DE2916536A1

DE2916536A1 - Neue peptidderivate und arzneimittel

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Publication number: DE2916536A1
Application number: DE19792916536
Authority: DE
Inventors: Dimitrios Sarantakis
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1978-04-24
Filing date: 1979-04-24
Publication date: 1979-10-31
Also published as: JPS54145630A; FR2425426B1; NL7902932A; IT7922062A0; FR2425426A1; IT1166758B; CH638776A5

Description

- B-

PATENTANWÄLTE

J. REITSTÖTTER

PROF. DR. DH, DIPL. INO.

W. BUNTE (1938-1976) DR. ING.

W. KINZBBACH

DR. PHIL·. DIPL. CHEM.

K. P. HÖLLER

DR. RBR. NAT. DIPL. CHBM.

TELBFONl (ΟΘΘ) 37 OB TELEXl B21G208 ISAR D

BAUERSTRASSB 22, 8000 MÜNCHEN

München, 24. April 1979 M/20 091

AHP 7272/7272-1-C1

AMERICAN HOME PRODUCTS

CORPORATION

685 Third Avenue

New York, N.Y.10017 USA

Neue Peptidderivate und Arzneimittel

WACH 780, D -8000 MÜNCHEN 48

ÖftlOINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

Die Erfindung betrifft synthetische Peptide, die dem Somatostatin strukturell verwandt sind, sowie Zwischenprodukte, die bei deren Synthese eingesetzt werden. Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel. Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen ist die Somatostatin-Peptidkette an den Positionen 4, 5 und 13 modifiziert, wobei vorzugsweise auch die Positionen 1, 2, und 14 modifiziert sind.

Somatostatin ist das cyclische Disulfid-tetradecapeptid der Formel I:

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp S S HO-Cys-Ser-Thr-Phe-Thr-Lys

(D

Dieses Peptid (I) wurde als der "Somatotropin-Release J Inhibiting Faktor" (SRIF) identifiziert, der vom Hypothalamus atis· geschieden wird und die Sekretion des Hypophysen-Wachstumshormons (GH) (Somatotropin) reguliert. /Vgl. Brazeau et al, Science 179;, 77 (1973), Burgus et al, Proc.Nat.Acad.Sci. (USA) 7£, 684 (1973) und Ling et al, Biochemical and Biophysical Res. Communication ^, 127 (1973)7-Bei der reduzierten Form des Somatostatins (RS) handelt es sich um das lineare Tetradecapeptid der Formel II:

SH SH

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

(II) 909844/0950

ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

Die reduzierte Form (II) wurde durch Total synthese hergestellt /Vgl. Rivier et al, C.R.Acad.Sci .Ser .p.Sci.Natur.(Paris) 276, 2737 (1973) und Sarantakis und McKinley, Biochem. and Biophys. Res.Communications 5±, 234 (1973)J7. Die Form (II) kann durch Oxidation in das Somatostatin (I) überführt werden, wobei zwischen den zwei SuIfhydrylgruppen der zwei im Tetradecapeptid enthaltenen Cysteinylaminosäurereste eine Brückenbindung gebildet wird.

Es wurden verschiedene Polypeptide synthetisch hergestellt und in der chemischen Literatur beschrieben, die als strukturelle Modifikationen des Somatostatins aufgefaßt werden können. Derartige Polypeptide haben mit dem Somatostatin bestimmte Struk-j turmerkmale gemeinsam und unterscheiden sich vom Somatostatin dadurch, daß spezifische Aminosäurereste oder funktionelle Gruppen, welche ursprünglich im Somatostatinmolekül vorliegen, entweder fehlen oder durch andere Aminosäurereste oder funktionelle Gruppen ersetzt sind. Die Erfindung betrifft neue synthetische, biologisch wirksame Polypeptide, die als strukturelle Modifikation des Somatostatins aufgefaßt werden können Die erfindungsgemäßen Polypeptide unterscheiden sich vom Somatostatin in folgenden Punkten:

(a) das Ala¹-Gly¹-Segment liegt entweder vor, fehlt oder ist durch Gly-Gly-Gly, Ala-D-Ala, Acetyl oder Benzoyl ersetzt;

(b) der Cys³-Rest liegt entweder vor oder ist durch einen ß-Mercaptopropionsäurerest ersetzt;

(c) der Lys -Rest ist durch Arg oder His ersetzt;

(d) der Asn⁵-Rest ist durch His, GIu, Tyr, Trp oder Phe ersetzt; und

(e) der Trp⁸-Rest liegt entweder vor oder ist durch D-Trp

oder 6-F-D-Trp ersetzt;

S0S8U/095Ö

ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

1 "3

(f) der Ser -Rest ist durch eine D-oc-Aminosäure ersetzt; und

(g) der Cys -Rest liegt entweder vor oder ist durch D-Cys ersetzt.

Rivier et al, J.Med.Chem. 18, 123 (1975) beschreibt Modifika-

— 1 2

tionen des Somatostatins, bei denen das Ala -GIy -Segment und

die N-terminale Aminogruppe fehlen. Der Ersatz des Trp -Restes durch D-Trp ist von Rivier et al, Biochem.Biophys.Res.Commun. 65, 746 (1975) diskutiert. Modifikationen des Somatostatins, bei denen das Lys-Asn -Segment durch andere Aminosäurereste ersetzt sind, sind in der BE-PS 839 405 offenbart. Eine Modi-

1 3 fikation des Somatostatins, bei der das Ser durch D-Serin ersetzt ist, wird von Coy et al, "58th Annual Meeting of the Endocrine Society", San Francisco, Californien, Abstract 305, Seite 209, beschrieben. Ein D-Trp⁸, D-Cys¹⁴-Somatostatin ist von Brown et al, Science J_9£, 1467 (1977) und Meyer, Biochem. Biophys.Res.Commun. 21» ⁶³⁰ (1977) beschrieben. j

Die Erfindung umfaßt Peptide der allgemeinen Formel III:

S — S

I I

CH₂ CH₂

X-CHCO-X₁ -Xg-Phe-Phe-Xg-Lys-Thr-Phe-Thr-X^NH-CH-COOH

(III)

worin:

X für H, -NH₂, -NH-Gly-Ala, -NH-D-Ala-Ala, -NH-Gly-Gly-Giy, -NH-Acetyl oder -NH-Benzoyl steht;

X_I die Bedeutungen His oder Arg besitzt; X₂ für His, GIu, Tyr, Trp oder Phe steht; X₃ für Trp, D-Trp oder 6-F-D-Trp steht; und

909844/0950

ORIGINAL IWSPECTED

M/20 091 - 9 -

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X- eine D-itf-Aminosäure darstellt;

sowie deren nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.

Die Erfindung umfaßt auch die lineare Form der Verbindungen der Formel III (d.h. die nicht cyclischen, reduzierten Verbindungen der Formel IV, die insofern unterschiedlich sind, als sie zwei freie SuIfhydrylgruppen enthalten), sowie deren nicht-toxische Säureadditionssalze. Die Formel IV ist folgendermaßen:

SH SH

CH₉ CH₂

X-CHCO-X₁ -Xg-Phe-Phe^-Lys-Thr-Phe-Thr-X^NH-CH-COOH

(IV)

Die linearen Peptide der Formel IV sind die Prekursoren für j die cyclischen Peptide der Formel III. :

Sämtliche optisch aktiven Aminosäuren und Aminosäurereste in j den hier dargestellten und beschriebenen Polypeptiden liegen in der natürlichen oder L-Konfiguration vor, falls nicht anders angegeben. Die Symbole, welche die Aminosäuren und Aminosäure- J reste in den hier beschriebenen Polypeptiden bezeichnen sind j vom IUPAC-IVB Committee on Biochemical Nomenclature Recommen- ] dation (1971) anerkannt und in den Archives of Biochemistry and Biophysics J_5£, 1-8 (1972) beschrieben. Das Symbol "6-F-D-Trp" bedeutet D-Tryptophan, worin die 6-Position durch Fluor substituiert ist. Der Begriff "D-tf-Aminösäure" steht für eine optisch aktive ^-Aminosäure, in der das ^-Kohlenstoffatom in der D-Konfiguration vorliegt. Bevorzugte Beispiele für derartige D-oC-Aminosäuren sind D-Prolin, D-Alanin, D-VaI in, D-Leucin, D-Isoleucin, D-Serin, D-Threonin, D-Methionin, D-Asparaginsäure,

§09844/0

ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

D-Glutaminsäure, D-Lysin, D-Arginin, D-Asparagin, D-Histidin, D-Tryptophan, D-Phenylalanin und D-Tyrosin.

Dem Fachmann ist bekannt, daß das ^-Kohlenstoffatom der Cysteinreste (entsprechend Cys und Cys des Somatostatins) ein asymmetrisches Kohlenstoffatom ist, so daß optische Isomere derartiger Aminosäurereste möglich sind. Der in den hier beschriebenen Formeln (III, IV oder V) bezeichnete Cys -Rest der dort beschriebenen Peptide muß in der natürlichen (L-) Konfiguration vorliegen, wogegen der Cys -Rest entweder in der natürlichen , (L-) oder nicht-natürlichen (D-) Konfiguration vorliegen kann.

Die Verbindungen der Formeln III und IV inhibieren die Sekretionen des Wachstumshormons, Insulins und Glucagons, was durch übliche pharmakologische Untersuchungen belegt wird. Sie sind darüber hinaus brauchbar zur Steuerung der Serumglucose bei der Behänd- ' lung von Diabetes. Die Verbindungen zeigen darüber hinaus eine j verlängerte Wirkungsdauer.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform stehen in den Verbindungen der Formeln III und IV der Rest X für NH₂, der Rest X₁ für Arg, der Rest X₂ für His, der Rest X₃ für D-Trp und der Rest X₄ für D-Tyr. Das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß dieser Ausführungsform ist in den Beispielen 1 und 2 beschrieben. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft die Verbindungen der Formeln III und IV, worin X für NH₂ steht, X₁ für Arg steht, X₂ für GIu steht, X₃ für D-Trp steht und X₄ für D-Tyr steht, wobei bei dieser Ausführungsform die Freisetzung des Wachstumshormons und des Insulins inhibiert wird, ohne daß die Freisetzung von Glucagon einer merklichen Inhibierung unterliegt. Die Herstellung dieser Ausführungsform ist in den Beispielen 3 und 4 beschrieben. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Verbindungen der Formeln III und IV, worin X für NH₂ steht, X₁ für His steht, X₂ für His steht, X₃ für D-Trp steht und X₄ für D-Ser steht.Die-

9O98U/095O

ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1 "^IDOOD

se Ausführungsform inhibiert die Freisetzung des Wachstumshormons und des Glucagons, ohne daß eine nennenswerte Inhibierung der Freisetzung des Insulins auftritt. Die Herstellung dieser Ausführungsform ist in den Beispielen 5 und 6 beschrieben. Andere Ausführungsformen können hergestellt werden, indem ähnliche Methoden oder auf der Hand liegende Modifikationen angewendet werden. Die jeweils gewünschten AusfUhrungsformen können hergestellt werden, indem man unter Anwendung der erläuterten Arbeitstechnik eine bestimmte Einheit durch die ge- ; wünschte, geschützte Aminosäure ersetzt. ;

Die erfindungsgemäßen Polypeptide werden nach der Festphasenmethode hergestellt, wobei man die allgemein auf dem Fachge- [ biet bekannte Arbeitsweise zum Aufbau einer Aminosäuresequenz . aus einer anfänglichen, von einem Harz getragenen C-terminalen ι Aminosäure befolgt. Diese Arbeitstechniken sind von J.M.Stewart; et al, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman and Co., i San Francisco, 1969, beschrieben. Bei der Anwendung dieser Synthese auf die Polypeptide der Formeln III und IV handelt es sich bei der anfänglichen C-terminalen Aminosäure um L- oder D-Cystein, und beim Harzträger vorzugsweise um ein chlor- j methyliertes Polystyrolharz. Die Chlormethyl gruppen stellen Verknüpfungspunkte für das L- oder D-Cystein am Harzträger über eine Esterbildung dar.

Zur Durchführung der Synthese wird das chlormethylierte Polystyrolharz mit D- und L-Cystein, das an der o(-Aminogruppe und an der SuIfhydrylgruppe geschützt ist (vgl. Boc-Cys(SMBzl)-OH) nach der Arbeitsweise von Gisin, HeIv. Chim. Acta., 56, 1476 (1973) verestert. Die geschützte Aminosäure wird durch Esterbildung zwischen der Carboxylgruppe des L- oder D-Cysteins und einer Chlormethylgruppe des Harzes verknüpft. Dann wird die tf-Aminoschutzgruppe mit Trifluoressigsaure in Methylenchlorid, Trifluoressigsaure alleine oder Chlorwasserstoffsäure in Dioxan, entfernt. Das Entschützen wird bei einer Temperatur

8098U/0950

ORIGINAL !NSPECTi=D '

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zwischen ungefähr 0⁰C und Raumtemperatur durchgeführt. Man kann auch andere übliche Spaltungsmittel und Spaltungsbedingungen zur Entfernung einer spezifischen ίγ-Aminoschutzgruppe anwenden, vgl. Schröder und E. LUbke "The Peptides" J_, 72-75 (Academic Press, 1965). Nach dem Entfernen der tf-Aminoschutzgruppe werden die nachfolgenden, geschützten Aminosäuren einzeln seriatim an der vom Harz getragenen Sequenz angekuppelt. Alternativ kann man durch die Lösungsmethode kleine Peptidfragmente herstellen und in der gewünschten Reihenfolge in den Festphasenreaktor einführen. Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in einem ungefähr 4-fachen Überschuß j in den Festphasenreaktor eingeführt. Das Kuppeln wird in Dimethylformamid, Methylenchlorid oder einer Mischung der zwei Lösungsmittel ausgeführt. Den erfolgreichen Verlauf einer jeden Kupplungsreaktion in jedem Stadium der Synthese wird j durch die Ninhydrinreaktion bestätigt, wie von E. Kaiser et al J Analyt.Biochem. 34, 595 (1970) beschrieben. Falls eine unvoll- ί

ι ständige Kupplung erfolgt ist, wird diese Reaktion wiederholt, bevor die oC-Aminoschutzgruppe zur Einführung der nächsten Aminosäuresequenz entfernt wird. Ein bevorzugtes Kupplungsmittel ist das Diisopropylcarbodiimid, obgleich auch andere Mittel dem Fachmann zur Verfügung stehen.

Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz synthetisiert wurde, entfernt man das Polypeptid vom Harzträger durch Behandlung mit Fluorwasserstoff und Anisol, um das vollständige entschützte, lineare Polypeptid zu erhalten. Das cyclische Disulfid wird hergestellt, indem man das lineare Polypeptid oxidiert, beispielsweise durch Behandlung mit K₄Fe(CN)₆ oder durch Kontakt mit der Luft.

Nicht-toxische Säureadditionssalze derlinearen und cyclischen Polypeptide werden auf übliche Weise aus organischen oder anorganischen Säuren, die nicht-toxisch und für pharmazeutisch Zwecke annehmbar sind, hergestellt. Hierzu gehören Chlorwasser

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ORIGfNAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

stoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Polyphosphorsäuren Maleinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure, Malonsäure oder Ascorbinsäure, und dergleichen.

Die während der Festphasensynthese eingesetzten Schutzgruppen sind als solche bekannt. Bei der Wahl einer bestimmten Seitenkettenschutzgruppe zur Synthese der erfindungsgemäßen Peptide sollten die folgenden Regeln beachtet werden: (a) die Seitenkettenschutzgruppe muß gegenüber dem Reagens und den bei jeder . Stufe der Synthese gewählten Reaktionsbedingungen zur Ent- J fernung der tf-Aminoschutzgruppe stabil sein; (b) die Schutzgruppe muß ihre schützenden Eigenschaften beibehalten (d.h. sie darf unter den Kupplungsbedingungen nicht abgespalten werden); und (c) die Seitenkettenschutzgruppe muß nach Beendigung _: der Synthese mit der gewünschten Aminosäuresequenz unter Reaktionsbedingungen abspaltbar sein, die nicht zu einer Ver- _; änderung der Peptidkette führen. ί

Zu bevorzugten Schutzgruppen für die bei der Festphasensynthese eingesetzten Aminosäuren gehören die folgenden: (a) für eine j o<-Aminogruppe: tert.-Butyloxycarbonyl (BOC); (b) für eine Sei- j tenkettenhydroxylgruppe: Benzyl (BzI); (c) für eine aromati- j sehe Hydroxylgruppe in der Seitenkette: 2,6-Dichlorbenzyl (Cl₂BzI); (d) für eine Seitenkettencarboxylgruppe: Benzyl (BzDj; (e) für eine Seitenketten-ü-aminogruppe: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl (ClZ); (f) für Guanidinstickstoffatome in der Seitenkette: Tosyl (Tos); (g) für den sekundären Imidazolstickstoff: Tosyl (Tos); und (h) für eine Seitenkettenmercaptogruppe: p-Methoxybenzyl (MBzI).

Außer den pharmakologisch wirksamen Polypeptiden der Formeln III und IV umfaßt die Erfindung auch die neuen Peptidharz-Zwischenprodukte der Formel V:

8098U/095Q

ORIGIfNTÄlrtNSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1 ^oiu^ou

S-Z
I

CH₉ I * Y-CHCO-Y₁ -Y₂-Phe-Phe-X₃-Y₃-Y₄-PlIe-Y_{4 Q}

Y₁- -NH-CHCO-CH₉ZToIyS tyrolharz^

D I ^C

CH₀ I ² S-Z

(V)

worin:

(a) Χ, für Trp, D-Trp oder 6-F-D-Trp steht;

(b) Y die Bedeutungen H, -NH(R), -NH-GIy-AIa(R), -NH-Gly-Gly-Gly(R), -NH-D-AIa-AIa(R), -NH-Acetyl oder -NH-Benzoyl besitzt;

(c) Y₁ für HiS(R₁) oder ArgiR^ steht;

(d) Y₂ die Bedeutungen HiS(R₁), GIu(R₂), Tyr(R₃), Trp oder Phe besitzt;

(e) Y₃ für Lys(R₄) steht;

(f) Y₄ für Thr(R₅) steht;

(g) Y₅ die Bedeutungen D-Pro, D-AIa, D-VaI, D-Leu, D-isoLeu, D-Ser(R₅), D-TtIr(R₅), D-Asp(R₂), D-GIu(R₂), D-LyS(R₄), D-A^(R₁), D-Asn, D-HiS(R₁), D-Trp, D-Phe oder D-TyKR₃) besitzt; und

(h) Z für die p-Methoxybenzylschutzgruppe steht; wobei R eine (X-Aminoschutzgruppe darstellt und R, _t R₂, R₃, R₄ und Rg jeweils unabhängig voneinander eine Seitenkettenschutzgruppe bedeuten.

Bevorzugte Schutzgruppen sind diejenigen, in denen: R für tert.-Butyloxycarbonyl steht;

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ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

R,. für Tosyl steht; R₂ die Bedeutung Benzyl(ester) besitzt; R₃ für 2,6-Dichlorbenzyl steht; . R₄ für 2-Chlorbenzoyloxycarbonyl steht; und R₅ die Bedeutung Benzyl(äther) besitzt.

Bei den Verbindungen der allgemeinen Formel V kann es sich beim Polystyrolharz um jeglichen geeigneten Harzträger handeln, der üblicherweise auf dem Gebiet der Festphasensynthese von Polypeptiden eingesetzt wird, vorzugsweise um Polystyrol, das mit ungefähr 0,5 bis 3 % Divinylbenzol vernetzt ist und das chlor- _; methyliert oder hydroxymethyliert ist, um Stellen für die Esterbildung mit dem anfänglich eingeführten, cx-Amino-geschützten D- oder L-Cystein zu schaffen. Ein chiormethyliertes Polystyrolharz ist von Bio Rad Laboratories, Richmond, Californien im Handel erhältlich, und die Herstellung dieses Harzes ist von : Stewart et al, "Solid Phase Peptide Synthesis", Freeman and Co., San Francisco, 1969, Kapitel 1, Seiten 1 bis 6, beschrie- ! ben. In der Formel V steht der Rest "-C-O-CH₉-" für die Ester- j

Il £

ο j

bindung zwischen der C-terminalen Carboxygruppe des Polypeptids■ und einer der vielen, ursprünglich in die Phenyleinheiten der j Polystyrol kette durch Chlormethyl ierungen eingeführten Methylen-· gruppen.

Die erfindungsgemäß beschriebenen Verbindungen können an Sauger intravenös, subkutan, intramuskulär oder oral verabreicht werden, um bei der Behandlung von Diabetes oder Hyperinsulinämie den Serumglucosespiegel zu steuern. Die erforderliche Dosis variiert mit dem jeweils zu behandelnden Zustand, der Schwere des Zustands und der Dauer der Behandlung.

Der aktive Bestandteil wird alleine oder in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Bindemitteln verab-

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reicht. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen können vom Fachmann ohne weiteres formuliert werden.

Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen und deren Verwendung sind in den nachfolgenden Beispielen erläutert:

B e i s pie!

tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^g-tosyl L-arginyl-N^im-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl D-tryptophyl-N^£-2-chi orbenzyl oxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-0-2,6-dichlorbenzyl D-tyrosyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl -hydroxymethyl-PoIystyrolester

Nach der Arbeitsweise von Gisin, HeIv. Chim. Acta-, 56>, 1976 (1973) wird ein chlormethyliertes Polystyrolharz (Lab Systems IncJ (0,75 mÄq pro g) mit Boc-Cys(SMBzl )-OH-Cäsiumsalz verestert. Dann wird das Aminosäureharz nach dem Schema A (nachstehend aufgeführt) behandelt, wobei man in der Stufe 9) Boc-D-Tyr(Cl₂Bzl )-0H als geschlitzte Aminosäure einsetzt. Dann wird Schema A so oft wie erforderlich wiederholt, um der Reihe nach die nachfolgenden Aminosäuren in das Peptidharz einzuführen:

Boc-Thr(Bzl)-OH

Boc-Phe-OH

Boc-Thr(Bzl)-OH

Boc-Lys(ClZ)-OH

Boc-D-Trp-OH

Boc-Phe-OH

Boc-His(Tos)-OH

Boc-Arg(Tos)-OH

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ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

Boc-Cys(SMBzl)-OH

Schema A: /Arbeitsvorschrift für das Entschützen der G gruppe und das Kuppeln der geschlitzten w-Aminosäuren an dem Boc-Cys(SMBzl)-O-CHg-(geschütztes Harz)7·

1) Man wäscht dreimal mit Methylenchlorid (CH₂Cl₂).

2) Man behandelt 5 Minuten lang mit Trif1uoressigsäure:Methylenchlorid 9:1(Vol/Vol) mit einem Gehalt von'5' % 1 ,2-Äthandithiol.

3) Man wiederholt 25 Minuten lang die Arbeitsweise der Stufe 2),

4) Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.

5) Man wäscht mit Dimethylformamid (DMF). j

6) Man behandelt 3 Minuten lang mit 12 % Triethylamin in DMF.

7) Man wäscht mit DMF.

8) Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂.

9) Man behandelt mit vier Äquivalenten der entsprechenden geschützten Aminosäure in CH₂Cl₂/DMF und rührt 5 Minuten lang.

10) Im Verlauf von 30 Minuten gibt man in zwei Portionen fünf Äquivalente Diisopropylcarbodiimid, gelöst in CH₂Cl₂, zu. Man läßt die Reaktion 6 Stunden lang erfolgen.

11) Man wäscht dreimal mit DMF.

12) Man wäscht dreimal mit CH?C1_?.

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- ..ORIGINAL INSPECTED

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j 13) Man untersucht nach der Arbeitsweise von Kaiser et al, Annal .Biochem. ,34·, 595 (1970) mit Hilfe der Ninhydrin-Reak tion. Im Falle einer unvollständigen Reaktion werden die Stufen 9) bis 13), wie oben beschrieben, wiederholt.

Beispiel

L-Cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl -D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-D- tyrosyl-L-cystein cyclisches (1->12) Disulfid

Eine Mischung von 12 g des Peptidoharzes gemäß Beispiel 1, 20 ml Anisol und 200 ml flüssiger Fluorwasserstoff wird 50 Minuten lang in einem Eisbad (unter Luftausschluß) stehengelassen und anschließend wird überschüssiger Fluorwasserstoff im Vakuum entfernt. Man extrahiert den Rückstand mit 20 %-iger wäßriger Essigsäure und gießt den Extrakt in 5 Liter entlüftetes Wasser. Man bringt den pH des Wassers durch Zugabe von verdünntem Ammoniumhydroxid auf 7,4 und oxidiert die Mischung durch Zugabe einer Lösung von 1,5 g K₃Fe(CN)₅ in 500 ml Wasser. Die Oxida- '. tionsmischung wird mit Eisessig auf pH 5 angesäuert, und über- j schüssiges Oxidationsmittel wird durch Zugabe von Bio Rad AG 3 : entfernt. Man absorbiert das peptidische Material auf Amber- : lite CG-50 (H⁺-Form) und eluiert dann mit einer Mischung aus i Wasser:Essigsäure:Pyridin 66:4:30 (Vol/Vol). Die das peptidische, Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophili- j siert, wobei man Rohprodukt erhält, das auf eine Säule mit Sephadex G-25 (2,5 χ 160 cm) aufgegeben und mit 10 %-iger wäßriger Essigsäure eluiert wird. Die Fraktionen 113 bis 133 werden gesammelt und lyophilisiert, wobei man 855 mg des gewünschten Peptids erhält.

TLC (Dünnschichtchromatographie): Mit Avicel überzogene Glasplatten, Chlorox-Spray R_f n-Butanol:Wasser:Eisessig 4:1:1

909844/0950

ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

(Vol/Vol) 0,41.

Aminosäureanalyse: Thr (2) 1,87; Phe (3) 3; Cys (2) 1,49;

Tyr (1) 0,87; Lys (1) 1,02; His (1) 0,89;

Arg (1) 1,01 ; Trp (1) 0,67.

Beispiel

tert.-Butyl oxycarbonyl-S-ρ-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N⁹-tosyl-L-j arginyl-/'-benzyl -L-glutamyl -L-phenylalanyl -L-phenylalanyl-D- j tryptophyl-Φ-2-chlorbenzyl oxycarbonyl-L-Iysy!-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-0-2,6-dichiorbenzyl-D-tyrosyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-hydroxymethyl-Polystyrol -ester '.

Das obige Peptidoharz wird auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 , hergestellt, wobei im Zuge der Synthese an entsprechender Stelle die entsprechende Aminosäure ersetzt wird. I

Beispiel 4

L-Cysteinyl-L-arginyl-L-«-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyi-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cystein cyclisches (1—»12) Disulfid-Triacetatsalz

Das obige Dodecapeptid wird auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 aus dem Peptidoharz des Beispiels 3 hergestellt.

TLC: Mit Avicel vorbeschichtete Glasplatten.

R_f n-Butanol:Wasser:Eisessig 4:1:1 (Vol/Vol) 0,57

S098-U/09B0

ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

R_f n-Butanol:Äthylacetat:Wasser:Eisessig 1:1:1:1 (Vol/Vol) 0,85 R_f tert.-Amylalkohol:Pyridin:Wasser 7:7:6 (Vol/Vol) 0,92.

Aminosäureanalyse: Thr (2) 1,96; GIu (1) 1,04; Cys (2) 1,79;

Tyr (1) 1,02; Phe (3) 3; Lys (1) 1,04;
Trp (1) 1,09; Arg (1) 1,01.

Beispiel 5

tert.-Butyloxycarbonyl -S-p-methoxybenzyl -L-Cysteinyl -N^1tn-tosyl L-histidyl-N^im-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N* -2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenyl al any!-0-benzyl-L-threonyl-0-benzyl-D-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-hydroxymethyl -Polystyrolester

Das obige Peptidoharz wird auf gleiche Weise wie im Beispiel 1
beschrieben hergestellt, wobei im Zuge der Synthese an entspre-j chender Stelle die entsprechende Aminosäure ersetzt wird. ;

Beispiel

L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenyl alanyl -L-threonyl-D-seryl-L-cystein cyclisches (1—>12) Disulf id-Triacetatsalz :_

Man behandelt das Peptidoharz des vorstehenden Beispiels 5

auf gleiche Weise wie im Beispiel 2, wobei man die Titelverbin-j dung erhält.

TLC: Mit Silikagel vorbeschichtete Glasplatten.

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ORIGINAL INSFECTBD

AHP-7272/7272-1-C1 ^tJ ' ^JJU

R_f n-Butanol:Äthylacetat:Wasser:Eisessig 1:1:1:1 (Vol/Vol) 0,52.

Mit Avicel vorbeschichtete Glasplatten.

R_f n-Butanol:WasserrEisessig 4:5:1 (Vol/Vol) 0,60.

R_f tert.-Amylalkohol:Pyridin:Wasser 7:7:6 (Vol/Vol) 0,76.

Aminosäureanalyse: Thr (2) 1,98; Ser (1) 0,98; Cys (2) 1,64;

Phe (3) 3; Lys (1) 1,1; His (2) 2,1; Trp (1) 0,84.

B e i spiel 7

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Sekretioneji des Wachstumshormons, Insulins und Glucagons zu inhibieren, läßt sich anhand der folgenden Untersuchungsmethodik demonstrieren:

Männliche Albinoratten werden in zwei Gruppen (d.h. 9 Ratten pro Gruppe) aufgeteilt. Jedem Tier wird Natriumpentobarbital (Nembutal )i.p. in einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht. 15 Minuten später erhält eine Gruppe eine, s .c. -Injektion der Testverbindung in Kochsalzlösung (typisch 5 bis 200 ug/kg), und die andere Gruppe (Kontrolle) erhält die Kochsalzlösung ohne die Verbindungen. 10 Minuten später wird jedem Tier eine 0,5 ml Injektion Arginin (300 mg/ml, pH 7,2) in das Herz verabreicht. 5 Minuten nach der Aufnahme des Arginins werden die Tiere geköpft und das Blut in Trasylol-EDTA gesammelt. Entsprechende aliquote Anteile einer jeden Probe werden auf GH, Glucagon und Insulin durch Radioimmunoassay untersucht. Das GH wird nach der Methode von Sinha et al, Endocrinol. 9JU 784 (1972) bestimmt. Das Glucagon wird nach der Methode von Faloona und Ungei}, "Möthods of Hormone Radioimmunoassay'¹, Jaffe et al, Ed. _s

Ö098U/095Q

ORDINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1 *~^Ό ID3OD

Academic Press, New York, 1974, Seiten 317 bis 330 bestimmt. Das Insulin wird nach der Methode von Hales und Rändle, Biochem.J. 88^, 137 (1963) bestimmt. Die Blutkonzentrationen an Wachstumshormon, Glucagon und Insulin der Tiere, denen die Testverbindung verabreicht wurde, werden nach Üblichen statist! sehen Methoden mit den Blutkonzentrationen der Kontrollgruppe verglichen. Die Inhibierung ergibt sich als signifikante Abnahme der Hormonkonzentration. '

1 Die Ergebnisse der Untersuchung der Peptide der Beispiele 2, 4 und 6 sind nachstehend aufgeführt.

Experi- Verbindung Dosis GH Insulin Glucagon

ment (ug/kg) (ng/kg) uU/ml (pg/ml

A Kontrolle — 508 +_ 13 298 +_ 33 61^8

Beispiel 2 100 181 +_ 47⁺ 154 ± 39⁺ 22 + 7*

B Kontrolle

Beispiel 2 400

E Kontrolle —

Beispiel 4 200

F Kontrolle —

Beispiel 6 100

234	+ 36	187	+ 21	41	+ 5
67	+ 13*	70	+ 23*	9	+ 1*
354	± ⁵⁷	336	±³¹	62	+ 10
81	+_ 6*	128	+_ 33*	41	+ 14
363	± ⁷⁴	75	+ 8	162	± 29
83	+ 16*	60	+ 10	55	+ 12*

* = p<C0,01

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen zur prolongierten Inhibierung des Wachstumshormons läßt sich durch die nachfolgende Untersuchungsmethodik demonstrieren:

909844/0950

ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1

Männliche Albinoratten wurden in zwei Gruppen (9 Ratten pro Gruppe) aufgeteilt. Eine Gruppe erhielt eine subkutane (s.c.) Injektion der Testverbindung (typisch 1 mg/kg) in Kochsalzlösung, und die andere Gruppe erhielt eine s .c.-Injektion der Kochsalzlösung ohne Verbindung (Kontrolle). 20 Minuten vor dem Ende der Testperiode (2 bis 4 Stunden nach der Injektion) wurde jedem Tier eine i.p.-Injektion Natriumpentobarbital zu 50 mg/kg verabreicht. Am Ende des Experiments wurden jedem Tier durch Herzpunktur Blutproben entnommen, und jede Probe wurde mit Trasylol-EDTA vermischt. Ein aliquoter Anteil jeder Probe wurde durch Radioimmunoassay auf GH untersucht. Die Wachstumshormonkonzentra tionen im Blut der Tiere, die mit der Testverbindung behandelt wurden, wurden durch übliche statistische Methoden mit den Wachstumshormonkonzentrationen bei den Kontroll tieren verglichen. Als lange wirksam klassifizierte Verbindungen ergaben bei einer ■ Dosis von 1 mg/kg nach der Injektion mindestens 2 Stunden lang i eine signifikante Abnahme der Wachstumshormonkonzentration im j Blut.

Bei der Untersuchung nach der vorstehend beschriebenen Testmethodik ergab die Verbindung des Beispiels 2 die folgenden Testergebnisse:

909844/0960

ORlGtNAL INSPECTED

M/20 091
AHP-7272/7272-1-C1

Experiment	Verbindung	Dosis (pg/kg)	Zeit (Std.)	Pia (n	sma GH g/ml)
C	Kontrolle		2	213	+ 14
	Beispiel 2	1000	2	89	+ 5**
	Kontrolle	--	4	182	± ¹²
	Beispiel 2	1000	4	101	+ 13**
D	Kontrolle	—	5	337	+_ 36
	Beispiel 2	1000	Lf)	230	± ^{31 +}
	Kontrolle	—	6	234	+ 24
	Beispiel 2	1000	6	172	+_ 34
"* = ρ <O₉OOI
^h = p<0_s05

Die Ergebnisse belegen, daß die Verbindung des Beispiels 2 eine prolongierte Inhibierung des Wachstumshormons ergibt.

21/V.

909844/095Q

ORIGINAL INSPECTED

Claims

AHP-7272/7272-1-C1

Patentansprüche

.\ Verbindungen der allgemeinen Formeln III und IV:

CH₉ CH₉

I ² I ²

X-CHCO-X₁ -X₂-PHe -Pne-Xg-Lys-Thr-Phe-Thr-X^NH-CH-COOH

(III) und

SH SH

I I

CH₉ CH₉

I ² I ²

X-CHCO-X₁ -Xg-Phe-Phe-Xg-Lys-Thr-Phe-Thr-X^NH-CH-COOH

worin:

X für H₉ -NH₂, -NH-Gly-Ala, -NH-D-Ala-Ala, -NH-Gly-Gly-Gly, -NH-Acetyl oder -NH-Benzoyl steht;

X_I die Bedeutungen His oder Arg besitzt;
X₂ für His, GIu, Tyr, Trp oder Phe steht;
X₃ für Trp, D-Trp oder 6-F-D-Trp steht; und
X- eine D-Ä-Aminosäure darstellt;

sowie deren nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.

9098ΑΑ/Π950

OR(GiJSlAL INSPECTED

m/20 091 - sr- 291653R

AHP-7272/7272-1-C1 ^ ³°°

2. L-Cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl -L-phenylalanyl-L-phenyl -al any!-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cystein cyclisches (1—>12) Disulfid.

3. L-Cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenyl -alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cystein.

4. L-Cysteinyl-L-arginyl-L-tf-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl -D-tryptophyl -L*-Iysy! -L-threonyl -L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cystein cyclisches (1—>12) Disulfid.

5. L-Cysteinyl -L-arginyl '-L-tf-glutamyl -L-phenylalanyl -L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-D-tyrosyl-L-cystein.

6. L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenyl-^: alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-D-seryl-L-cystein cyclisches (1—»12) Disulfid.

7. L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl -D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl -L-phenylalanyl-L-threonyl-D-seryl-L-cystein.

S-Z
I

CH₉
²

rz der allgemei nen Forme! V: -NH-CHCO-CH,
CH₉
I ^Z
S-Z ,-,,-PH.-,-«, "Ϊ⁴
Y₅ 30984 09S0 ,/"Polystyrol (V)

ORIGINAL INSPECTED

worin:

(a) X₃ fur Trp, D-Trp oder 6-F-D-Trp steht;

(b) Y die Bedeutungen H, -NH(R), -NH-GIy-AIa(R), -NH-GIy-GIy-GIy(R), -NH-D-AIa-AIa(R), -NH-Acetyl oder -NH-Benzoyl besitzt;

(c) Y₁ für HiS(R₁) oder ArgfR^ steht;

(d) Y₂ die Bedeutungen HiS(R₁), GIu(R₂), TyKR₃), Trp oder Phe besitzt;

(e) Y₃ für LyS(R₄) steht; !

(f) Y₄ für Thr(R₅) steht;

(g) Y₅ die Bedeutungen D-Pro, D-AIa, D-VaI, D-Leu, D-isoLeu, D-Ser(R₅), D-Thr(R₅), D-Asp(R₂), D-GIu(R₂), D-Lys(R₄)i D-Arg(R,,), D-Asn, D-HiS(R₁), D-Trp, D-Phe oder D-TyKR₃) besitzt; und ;

(h) Z für die p-Methoxybenzylschutzgruppe steht, wobei R eine o<-Aminoschutzgruppe darstellt und R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ jeweils unabhängig voneinander eine Seitenketten-Schutzgruppe bedeuten.

9. Peptidharz nach Anspruch 8, worin: !

R für t-Butyloxycarbonyl steht; :

R₁ für Tosyl steht; ^!

R₂ die Bedeutung Benzyl(ester) besitzt;

R₃ für 2,6-Dichlorbenzyl steht;

R₄ für 2-Chlorbenzoyloxycarbonyl steht; und

R₅ die Bedeutung Benzyl(äther) besitzt.

§09844/6950

ORIGINAL INSPECTED

AHP-7272/7272-1-C1 ψ

10. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel.

ORIGINAL INSPECTED