DE2826517A1

DE2826517A1 - Verfahren und vorrichtung zum messen und aufzeichnen der frequenzabhaengigkeit der kapazitaet und des leitwertes einer membran

Info

Publication number: DE2826517A1
Application number: DE19782826517
Authority: DE
Inventors: Robert Geoffrey Ashcroft; Hans Gerard Leonard Coster; John Robert Smith
Original assignee: Unisearch Ltd
Current assignee: Unisearch Ltd
Priority date: 1977-06-17
Filing date: 1978-06-16
Publication date: 1979-01-04
Also published as: DE2826517C2; CH640058A5; JPS6045823B2; US4214203A; JPS5439694A

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. M. "Weickmanh, Dii-l.-Phys. Dr. K.Fincke

Dipl.-Ing. F. A.¥eickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. LisKA 2826517

8000 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

UNISEARCH LIMITED

Verfahren und Vorrichtung zum Messen und Aufzeichnen der Frequenzabhängigkeit der Kapazität und des Leitwertes einer Membran "

Die Erfindung bezieht sich auf die Lokalisierung und den Einfluß von adsorbierten Chemikalien auf die dielektrische Substruktur von Membranen unter Anwendung der Ultra-Niederfrequenz-Spektroskopie. Es wurde gefunden, daß die Anwesenheit von Schichten mit unterschiedlichen dielektrischen und/ oder Leitfähigkeitseigenschaften innerhalb von Membranen, z.B. Zellmembranen oder Membranen, die aus den Bestandteilen von Zellmembranen wieder-aufgebaut wurden, eine Frequenzabhängigkeit der Gesamtkapazität und des Gesamtleitwertes zur Folge hat. Diese Frequenzdispersion der Kapazität und des Leitwertes tritt bei diesen Membrenen innerhalb eines Frequenzbereiches von 0,001 bis etwa 1000 Hz auf.

Unter "Membranen" werden Trennschichten oder -wände verstanden, an denen die zu lokalisierenden Chemikalien adsorbiert sind, z.B. biologische Zeil- oder Gewebemembranen (ein-

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schließlich Membranen, die aus den Bestandteilen von Zellmembranen hergestellt wurden), sowie polymere Membranen, z.B. permeable zellförmige Polyamid-MehrSchichtenmembranen.

Die Messung der Frequenzabhängigkeit der Membrankapazität und -leitfähigkeit über einen genügend großen Frequenzbereich bei den genannten sehr niedrigen Frequenzen ermöglicht daher die Bestimmung der einzelnen dielektrischen und Leitfähigkeitsparameter jener Substrukturschichten innerhalb dieser Membranen, die deutlich unterschiedliche Zeitkonstanten aufweisen. Jede derartige Schicht innerhalb der Membran hebt sich bei der graphischen Darstellung der Frequenzabhängigkeit von Kapazität und Leitwert deutlich ab.

Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen und Aufzeichnen der Frequenzabhängigkeif der Gesamtkapazität und des Gesamtleitwertes einer Membran, z.B. einer bimolekularen Lipid- oder Proteinmembran, bei einer Mehrzahl von Frequenzen im Frequenzbereich von 0,001 bis etwa 1000 Hz, die gekennzeichnet ist durch eine Einrichtung zum Tragen bzw. Halten der Membran in einem Elektrolyten, in dem Elektrolyten angeordnete Elektroden zum Durchleiten eines Wechselstroms durch die Membran/ eine Einrichtung zum Erzeugen einer Wechselspannung mit beliebiger Frequenz innerhalb des genannten Bereiches, und zum Anlegen dieser Spannung an die Elektroden sowie eine Einrichtung zum Messen der Gesamtkapazität und des Gesamtleitwertes der Membran bei jeder der Frequenzen in dem genannten Bereich und zu deren Aufzeichnung.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zum Messen und Aufzeichnen der Frequenzabhangigkeit der Gesamtkapazität und des Gesamtleitwertes einer Membran, z.B. einer bimolekularen Lipid- oder Proteinmembran, bei einer Mehrzahl von Frequenzen innerhalb des Frequenzbereiches von 0,001 bis etwa 1000 Hz, das dadurch gekennzeichnet ist/ daß man eine Membran der gewünschten Zusammensetzung herstellt, einen elektrischen Wechselstrom nacheinander bei den jeweiligen Frequenzen inner-

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halb des genannten Bereiches durch die in einen Elektrolyten eingetauchte Membran leitet und die Gesamtkapazität und den Gesamtleitwert der Membran bei den jeweiligen Frequenzen mißt und aufzeichnet. In einer weiteren Ausführungsform dieses Verfahrens wird eine Substanz, deren Wirkung untersucht werden soll, in die Membran eingebaut, indem man sie dem Elektrolyten oder gegebenenfalls dem Gemisch zusetzt, aus dem die Membran hergestellt wird.

In der Zeichnung ist die Erfindung anhand bevorzugter Ausführungsformen näher erläutert. Es zeigeni

Fig. 1 einen vereinfachten schematischen Aufbau einer bimolekularen Lipidmembran;

Fig. 2 Kurven, die die Frequenzabhängigkeit der Kapazität und des Leitwertes einer derartigen Membran erläutern und sich auf eine Lecithin/Cholesterin-Membran beziehen, die in 1 mM KCl in Abwesenheit anderer Chemikalien untersucht worden ist. Einige Additive ändern G„ und C„ derart, daß die Rolle der Carbonyl- und Estersauerstoffbereiche sowie der Kohlenwasserstoffbereiche in diesem Diagramm umgekehrt werden;

Fig. 3 ein Blockschaltbild einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand einer Doppelschicht aus Phosphatidylcholin (Lecithin) naher erläutert, das ein übliches, in Zellmembranen vorhandenes Phospholipid darstellt (Phospholipide bilden den Hauptbestandteil von Zellmembranen L Ein vereinfachter schematischer Aufbau einer dera,rtigen Membran ist zusammen mit" dem äquivalenten elektrischen Schaltkreis für die verschiedenen Schichten innerhalb dieser Membran in Fig. 1 gezeigt. Die Frequenzabhängigkeit der Kapazität und des Leitwertes einer derartigen Membran in einer wäßrigen Lösung von 1 mM KCl ist in Fig. 2 wiedergegeben. Die Art und Weise, in der die verschiedenen Parameter

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(1) die Effekte von chemischen Reagentien in Membranen, die den Membranen von lebenden Zellen nahe verwandt sind, genau untersucht werden können;

(2) diese Effekte bei verschiedenen chemischen Verbindungen (Homologe oder andere) miteinander verglichen werden

können. Dies könnte die Suche nach neuen Substanzen erleichtern, die völlig neue oder gegenwirkende oder potenzierende Effekte oder andere wünschenswerte pharmakologische Eigenschaften besitzen;

(3) die Effekte von neuen Arzneistoffen auf die Substrukturschichten von Membranen können mit denen von bekannten wirksamen und klinisch angewandten Verbindungen verglichen werden. Hierdurch kann die Prüfung und klinische Einführung von neuen Arzneimitteln beschleunigt werden.

Das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung eignen sich insbesondere für das "fingerprinting" von Arzneistoffen in Körperzellen oder -geweben. Beispielsweise kann man im Falle von bewußtlosen Patienten, bei denen nicht bekannt ist, ob sie vor dem Verlust des Bewußtseins ein bestimmtes Arzneimittel oder eine chemische Substanz eingenommen haben, eine Blutprobe entnehmen, die Zellen auf ein Milipore-Filter zentrifugieren und unter Anwendung des Verfahrens und der Vorrichtung der Erfindung auf die Anwesenheit von Arzneistoffen oder anderen chemischen Substanzen prüfen.

Eine andere Anwendung der Erfindung im entgegengesetzten Sinn besteht darin, die Wirkung oder die Reaktion gegenüber einer bestimmten Chemikalie oder eines Arzneistoffes zu prüfen, d.h. zu untersuchen, ob eine bestimmte Chemikalie oder ein Arzneistoff eine schädliche oder andersartige Reaktion mit Körperzellen hervorrufen. Die Wirkung bestimmter Antibiotika hängt z,B. von der Anwesenheit bestimmter Lipide ab, was durch erfindungsgemäß durchgeführte Tests untersucht werden kann.

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der einzelnen Schichten den Verlauf dieser Dispersionskurven beeinflussen, ist in dem Diagramm angegeben.

Durch Messung der Änderungen, die bei der Adsorption von Chemikalien an der Membran in den Dispersionskurven auftreten, kann festgestellt werden, welche der Substrukturschicht(en) durch die Adsorption der chemischen Verbindung beeinflußt werden. Die spezifischen Änderungen der dielektrischen und Leitfähigkeitsparameter der betroffenen Schicht(en) ermöglichen eine weitere Charakterisierung der Wirkung der chemischen Verbindung.' Ist z.B. das Lokalanaesthetikum Benzylalkohol in der äußeren Lösung enthalten, so verursacht die Adsorption dieser Verbindung in der Membran eine Abnahme der Kapazität im Kohlenwasserstoffbereich (C„), wenn die

äußere Lösung eine niedrige Salzkonzentration aufweist (z.B. 1 inM KCl) (was auf eine Zunahme der Schichtdicke hinweist), sowie eine Zunahme des elektrischen Leitwertes (G_H) dieser Schicht.

Falls das Anaesthetikum Procain in der.Lösung enthalten ist, nimmt die Kapazität im Kohlenwasserstoffbereich zu (was auf eine Abnahme der Dicke dieser Schicht hinweist). Procain senkt ebenfalls die Kapazität im Carbonylsauerstoffbereich.

Geringe strukturelle Unterschiede von Verbindungen, die zu einer bestimmten Klasse gehören, haben entsprechende Unterschiede in den charakteristischen Effekten zur Folge, die diese Verbindungsklasse auf die Substruktur der Membran ausübt . So hat z.B. Benzocain, ein dem Procain nahe verwandtes Lokalanaesthetikum, ähnliche Effekte auf die Substruktur, jedoch ist sein Einfluß auf die Kohlenwasserstoffschicht geringer als der von Procain.

Die erfindungsgemäße Anwendung der Ultra-Niederfrequenzspektrometrie kann große Bedeutung für die pharmazeutische Industrie gewinnen, da

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c) Elektrolyt

Zum Füllen der Zelle werden KCl-Lösungen mit Konzentrationen zwischen 1 und 1000 mM verwendet. Es können jedoch gegebenenfalls auch andere Elektrolytlösungen verwendet werden. Die zu untersuchenden Reagentien werden dem Elektrolyten in der gewünschten Konzentration zugesetzt.

d) Membranlösungen

Die bevorzugte Lösung zur Herstellung der Membranen ist ein n-Tetradecan, das mit einem oder mehreren geeigneten Phospholipiden gesättigt ist, z.B. mit Lecithin, oxidiertem Cholesterin oder gemischten Lipidfraktionen, die aus den Membranen oder bestimmten Zellen oder Organellen extrahiert worden sind, z.B.Mitochondrienlipide oder Membraniipide aus menschlichen Erythrocyten. Die zu untersuchenden Reagenzien können dieser Lösung ebenfalls zugesetzt werden.

e) Membranherstellung

Die folgenden drei Methoden können zum Aufbringen der Lipidlösung über die Öffnung angewandt werden:

a) Eine Teilmenge der Lipidlösung wird mit den wenigen restlichen Haaren einer fein gestutzten Zobelhaarbürste aufgenommen und über die Öffnung gestrichen.

b) Einige Mikroliter der -Lipidlösung werden mit einer Spritze über die Öffnung verteilt/ wobei sich aus dem abgeschiedenen Film die Membran bildet.

In beiden Fällen bildet sich eine bimolekulare Membran spontan aus dem dicken Film, der anfangs über die Öffnung in der Trennwand abgeschieden wird.

c) Eine Doppelschicht wird aus zwei gegenüberliegenden Monoschichten hergestellt. Die Monoschichten werden auf wäßrigen Lösungen hergestellt, deren Oberflächen anfangs unter der Öffnung in der Trennwand liegen. Die Monoschichten werden dann in eine gegenüberliegende Stellung gebracht, indem man den Flüssigkeitsspiegel der wäßrigen

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Die Frequenzabhängigkeit der Kapazität und der Leitfähigkeit tritt bei sehr niedrigen Frequenzen im Bereich von O/OO1 bis 1000 Hz auf. Dieser Frequenzbereich wurde bisher aus technischen Gründen bei diesen Membranen noch nicht nennenswert untersucht. Aus diesem Grund war auch bisher das erfindungsgemäße Verfahren zum Lokalisieren und Bestimmen der Effekte von chemischen Verbindungen, die an diesen Membranen adsorbiert sind, nicht bekannt.

Membranmaterialien und Verfahren

a) Allgemeines

Die Membranen werden über einer Öffnung in einer Kunststofftrennwand erzeugt, die eine Kunststoffkammer, z.B. aus "Perspex" oder "Plexiglas", in zwei Kammern unterteilt. Die Kammern sind mit Elektrolytlösungen gefüllt, z.B. KCl oder NaCl, denen die zu untersuchenden Reagenzien zugesetzt werden.

Die Öffnungen der Trennwand befindet sich unter der Flüssigkeitsoberfläche/ so daß die ausgebildete Membran die . Elektrolytphasen trennt. Der Strom von den Elektroden an den Enden der beiden Kammern fließt somit durch die Membran. Der Spannungsabfall durch die Membran wird mit zwei anderen Elektroden gemessen, die mit Ausnahme ihrer Spitzen isoliert und sehr nahe an beiden Seiten der Membran in dem Elektrolyten angeordnet sind.

b) Kammern

Kunststoffblöcke, z.B. aus Perspex, werden zu einer Kammer verarbeitet, die mit Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl)-Elektroden für Strom und Spannung (die letzteren mit Ausnahme der Spitze isoliert)versehen und dann zusammengeschraubt werden, so daß sie sandwichartig eine dünne Kunststofftrennwand mit einer 1,5 bis 2,0 rom großen Öffnung in der unteren Hälfte aufweisen.

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Lösungen über die öffnung in der Trennwand erhöht.

Der Bildungsprozess der Membran, die <1O nm (0,00001 mm) dick ist, kann folgendermaßen verfolgt werden:

a) optisch: Der dicke Film reflektiert Licht; wenn jedoch die Dicke sehr viel kleiner als die Wellenlänge von sichtbarem Licht ist, erscheint er schwarz ( d.h. nicht reflektierend).

b) Kapazitätsmessung bei einer bestimmten Frequenz.

Mit dünner werdendem Film nimmt die Kapazität zu, bis eine bimolekulare Membran entstanden ist, worauf die Kapazität praktisch konstant bleibt.

Elektronische Vorrichtung

10 MHz-Rechteckimpulse aus einem Kristalloszillator werden in einen Digital-Frequenzteiler eingespeist. Die Frequenzteilung wird von einem Rechner über dessen Digital-Schnittstelle gesteuert. Eine Sinusschwingung der gewünschten Frequenz kann dann dadurch erzeugt werden, daß man aufeinanderfolgend einen Festwertspeicher (der mit einer Sinustabelle vorprogrammiert ist) in einen Digital-Analog-Wandler abliest. Die Frequenz dieses Sinus-Output kann durch Rechnersteuerung von 0,001 bis 1000 Hz variiert werden.

Der sinusförmige Strom wird an eine geeignete Standard-Impedanz und die in Reihe geschaltete Membran angelegt. Die sich über den beiden Elementen entwickelnden Spannungen liegen an zwei Differentialelektrometerverstärkern an, aus deren Ausgangssignalen von den Analog-Digital-Wandlern Stichprobenwerte gebildet werden. Die Bildung der Stichprobenwerte wird von denselben Impulsen ausgelöst, die zur Erzeugung der Sinuswelle verwendet werden, so daß die beiden Prozesse sehr eng phasengekoppelt sind. Eine gute Rauschunterdrückung wird dadurch erzielt., daß man die Bildung der

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Stichprobenwerte über mehrere Zyklen durchführt, deren Anzahl vom Rechner geregelt wird.

Die Daten aus den Analog-Digital-Wandlern werden in dem Speicher des Rechners gespeichert und unter Verwendung des Rechners nach der Methode der kleinsten Quadrate in Sinusfunktionen der geeigneten Frequenz umgerechnet. Die Amplituden und Phasenwinkel der so bestimmten Sinusfunktionen werden verwendet, um die frequenzabhängige Kapazität und den Leitwert der Membran über den genannten Frequenzbereich zu errechnen.

Sämtliche beschriebenen Operationen werden mit dem Rechner für einen vollständigen Satz von vorbestimmten Frequenzen durchgeführt. Nachdem die Messungen beendet sind, erzeugt man auf dem Bildschirm die vollständigen Dispersionskurven. Der verwendete Rechner ist ein kompakter Kleinrechner, der mit den anderen elektronischen Vorrichtungen permanent verbunden ist; vgl. Fig. 3.

Zur Messung werden vier Elektroden verwendet, zwei für den Strom und zwei davon unabhängige Elektroden zur Messung der sich durch die Membran entwickelnden Potentialdifferenz. Durch diese Vierpunktmethode werden die Effekte vermieden, die andernfalls durch die Elektroden-Lösungs-Grenzfläche bei diesen Ultra-Niederfrequenzen hervorgerufen werden und die Frequenzabhängigkeitseffekte in der Membran maskieren können. Obwohl Ag/AgCl-Elektroden bevorzugt sind, können auch andere Elektroden verwendet werden.

Die gesamte Einheit kann in ein Gehäuse von 300 χ 250 χ 300 mm eingepaßt werden.

Die Amplitudenauflösung beträgt 0,1 % und die Phasenwinkelauflösung 0,01°. Das System ermöglicht Messungen- über den Frequenzbereich von 0,001 bis 1000 Hz.

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Die Erfindung stellt somit ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung, bei denen dielektrische Messungen bei Ultra-Niederfrequenzen die Bestimmung von Parametern (Dielektrizitätskonstante, Dicke und Leitfähigkeit) ermöglichen, die charakteristisch für elektrisch voneinander verschiedene Schichten von Membranen sind, z.B. bimolekularen Lipid- oder Proteinmembranen, d.h. den Hauptkomponenten von Membranen in lebenden Zellen. Es können die Lokalisierung und die Wirkung von Chemikalien, z.B. von Narkotika, Tranquilizern, Hormonen oder anderen Substanzen von pharmakologischem und allgemein biologischem Interesse, die an diesen oder anderen Membranen adsorbiert sind, untersucht werden. Die Effekte dieser Chemikalien können, anhand ihres Einflußes auf die dielektrischen Substrukturparameter quantitativ ermittelt werden.

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Claims

Patentanwälte Dipl.-In-s. K. Wsickmanm, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke

Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H.Liska 2826517

8000 MÜNCHEN 86, DEN 1 R I · POSTFACH 860 820 ' ^0<
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MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22

Ba/ht.

UNISEARCH LIMITED

Barker Street

Kensington, New South Wales

Australien

Verfahren und Vorrichtung zum Messen und Aufzeichnen der Frequenzabhängigkeit der Kapazität und des Leitwertes einer Membran "

Patentansprüche

(O

1 .J Verfahren zum Messen und Aufzeichnen der Änderung der Gesamtkapazität und des Gesamtleitwertes einer Membran, z.B. einer bimolekularen Lipid- oder Proteinmembran, mit der Frequenz bei einer Mehrzahl von Frequenzen im Frequenzbereich von 0,001 bis etwa 1000 Hz, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Membran der gewünschten Zusammensetzung herstellt, einen elektrischen Wechselstrom nacheinander bei jeder der Frequenzen in dem genannten Bereich durch die in einen Elektrolyten eingetauchte Membran leitet und die Gesamtkapazität sowie den Gesamtleitwert der Membran bei jeder der Frequenzen mißt und aufzeichnet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die beschriebene Weise eine adsorbierte chemische Substanz lokalisiert und/oder nachweist.

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3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die beschriebene Weise die Wirkung einer adsorbierten chemischen Substanz mißt.
4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 3, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zum Halten einer Membran in einem Elektrolyten, in dem Elektrolyten angeordnete Elektroden zum Durchleiten eines Wechselstroms durch die Membran, eine Einrichtung zum Erzeugen einer Wechselstromspannung von beliebiger Frequenz innerhalb des Bereiches von 0,001 bis etwa 1000 Hz und zum Anlegen dieser Spannung an die Elektroden sowie eine Einrichtung zum Messen der Gesamtkapazität und des Gesamtleitwertes der Membran bei jeder der Frequenzen in diesem Bereich sowie zu deren Aufzeichnung.

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