in Betriebspausen vorgesehen, d. h.. daß die Luft im Zwischenraum des Doppelmantels 11 dann willkürlich auf Knopfdruck beheizt werden
» kann. Wird eine solche Heiß-Sterilisierung gestartet, dann wird zunächst ein nicht dargestelltes Belüftungsventil am obersten Punkt der Kühlkanäle 14 geöffnet, die Kühlflüssigkeit läuft durch Schwerkraft zurück in das Bat' des Kühlkreislaufs, insbesondere einen
in Sammelbehälter für die Kühlflüssigkeit. Die elektrischen Heizelemente 13 werden aufgeheizt und nach Erreichen von etwa 18O0C Nutzriumtemperatur und Halten derselben über einen Zeitraum von etwa eine bis mehrere Stunden, je nach Kulturansätzen, von einem
« eigenen Thermostat abgeschaltet. Beide Umwälzeinrichtungen 6 und 12 laufen während des Heiß-Sterilisiervorganges und sorgen für eine gleichmäßige Temperaturverteilung. Mit Hilfe dieses Heiß-Sterilisiervorganges läßt sich der Anwendungsbereich des Brutschrankes
*o um Kultivationsansätze verschiedener Art erweitern. Andere bekannte Sterilisisatäonsmaßnahmen können verringert werden bzw. ganz entfallen. Die Heiß-Sterilisierung umfaßt auch die Regelfühler.
Der in vorstehender Beschreibung als Nutzraum 10
J5 bezeichnete Innenraum des Brutschrankgehäuses kann mit verschiedenen Einsätzen, wie Horden, versehen sein, die die Kultivationsbehälter tragen. Als Kultivationsbehälter können bekannte semipermeable Folienbehälter verschiedenster Form, Petrischalen, Flaschen,
Titer-Platten oder dergleichen Träger dienen.
Der Nutzraum kann als ganzes den Kultivationsraum bilden und z. B. durch eine Glastüre beobachtbar sc'.i. er kann aber auch in einzelne Kultivationskammern für Vielfachansätze unterteilt werden, z. B. dadurch, daß im
Nutzraum Horden bzw. Gestelle angeordnet sind, denen
einzelne Schleusen zugeordnet sind, durch die getrennte
Kammern mit in sich abgeschlossener Atmosphäre
geschaffen sind.
Bei Verwendung von Kulturflaschen, wie Enghalsfla-
sehen, können diese in den Horden oder Einsätzen oder Einschüben in an sich bekannter Weise mit einer einstellbaren Drehzahl gleichmäßig um ihre Achse rotierend angetrieben werden, vorzugsweise von einem gemeinsamen elektrischen Antriebsmotor. Auch soge-
nannte Röhrenroller mit Rolleneinrichtung für verstellbaren Neigungswinkel sind angebracht
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (7)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur !Cultivation von Zellen und Geweben von Menschen und Tieren oder von Mikroorganismen mittels Behaltern, die in einen Brutschrank einbringbar sind, der mit Kohlendioxid, Luft oder Sauerstoff bzw, Stickstoff kontrolliert begasbar, dessen Atmosphäre befeuchtbar und auf einer bestimmten Temperatur haltbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Gase einzeln oder gemeinsam fiber ein Sterilfilter (8ajder Leitung (8) im Doppelmantel (1!) des Brutschranks einem Bypaßkanal (1) zugeführt und dort mit Wasserdampf aus der Leitung (7) vermischt werden, welcher durch Oberhitzen im Verdampfer (20) außerhalb des Nutzraums (10) sterilisiert und abgekühlt wurde.
2. Brutschrank zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gase einzeln oder gemeinsam über ein Sterilfilter (8a; der Leitung (8) im Doppelmantel (11) des Brutschranks einem Bypaßkanal (1) zuführbar und dort mit Wasserdampf aus der Leitung (T) vermischbar sind, welcher durch Oberhitzen im Verdampfer (20) außerhalb des Nutzraums (10) sterilisiert und abgekühlt worden ist
3. Brutschrank nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch eine Regeleinrichtung (16,17) für die relative Feuchte im Bereich von etwa 60 bis 95%, die in einem Bypaß (1) zum Nutzraum (10) zur Begasung desselben angeordnet ist, mit einem Feuchtefühler (4) und einem Kühler wenigstens für den einzuleitenden heiß sterilisierten Dampf und/oder die einzuleitenden Gase, verbr-nden -lit einer von einem Wasserbehälter (19) lußerhalb des Nutzraumes Wasser dem Verdampfer (2C' zuführenden Pumpe (15).
4. Brutschrank nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Wände des Nutzraumes (10) von einem wärmeisolierten, dampfdichten Doppel- -»o mantel (11) umgeben sind, in dessen Zwischenraum die Heiz- (13) und/oder Kühlelemente (14) bzw. Wärmetauscher angeordnet sind und eine Einrichtung (12) für die Zwangsumwälzung der im Zwischenraum des Doppelmantels befindlichen Luft
5. Brutschrank nach den Ansprüchen 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gemischvorwärmung (9) die LuftVGaszuieitungen vor dem Eintritt in den Bypaßkanal (1) durch den temperierten Doppelmantel (11) hindurchgeführt sind.
6. Brutschrank nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß Nutzraum (10) und/oder Bypaß (1) einschließlich Meßfühlern von einer dem Nutzraum (10) zugeordneten Heizung (13) durch Ausheizen bis zu 180" C sterilisierbar sind.
7. Brutschrank nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Kühleinrichtung (14) des Nutzraumes bei Einschalten der Heizung (13) zum Sterilisieren automatisch von Kühlmitteln entleerbar und entlüftbar sind. w
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